呈現(xiàn)dna大分子供于分析的系統(tǒng)和方法
【專利摘要】提供呈現(xiàn)核酸分子供于分析的系統(tǒng)和方法。所述核酸分子具有包含在納米縫中的中部。所述納米縫包含離子緩沖劑。核酸分子具有大于所述納米縫的納米縫長度的伸直長度。所述離子緩沖劑的離子強(qiáng)度和所述納米縫與核酸分子的靜電或流體動力學(xué)性質(zhì)聯(lián)合以提供大于或等于所述納米縫的最小物理尺寸的加和的德拜長度。
【專利說明】呈現(xiàn)DNA大分子供于分析的系統(tǒng)和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年9月13日提交的美國臨時專利申請系列號61/877,570的優(yōu)先 權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用全文納入本文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦資助研究/開發(fā)的聲明
[0004] 本發(fā)明得到政府的支持，在國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health) 授予的HG000225和國家自然基金會(National Science Foundation)授予的0832760的資 助下完成。政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 本發(fā)明涉及核酸分子操作領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及使核酸分子伸展，以更好地 呈現(xiàn)核酸分子的某些部分，供于通過多種技術(shù)進(jìn)行觀察研究。
[0007] 人類基因組的大部分包含以多拷貝存在的DNA序列。盡管此類元件在生物調(diào)節(jié)和 進(jìn)化中起重要作用，它們的存在對于目前的DNA測序方法制造了困難。因此，當(dāng)試圖完成人 類基因組或癌癥基因組的測序時，出現(xiàn)了嚴(yán)重的問題，因?yàn)槟壳坝芍饕獪y序平臺利用的短 分析物分子通常呈現(xiàn)冗余的序列數(shù)據(jù)。就像試圖采用不具有獨(dú)特可識別的特征的塊件組裝 七巧板一樣，此類序列數(shù)據(jù)使得人們難以組裝完整基因組的序列。此外，我們將群體中基因 組的變化評估為突變或多態(tài)性的能力也受到限制。為克服該挑戰(zhàn)，全基因組分析η系統(tǒng)目 前以呈現(xiàn)較大、基因組DNA分析物 3,4的特征為特點(diǎn)，用于通過生物信息學(xué)途徑來揭示基因組 變化。采用納米限域(nanoconfinement)法實(shí)現(xiàn)的基因組分析的應(yīng)用需要整合系統(tǒng)構(gòu)成，所 述系統(tǒng)構(gòu)成經(jīng)協(xié)同平衡，以供處理大數(shù)據(jù)集。所述構(gòu)成包括:樣品制備、分子標(biāo)記、對限制的 DNA分子的呈現(xiàn)，和檢測，這通過算法來補(bǔ)充，所述算法納入了關(guān)于實(shí)驗(yàn)誤差處理的統(tǒng)計(jì)學(xué) 考量，用于數(shù)據(jù)分析54。
[0008] 雖然，在過去數(shù)年內(nèi)檢驗(yàn)并實(shí)現(xiàn)了用以限制DNA分子的多種方法5'1()-15,幾乎沒有 方法能夠?qū)NA分子延長至接近其伸直長度。例如，Kim等 9,在聚（二甲基硅氧烷）（PDMS)重 復(fù)的納米通道(250nm X 400nm)中延長了 λ-DNA，并且利用超低離子強(qiáng)度條件(0.06mM)實(shí)現(xiàn) 了0.88的伸展。就我們所知，這是報道過的，采用低離子強(qiáng)度緩沖劑的，納米通道中DNA分子 的最長伸展。在不同的工作中，Reisner等 11采用了 50nm恪融的二氧化硅納米通道，以及較高 離子強(qiáng)度條件（約5mM)，將DNA分子延長至長達(dá)0.83。盡管采用這兩種方法的伸展高于0.8， 這兩種技術(shù)均顯示限制。Reisner等的方法的要求較為苛刻，其需要制造小于分子持續(xù)長度 (persistence length)的極端納米限域裝置16，以將DNA分子延長至接近該分子伸直長度， 從而，這增加了分子荷載處理的復(fù)雜性。
[0009] 因此，需要一種能夠克服前述缺陷的，使核酸分子伸展的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明通過提供使核酸分子伸展的微流體裝置和方法克服了前述缺陷。
[0011]根據(jù)本公開內(nèi)容，所述微流體裝置可包括第一微通道、第二微通道、納米縫、核酸 分子和離子緩沖劑。納米縫(nanoslit)可在第一和第二微通道之間延伸。納米縫可提供第 一和第二微通道之間的流體路徑。核酸分子可包括第一端部、第二端部，和位于第一端部和 第二端部之間的中部。離子緩沖劑可處于納米縫和第一與第二微通道中。第一微通道可包 括:納米縫的第一端附近的第一簇集區(qū)，并且，第二微通道可包括:納米縫的第二端附近的 第二簇集區(qū)。第一簇集區(qū)可包含第一端部。第二簇集區(qū)可包含第二端部。納米縫可包含中 部。核酸分子可具有大于所述納米縫的納米縫長度的伸直長度?？山Y(jié)合離子緩沖劑的離子 強(qiáng)度和納米縫與核酸分子的靜電或流體動力學(xué)性質(zhì)，以提供加和的德拜(Debye)長度，其大 于或等于納米縫高度或納米縫寬度。納米縫高度或納米縫寬度可以是納米縫的最小物理尺 寸。
[0012] 根據(jù)本公開內(nèi)容，使核酸分子在離子緩沖劑中伸展的方法可包括:使所述核酸分 子定位，以使所述核酸分子的中部占據(jù)納米縫，所述核酸分子的第一端部占據(jù)納米縫的第 一端附近的第一簇集區(qū)，并且所述核酸分子的第二端部占據(jù)納米縫的第二端附近的第二簇 集區(qū)。所述納米縫、所述第一簇集區(qū)和所述第二簇集區(qū)可包含所述離子緩沖劑。核酸可具有 大于所述納米縫的長度的伸直長度?？蓪㈦x子緩沖劑的離子強(qiáng)度和納米縫與核酸分子的靜 電或流體動力學(xué)性質(zhì)結(jié)合，以提供加和的德拜(Debye)長度，其大于或等于納米縫高度或納 米縫寬度。納米縫高度或納米縫寬度可以是納米縫的最小物理尺寸。
[0013] 通過以下說明書可以清楚地了解本發(fā)明的上述和其他方面和優(yōu)勢。在以下說明書 中，參照構(gòu)成說明書的一部分的附圖，其中以說明性方式顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。這 類實(shí)施方式不必然代表本發(fā)明的全部范圍，而是因此對權(quán)利要求進(jìn)行說明并在本文中解釋 本發(fā)明的范圍。
[0014] 附圖的簡要說明
[0015] 圖1顯示微通道-納米縫裝置，其支持分子啞鈴(molecular dumbbell)的形成。（A) PDMS裝置，其粘附至潔凈的玻璃蓋玻片，浸入緩沖劑（未顯示），用于DNA分子的動電荷載。 (B)當(dāng)荷載的T4DNA分子（166此;74.5以111，染料調(diào)節(jié)的伸直長度)超過納米縫長度(28以111)時， 啞鈴形成;側(cè)接納米縫的分子端在微通道中變?yōu)樗沙诘娜π挝?瓣），由此增強(qiáng)納米縫中的 插入?yún)^(qū)段的伸展，伸展至(0.85±0.16，1 = 0.51!^);痕跡顯示沿分子主鏈的熒光強(qiáng)度變化。 (Ολ-DNA分子(48.5kb，21.8ym)過短無法形成啞鈴，因此完全限制在納米縫中；通過不均勻 的熒光強(qiáng)度概況進(jìn)一步證實(shí)了較低的伸展(S/L = 0.62±0.08，I = 0.48mM)。
[0016] 圖2顯示模擬的納米縫幾何學(xué)。顯示形成啞鈴的T4-DNA分子（166kb，L = 74.5μπι)的 快照。模擬的縫長度是1〇、20和30μπι;結(jié)果是等同的，這是因?yàn)榉肿由煺躬?dú)立于分子量。所示 結(jié)果采用20μπι長的納米縫計(jì)算。
[0017] 圖3說明對于T4DNA(灰色符號（·）；誤差線顯示平均值基礎(chǔ)上的SD，N = 51-101分 子)啞鈴而言，隨離子強(qiáng)度變化的伸展，其顯示實(shí)驗(yàn)、模擬和Odijk(Odijk)理論之間的良好 一致性。白色符號（·）顯示來自圖5的λ多聯(lián)體數(shù)據(jù)，并且采用內(nèi)標(biāo)(參見文字)測量。IX TE 緩沖劑的連續(xù)稀釋改變離子強(qiáng)度：1.〇、〇.74、0.51、0.45、0.23和0.111111。三角形（八）顯示來 自不考慮流體動力學(xué)相互作用(FD)的BD模擬的結(jié)果。方框（□)顯示來自考慮波動的流體動 力學(xué)相互作用(HI)的BD模擬的結(jié)果。虛線對應(yīng)于de Gennes和Odijk尺度變換（scaling)預(yù) 測。陰影區(qū)域涵蓋了有效hXh通道和3hXh縫之間的Odijk尺寸變換。
[0018] 圖4是對于1 = 0.51mM的T4DNA啞鈴而言，沿納米縫軸向和寬度方向的伸展隨納米 縫軸向位置的變化。顯示HI(實(shí)線)和ro(虛線)鏈的預(yù)測的伸展。包括HI鏈(上方)和FD鏈(下 方)的快照。
[0019] 圖5是λ-DNA多聯(lián)體啞鈴的伸展隨尺寸的變化:實(shí)驗(yàn)與BD模擬做比較。箭頭將實(shí)驗(yàn) 和模擬結(jié)果與圖形輸出和顯微圖剪輯畫面聯(lián)系起來;誤差線顯示基于N = 9-93分子的平均 值(點(diǎn)）的SD。草圖顯示垂直線描繪的納米縫;水平線指示納米縫邊界。對于給定的縫/微通 道幾何學(xué)，啞鈴瓣隨著增加的分子大小而增大，并且顯示與模擬的強(qiáng)力相似度。
[0020] 圖6顯示對于T4(白色符號（·），Ν=105分子）a-DNA多聯(lián)體（黑色符號（·），Ν=4-21分子)和花中間原體(M.f lorum)DNA(灰色符號（·），Ν= 11-59分子）（其用限制性酶ApaI 消化）而言，啞鈴弛豫時間與分子大小的函數(shù)關(guān)系。各圓形代表對于給定的分子大小 (146kb-582kb;x軸誤差線顯示95%置信區(qū)間）的平均弛豫時間（R t)。擬合至對數(shù)-對數(shù) (log-log)圖表的線性回歸顯示1.23 ±0.09(R2 = 0.82)的指數(shù)（exponent)。指數(shù)誤差由一 致性測試確定，該一致性測試包括各點(diǎn)平均值和X軸誤差。（小圖）T4DNA分子的啞鈴動力學(xué)， 其以編譯的時間片段(箭頭a顯示一個片段;0.440秒/片段)的形式在此處作為影片成像。
[0021] 發(fā)明詳述
[0022] 本公開內(nèi)容中引用的所有參考專利、申請和非專利文獻(xiàn)均通過引用其全文納入本 文。在參考文獻(xiàn)與本公開內(nèi)容不一致的情況中，以本公開內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0023 ]本公開內(nèi)容提供微流體裝置。該微流體裝置可包括第一微通道、第二微通道、納米 縫、核酸分子，和離子緩沖劑。納米縫可在第一和第二微通道之間延伸。納米縫可提供第一 和第二微通道之間的流體路徑。核酸分子可具有第一端部、第二端部，和位于第一端部和第 二端部之間的中部。離子緩沖劑可處于納米縫和第一與第二微通道中。第一微通道可包括： 納米縫的第一端附近的第一簇集區(qū)，并且，第二微通道可包括:納米縫的第二端附近的第二 簇集區(qū)。第一簇集區(qū)可包含第一端部。第二簇集區(qū)可包含第二端部。納米縫可包含中部。核 酸分子可具有大于所述納米縫的納米縫長度的伸直長度?？蓪㈦x子緩沖劑的離子強(qiáng)度和納 米縫與核酸分子的靜電或流體動力學(xué)性質(zhì)結(jié)合，以提供加和的德拜(Debye)長度，其大于或 等于納米縫高度或納米縫寬度。納米縫高度或納米縫寬度可以是納米縫的最小物理尺寸。 [0024]本公開內(nèi)容還提供使核酸分子在離子緩沖劑中伸展的方法。所述方法可包括:使 核酸分子定位，以使所述核酸分子的中部占據(jù)納米縫，所述核酸分子的第一端部占據(jù)納米 縫的第一端附近的第一簇集區(qū)，并且所述核酸分子的第二端部占據(jù)納米縫的第二端附近的 第二簇集區(qū)。所述納米縫、所述第一簇集區(qū)和所述第二簇集區(qū)可包含所述離子緩沖劑。核酸 可具有大于所述納米縫的長度的伸直長度。可將離子緩沖劑的離子強(qiáng)度和納米縫與核酸分 子的靜電或流體動力學(xué)性質(zhì)結(jié)合，以提供加和的德拜(Debye)長度，其大于或等于納米縫高 度或納米縫寬度。納米縫高度或納米縫寬度可以是納米縫的最小物理尺寸。
[0025]參見圖I (A)，微流體裝置可包括復(fù)制件10，例如PDMS復(fù)制件，其包括微通道12和納 米縫14。該裝置可被安裝在基底16上。該裝置可具有電極18。
[0026] 參見圖1(B)，所述微流體裝置可包含啞鈴構(gòu)型的伸展的核酸分子20。熒光強(qiáng)度22 示于對應(yīng)的核酸分子20的側(cè)邊。貫穿核酸分子20的長度沒有熒光強(qiáng)度22變化則指示良好伸 展。
[0027] 參見圖1(C)，所示的微流體裝置包含比納米縫長度短的核酸分子24,其不具有啞 鈴構(gòu)型，并且不完全伸展。熒光強(qiáng)度26示于對應(yīng)的核酸分子的側(cè)邊。貫穿核酸分子20的長度 的熒光強(qiáng)度26的較大變化指示較差伸展。
[0028]在某些實(shí)施方式中，當(dāng)?shù)谝淮丶瘏^(qū)具有核酸分子的第一簇集端部且第二簇集區(qū)具 有核酸分子的第二簇集端部時，納米縫可經(jīng)設(shè)置以包含核酸分子的中部。一般可使核酸分 子的中部位于所述核酸分子的第一和第二簇集的端之間。本文中所用的"簇集的端"或"簇 集的構(gòu)型"指的是核酸分子的一種構(gòu)型，其不伸展出來，并且在所述核酸分子的相應(yīng)的端的 至少部分中包含無規(guī)卷曲。本文中所用的"簇集區(qū)"指的是，被簇集的端占據(jù)的微通道中的 空間。對于其相應(yīng)的微通道，所述簇集區(qū)將自然具有相同大小或小于其相應(yīng)的微通道。 [0029] 在某些實(shí)施方式中，納米縫可具有如下物理尺寸。納米縫可具有約Inm至約Iym量 級的最小物理尺寸。納米縫可具有200ηπι-10μπι的納米縫寬度。納米縫的納米縫寬度可小于 或等于lym。納米縫的納米縫長度可小于或等于30μηι。納米縫的納米縫高度可以是20nm-200nm。納米縫的納米縫高度可小于或等于100nm。在某些實(shí)施方式中，納米縫可在整個納米 縫長度上具有基本均一的納米縫寬度、基本均一的納米縫高度，或同時滿足上述兩種條件。
[0030] 在某些實(shí)施方式中，所述納米縫的長度可小于或等于所述核酸分子的伸直長度， 或小于或等于所述核酸分子的伸直長度的一半。
[0031] 在某些實(shí)施方式中，納米縫可具有至少50nm的最小物理尺寸。在某些實(shí)施方式中， 核酸分子定位于納米縫中，所述納米縫具有至少約50nm的最小物理尺寸。換言之，所述裝置 可以不需要制造小于50nm的腔。此外，當(dāng)核酸分子定位于、穿過，或動電學(xué)地驅(qū)動進(jìn)入該實(shí) 施方式的納米縫時，其將經(jīng)歷的最小通道可以是50nm的通道。
[0032] 在某些實(shí)施方式中，離子緩沖劑可具有適于與納米縫和核酸分子聯(lián)用的離子強(qiáng) 度，以提供大于或等于納米縫高度或納米縫寬度的加和的德拜長度，其中，所述納米縫高度 或納米縫寬度是所述納米縫的最小物理尺寸。在某些實(shí)施方式中，離子緩沖劑可具有一定 的離子強(qiáng)度，所述離子強(qiáng)度提供的納米縫或核酸的德拜長度是納米縫高度或納米縫寬度的 至少約25%，其中，所述納米縫高度或納米縫寬度是所述納米縫的最小物理尺寸。在某些實(shí) 施方式中，離子緩沖劑可具有小于或等于約〇.75mM的離子強(qiáng)度。
[0033] 在某些實(shí)施方式中，離子緩沖劑可包括Tris-HC1、EDTA、2-巰基乙醇、P0P6,或其組 合。
[0034]在某些實(shí)施方式中，離子緩沖劑可包括粘度調(diào)節(jié)劑。粘度調(diào)節(jié)劑可以是蔗糖。
[0035]在某些實(shí)施方式中，第一微通道、第二微通道，或這兩者可具有如下的物理尺寸。 微通道可具有Iym-約Imm量級的最小物理尺寸。微通道的微通道寬度可以是Ιμπι-lmm。微通 道的微通道寬度可以是約20μπι。微通道的微通道長度可以是100ym-20 Cm。微通道的微通道 長度可以是約l〇mm。微通道的微通道高度可以是20ηπι-100μπι。微通道的微通道高度可以是 約1.66ym。
[0036] 在某些實(shí)施方式中，所述裝置還可包含溫度調(diào)節(jié)模塊。溫度調(diào)節(jié)模塊可用于調(diào)節(jié) 核酸分子、離子緩沖劑，或兩者的溫度。溫度調(diào)節(jié)模塊可用于升高或降低溫度，以減緩核酸 分子的運(yùn)動動力學(xué)。在某些實(shí)施方式中，離子緩沖劑的溫度可小于或等于20°C。
[0037] 在某些實(shí)施方式中，所述微流體裝置可包含一個或多個電極。所述一個或多個電 極可基本平行于一條或多條納米縫排列，并且可用于通過動電學(xué)方式驅(qū)動所述核酸分子進(jìn) 入納米縫。
[0038] 在某些實(shí)施方式中，所述核酸分子可具有至少約30秒的弛豫時間。在某些實(shí)施方 式中，所述核酸分子的伸直長度可大于納米縫的納米縫長度，或是納米縫的納米縫長度的 至少兩倍。
[0039]在某些實(shí)施方式中，核酸分子可以是DNA分子。
[0040] 在某些實(shí)施方式中，使核酸分子定位可包括:使所述核酸分子穿過納米縫，動電學(xué) 地驅(qū)動所述核酸分子的中部進(jìn)入納米縫，或其組合。
[0041] 在某些實(shí)施方式中，所述方法還可包括對核酸分子的中部的至少部分成像。成像 可包括顯微鏡檢，例如9?光顯微鏡檢，等等。
[0042]如本公開內(nèi)容中所述的，DNA大分子可以"啞鈴"構(gòu)型呈現(xiàn)用于分析。在所述的方法 中，例如，使離子緩沖劑中的DNA分子通過微流體裝置中的納米縫。這可導(dǎo)致該分子中的如 下構(gòu)型:其中該分子的中部（即，納米縫中的該分子的部分）向線性構(gòu)型伸展，并且該分子的 相對的端（即，位于納米縫外的該分子的部分)形成簇集構(gòu)型-即，"啞鈴"構(gòu)型。本公開內(nèi)容 所述的DNA的這種呈現(xiàn)可利用熵、彈性和流體動力，以使DNA伸展，并且可利于，例如，對相關(guān) 分子的伸展的中部（即，啞鈴的"橫條"）進(jìn)行各種分析。為支持所述分析，可能會希望利用某 些設(shè)備和過程，所述設(shè)備和過程能夠確保位于納米縫中的DNA分子部分達(dá)到（或至少接近） "Odijk"范圍條件(regime) (即，限制的DNA分子的延伸中的顯著平臺），并顯示合適長度的 弛豫時間，以促進(jìn)所需方案的執(zhí)行。
[0043]通過重要的建模和實(shí)驗(yàn)，已確定可通過仔細(xì)選擇微流體裝置構(gòu)型和離子溶液特點(diǎn) 的組合來顯著改善DNA分子的伸展程度和弛豫時間。例如，相較于先前可及的水平，在微流 體裝置中利用低強(qiáng)度離子環(huán)境與具有合適尺寸的納米縫，能夠有利于獲得對象DNA分子的 更加完全伸展的構(gòu)型。所述環(huán)境/尺寸變換可有利地管控與觀察的分子的構(gòu)象有關(guān)的靜電 和流體動力學(xué)相互作用之間的微妙平衡。
[0044]舉例而言，已確定，顯示小于相關(guān)分子的伸直長度的一半的納米縫長度的微流體 裝置能通過以分鐘計(jì)的方式遞送弛豫時間，這是比不利用本文所述的啞鈴構(gòu)型的分子優(yōu)越 的一大改善。這可大幅促進(jìn)對于分子的實(shí)驗(yàn)觀察。因此，對于某些應(yīng)用，可有利地設(shè)置微流 體裝置具有這樣的納米縫:所述納米縫的長度不超過相關(guān)DM分子的伸直長度的一半。尤 其，在某些構(gòu)型和條件下，一旦納米縫長度已針對參照分子進(jìn)行合適的調(diào)節(jié)，相同微流體裝 置可用于相對均一地呈現(xiàn)任何大小的分子(例如，伸直長度(L)超過參照分子的伸直長度的 分子）。例如，對于具體的分子（例如，菌體（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司（New England Biolabs) )48 · 5kb(L= 16 · 5ym/21 · 8μηι)、Τ4·菌體（和光化學(xué)公司（Wako Chemicals)) 166kb (L = 56.3μηι/74.5μηι)、λ-多聯(lián)體（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司，λ多聯(lián)體梯標(biāo)，大小范圍= 137.4-582 .Okb)、花中間原體(M.florum) (ApaI消化物：252kb，L = 85.7ym/113.2ym;541kb L=184.2ym/243.2ym)，其各自處于包含4%(v/v)2-巰基乙醇、0.1%(w/v)P0P6(應(yīng)用生物 系統(tǒng)公司（Applied Biosystems))和TE緩沖劑（IX: IOmM Tri-HCL和ImM EDTA pH 7.9)的 0.01X-0.1X溶液中）（上述的L分別指示未染色/染色的伸直長度），可有利地制造微流體裝 置以包括Iym寬X IOOnm高X 28μπι長的納米縫。通過該方式，納米縫的長度一般小于(染色的 或未染色的)測試分子的伸直長度的一半，并且因此可獲得增強(qiáng)的弛豫時間。
[0045]微流體裝置，例如上文所述的那些，還可在所述納米縫的各端包括微通道。在某些 實(shí)施方式中，上述示例裝置的微通道可經(jīng)制造以具有20μπι寬X 1.66μπι高X IOmm長的尺寸。 這些微流體裝置(和本公開內(nèi)容設(shè)想的其它裝置)的制造可利用各種已知技術(shù)，例如硅片上 的反應(yīng)性離子蝕刻，采用通過軟刻蝕法制成的PDMS復(fù)制件，和通過O 2等離子體處理而具有 親水性。
[0046] 此外或作為上述納米縫構(gòu)型的替代，對象分子的伸展還可通過為該核酸提供離子 強(qiáng)度降低的緩沖劑來有利地增強(qiáng)。例如，與各種現(xiàn)有理論不同，已發(fā)現(xiàn)可通過提供與相關(guān) DNA分子的持續(xù)長度相等(或至少相當(dāng)）的有效限域(confinement)(在某些實(shí)施方式中，考 慮靜電考量)來獲得Odijk范圍條件伸展。為此，離子強(qiáng)度的降低可有利地增加鏈持續(xù)長度， 并且增強(qiáng)有效限域，這通過微流體裝置表面的增強(qiáng)的德拜長度而誘導(dǎo)（其本身也通過適當(dāng) 低的離子強(qiáng)度而增強(qiáng)）。例如，降低的離子強(qiáng)度和合適設(shè)置的納米縫可使該裝置的德拜長度 和/或該分子的持續(xù)長度與納米縫高度相當(dāng)（或相等）（例如，對于上述裝置而言，約IOOmii)。 該方式中，因?yàn)橛行抻蚺c鏈持續(xù)長度相當(dāng)（或相等），可實(shí)現(xiàn)Odijk范圍條件。因此，聯(lián)合利 用離子強(qiáng)度降低的緩沖劑和合適的微流體裝置構(gòu)型（例如，納米縫尺寸），可導(dǎo)致更長的弛 豫時間，由此更好地促進(jìn)基于成像的基因組分析和其它研究。由此，基于相關(guān)的DNA分子的 持續(xù)長度設(shè)計(jì)并制造微流體裝置(例如，關(guān)于納米縫尺寸)并選擇緩沖劑離子強(qiáng)度(例如，考 慮增強(qiáng)的德拜長度），而不是(或除了）集中在有效DNA直徑方面，可能是合適的。例如，對于 上述示例裝置（即，具有Iym寬X IOOnm高X 28μπι納米縫），可采用具有0.006 %的2-巰基乙醇 和0.00015%的Ρ0Ρ6的終濃度的TE緩沖劑。
[0047] 作為額外的量度，在某些實(shí)施方式中，向低離子強(qiáng)度溶液(上述)添加蔗糖和/或適 當(dāng)定時的溫度下降可能會提高溶液粘度，并由此進(jìn)一步延長弛豫時間。
[0048]因此，在實(shí)踐中，可通過定時的電脈沖來使對象DNA穿過微流體裝置上的納米縫， 獲得上述"啞鈴"構(gòu)型。如上所述，在某些實(shí)施方式中，所述納米縫可基于DNA分子的相關(guān)特 點(diǎn)（例如，分子伸直長度和/或持續(xù)長度)來設(shè)置/制造，并且可利用合適低離子強(qiáng)度的緩沖 劑（例如，0.1 lmM或相似強(qiáng)度，按照提供與納米縫高度相當(dāng)?shù)难b置德拜長度的所需條件而 定）。尤其，較低離子強(qiáng)度緩沖劑(例如，〇. IlmM)，聯(lián)合具有合適尺寸的納米縫，以及誘導(dǎo)的 啞鈴構(gòu)型所生成的彈性力，可大幅增強(qiáng)DNA的延長，甚至延長至完全伸展的呈現(xiàn)程度。如本 公開內(nèi)容所討論的，該增強(qiáng)可歸因于，例如，DNA啞鈴與啞鈴瓣的熵彈回的流體動力學(xué)相互 作用，以及通過降低的離子強(qiáng)度條件所致的靜電相互作用的增強(qiáng)。在某些示例中，還可向低 離子溶液添加蔗糖和/或降低溫度(例如，在荷載之后改變）以增加溶液粘度并由此進(jìn)一步 延長弛豫時間。
[0049] 采用250nm X 400nm PDMS復(fù)制的納米通道和0.06mM的離子強(qiáng)度緩沖劑的過去的 研究工作已經(jīng)獲得了 ADNA的0.88的伸展。這些條件下的德拜長度約為40nm。因此，加和的德 拜長度(裝置頂、裝置底、面對裝置頂?shù)暮怂岱肿拥谋砻婧兔鎸ρb置底的核酸分子的表面的 德拜長度，即，4倍德拜長度)是約160nm，其短于250nm的最小物理尺寸。同樣地，采用50nm熔 融的二氧化硅納米通道和約5mM的離子強(qiáng)度緩沖劑的研究工作已獲得DNA分子的長達(dá)0.83 的伸展。這些條件下的德拜長度約為1.34nm。因此，加和的德拜長度是約5.34nm，其短于 50nm的最小物理尺寸。相反，采用公開的具有合適尺寸的納米縫尺寸（例如，已針對靶分子 的相關(guān)方面進(jìn)行調(diào)節(jié))和合適低離子強(qiáng)度緩沖劑(例如，選擇用于裝置德拜長度的增強(qiáng)的尺 寸變換)的聯(lián)合的一個實(shí)施方式可有利地獲得1.06或更高程度的伸展。
[0050]對于DNA極大分子的分析固然支持長范圍、定相的序列信息，但需要用于其有效呈 遞的新方法，以作為任何基因組分析平臺的部分。采用匯集分子限域、離子環(huán)境和DNA彈性 性質(zhì)的，由分子模擬支持的多因素方法，我們已開發(fā)出用于在納米級的縫中呈現(xiàn)DNA大分子 的高效且可變換規(guī)模的方法。我們的方法依賴于DNA啞鈴的形成，其中該分子的大區(qū)段留在 用于限制它們的納米縫之外。我們方法的低離子環(huán)境與其它特征協(xié)同，允許DNA分子呈現(xiàn)與 伸直長度相當(dāng)?shù)耐耆煺沟臉?gòu)象，由此便于通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行的分析。因此，提議采用分 子模型來描述納米縫中的DNA分子的構(gòu)象和動力學(xué)；采用聚合物動力學(xué)的朗之萬 (Langevin)描述法，其中流體動力學(xué)作用通過格林函數(shù)(Green's function)形式來包括在 內(nèi)。我們的模擬揭示，觀察到的分子構(gòu)象依賴于靜電和流體動力學(xué)相互作用的微妙平衡。我 們證明并進(jìn)一步證實(shí)，當(dāng)限域維度與分子的持續(xù)長度量級相同時，確實(shí)開始了 "Odijk范圍 條件"。我們還總結(jié)了與啞鈴動力學(xué)有關(guān)的現(xiàn)有理論。
[0051 ]本文中，大DNA在納米縫中的動電荷載提供使無規(guī)卷曲伸展，并作為分析物陣列呈 現(xiàn)的新途徑。納米縫，或縱橫比>1的通道，能夠?qū)崿F(xiàn)幾何規(guī)?？烧{(diào)的納米限域條件，其有利 于大數(shù)據(jù)集的采集。納米縫還允許通過來自電子束制造的主體的一次性裝置的大規(guī)模復(fù)制 進(jìn)行的低成本制造。此外，低離子強(qiáng)度條件增加 DNA分子的持續(xù)長度，由此導(dǎo)致裝置中DNA的 納米限域，所述裝置與硅橡膠材料的固有幾何限制相容5> 9。在第一代"納米編碼 (Nanocoding)"中，采用序列特異的標(biāo)記物進(jìn)行了限制的DNA分子的制圖5。用于基因組分析 的此類制圖數(shù)據(jù)的值顯示基于標(biāo)志物密度 6和分子伸展S/L(其中S是分子的表觀長度，且L 是其伸直長度）。
[0052]通過先前工作中列出的聯(lián)合的實(shí)驗(yàn)和理論方法5,我們詳細(xì)描述了在我們的納米 縫中采用DNA"啞鈴"構(gòu)象將通過熵、彈性和流體動力大幅增強(qiáng)DNA伸展。在本文中，我們確定 了 DNA啞鈴，其在從側(cè)面介入納米縫中余留的聚合物區(qū)段的微通道中包含兩個松弛的卷曲 (瓣）（圖1)。我們的實(shí)驗(yàn)確實(shí)顯示，采用與先前實(shí)驗(yàn) 5相同的離子強(qiáng)度和"廣闊的"限域條件 (縫尺寸：IOOnmX 1000 nm)，分子啞鈴能使納米縫中的DNA伸展增強(qiáng)至多至完全分子伸直長 度。更重要地，DNA啞鈴克服了現(xiàn)有方法的限制(包括離子強(qiáng)度低于0.06mM)，或嚴(yán)格限制(低 于50nm)。通過低離子強(qiáng)度條件介導(dǎo)的，瓣的熵彈回、流體動力學(xué)相互作用和靜電相互作用 的聯(lián)合，生成跨越了納米縫中DNA分子主鏈的張力，進(jìn)一步延長了該分子。這是第一次發(fā)現(xiàn) 啞鈴構(gòu)象允許DNA分子在納米縫中的延長，顯示其伸展多至1.06±0.19。我們的結(jié)果指示， 一旦持續(xù)長度等于有效限域(包括靜電考量），即達(dá)到"Odijk范圍條件"，這與提議有效DNA 直徑是de Gennes-Odijk轉(zhuǎn)換的相關(guān)參數(shù)的其它理論11明顯不一致。此外，我們發(fā)現(xiàn)，一旦該 分子的伸直長度長于納米縫長度的兩倍，啞鈴的弛豫時間以分鐘計(jì)，并且隨瓣的大小而增 加。該伸展仍獨(dú)立于分子量。所述分子呈現(xiàn)極大地增強(qiáng)了對伸展的分子的截留（即，失衡亞 穩(wěn)態(tài)），由此使該方法成為用于基因組分析系統(tǒng)的實(shí)踐組成。
[0053]近期，Yeh等.17也對限制的DNA分子進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)聯(lián)合與Kim等9所用那些相 似的微米和納米級裝置。其在一些情況下觀察到長DNA能夠形成啞鈴。他們從準(zhǔn)靜態(tài)觀點(diǎn)解 釋了這些觀察結(jié)果，并著重強(qiáng)調(diào)了熵-驅(qū)動的單一分子角力(TOW)方案，其允許對強(qiáng)限域下 的熵彈回的靜力學(xué)和動力學(xué)進(jìn)行研究。本工作中，我們顯示，對應(yīng)于微米級限制中的對稱的 瓣的該準(zhǔn)靜態(tài)范圍條件具有消沒的出現(xiàn)概率。限制的分子處于非平衡態(tài)條件下，并且瓣的 不均一大小會控制分子彈回。通過考慮非平衡態(tài)條件，我們顯示數(shù)種機(jī)制能夠控制分子動 力學(xué)和啞鈴壽命。
[0054]材料和實(shí)驗(yàn)方法
[0055]裝置制造和設(shè)置。微通道-納米縫裝置主體通過電子束光刻，采用JE0LJBX-5DII系 統(tǒng)（CNTech，UW-麥迪遜）制造。通過CF4反應(yīng)性離子蝕刻法在硅片中蝕刻納米縫（Ιμπι寬X IOOnm高X 28μπι長），并且，經(jīng)修飾的SU8微通道(20μπι寬X 1.66μπι高X IOmm長)被覆蓋(參見 圖I) IDMS復(fù)制件通過軟刻蝕法形成，通過O2等離子體處理而具有親水性，并且在蒸餾水中 存放24小時，然后所述裝置可使用數(shù)月。將納米縫裝置安裝在酸清潔的帶負(fù)電的玻璃表面 上、鉑電極(線，0.013"直徑）以對角線方向放置，近乎平行于納米縫，置于緩沖室中，粘附 至樹脂玻璃(Plexiglas)支持物的底部的玻璃表面，并附至Kepco(型號Β0Ρ100-1Μ)雙極操 作電源。利用毛細(xì)管作用將DNA溶液裝載進(jìn)入微通道，并將裝置浸入緩沖劑[TE，含有2-巰基 乙醇(0.006% )和P0P6(0.00015%;應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）終濃度]持續(xù)20分鐘，在測量前允許 緩沖劑平衡。裝置被浸入后，DNA分子經(jīng)動電學(xué)驅(qū)動進(jìn)入納米縫，在其完全離開之前定時，從 而其以啞鈴形式被捕獲。
[0056] DNA樣品和伸展。DNA樣品，用Y0Y0-1 (I，1-[ 1，3-丙烷二基雙[(二甲基亞氨基）-3， 1-丙二基]]雙[4-[(3_甲基-2(3H)苯并噁唑亞基）甲基]-喹啉鑰碘)5(分子探針)染色，包括 [(未染色/染色伸直長度），L;假設(shè)嵌入率為1染料/4bp]A-噬菌體(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公 司）48·5kb(L=16·5μm/21·8μm)、T4噬菌體（和光化學(xué)公司）166kb(L = 56·3μm/74·5μm)、λ-多聯(lián)體(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司，λ多聯(lián)體梯標(biāo)，大小范圍=137.4-582.0kb)，花中間原體 (Mesoplasma f lorum) (ApaI消化物：252kb，L = 85 · 7μηι/113 · 2μηι; 541kb，L = 184 · 2μηι/243 · 2 ynuDNA溶液還包含4%(v/v)2-巰基乙醇、0.1%(w/v)P0P6(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）和0.01X-0.1 X的TE緩沖劑（IX: IOmM Tris-HCl和ImM EDTA pH 7.9);離子強(qiáng)度通過采用NaCl標(biāo)準(zhǔn)9的 電導(dǎo)率確定。
[0057] 圖像捕獲和分析。Y0Y0-1染色的分子采用耦合至蔡司135M落射熒光顯微鏡(63x蔡 司Plan-Neof Iuar油浸物鏡）的濱松CCD相機(jī)(Orca-ER)用氬離子激光器(488nm;換鏡轉(zhuǎn)盤處 測量為8yW-200yW)照射，成像(Manual Collect軟件5)，用于伸展和弛豫時間實(shí)驗(yàn)。采用更 靈敏的相機(jī)(Andor iX〇n-888EMCCD)來對T4啞鈴分子的松弛動力學(xué)成像。圖像采用ImageJ18 分析，采用"滾球"算法19段，通過對來自背景的分子取閾值并檢測分子熒光強(qiáng)度和長度來扣 減背景。
[0058] 花中間原體(Mesoplasma florum)制備?；ㄖ虚g原體(M. florum)2Q在ATCCl 161中于 30°C生長，然后成團(tuán)塊。細(xì)胞用IOmM Tris-HCl溶液(pH 7.6)和IMNaCl清洗，然后成團(tuán)塊，并 重懸?；嘏募?xì)胞(37°C)以l:l(v/v)與1%低熔融溫度瓊脂糖混合，并分配在插入托盤中。 插入物 21'22匯集在50mL圓錐管中，并在6mM Tris-HCl pH 7.6，1M NaCl，100mM EDTA，1%N-月桂基肌氨酸和20yg/mL RNA酶中于37°C孵育過夜。然后，將插入物轉(zhuǎn)移至0.50M EDTA pH 8.0，1 %N-月桂基肌氨酸，含lmg/mL蛋白水解酶K，并在50°C孵育過夜，然后用0 . ImM苯甲基 磺酰氟處理，然后用0.50MEDTA(pH9.5)透析十次。插入物針對lXTE透析兩次，然后在 0.1 X TE中透析供于電洗脫。
[0059]表面電荷密度的確定。在具有兩個端口的納米縫裝置中采用電滲流測量法估計(jì)表 面電荷密度。電滲流在與Huang等23所述類似的設(shè)置中檢測。端口用標(biāo)準(zhǔn)剃須刀片切成氧等 離子體處理的納米縫裝置。將相距20mm的鉑電極置于端口中，并連接至EC-105電源(EC設(shè)備 公司），其在第二儲蓄池和地電位之間具有195 Ω電阻。通過電阻器直接連接萬用表以測量 隨外部電勢的施加而出現(xiàn)的電勢降低。將二十毫摩爾磷酸鹽緩沖劑(pH 7.0)添加至荷載， 并沖洗系統(tǒng)，然后添加 IOmM磷酸鹽緩沖劑(pH 7.0)，然后施加約100V(3分鐘）；然后顛倒電 壓極性，持續(xù)3分鐘。線性擬合鑒定各組實(shí)驗(yàn)的正偏差和反偏差之間的截距(時間，t)。電滲 迀移率(yEQF)由下式計(jì)算
[0061] 其中U是微通道長度，E是電場，而t是時間。
[0062] 根據(jù)電滲迀移率，表面上的電荷密度(％)是
[0063] σ0 = ζεε〇Κθχρ0-ψκ) (2)
[0064] 其中ζ是ζ電位，!T1是德拜長度，rw是與表面的常規(guī)距離，￡是相對介電常數(shù)，而 ￡〇是 真空介電常數(shù)。因此，裝置內(nèi)部的表面密度經(jīng)測試是1.1-1.3e/nm2。
[0065] 納米限域下的珠擴(kuò)散。納米縫中的YG羧基封端的珠（24nm;分子探針）（0.20mM和 IOmM NaCl中，κ-1分別=22和3nm)采用全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRF)顯微鏡（利用蔡司TIRF 100X 1.46NA物鏡和135TV倒置顯微鏡)成像。光學(xué)系統(tǒng)包括:488nm照射(氬離子激光器，相 干公司（Coherent)); 1/4波片;伽利略望遠(yuǎn)鏡(40mm和200mm焦距鏡頭(埃德蒙工業(yè)光學(xué)器件 公司（Edmund Industrial Optics)));寬帶濾波器485/20(Semrock);和525/50激發(fā)濾波器 (Chroma);然后通過125mm場長凸透鏡將束映像至物鏡上。TIRF激發(fā)產(chǎn)生約70nm(小于納米 縫深度；IOOnm)的穿透深度；圖像通過525/50發(fā)射濾波器(Chroma)映至Andor iXon-888相 機(jī)，通過Andor SOLIS軟件處理，其隨后經(jīng)"滾球"算法扣減背景用于陰影校正19JARKalman 堆棧算法來減少圖像噪音。珠熒光強(qiáng)度波動的周期性采用快速傅里葉變換(FFT)分析，用于 辨識最大峰。
[0066] DNA模型和模擬方法
[0067] 進(jìn)行布朗動力學(xué)(BD)模擬法以模擬納米縫中的DNA啞鈴構(gòu)象。通過格林函數(shù)形式 納入遠(yuǎn)程（Long-range)流體動力學(xué)相互作用，并采用O(N)通用幾何學(xué)埃瓦爾德樣方法 (GGEM) 24^31計(jì)算。存在對于啞鈴構(gòu)象的限域效應(yīng)的組合?？p中的分子在微通道和納米縫寬度 中經(jīng)歷de Gennes范圍條件(限制大小~Rg)32，在納米縫高度中經(jīng)歷Odijk范圍條件(限域大 小~ 1())16'33'34。范圍條件的組合對用于描述本研究中考慮的縫的模型上施加了多種限制條 件(參見圖2)。
[0068] DNA范圍的可用的描述從具體的原子模型35,到利用多個位點(diǎn)來確定核苷酸的中尺 度模型36_ 39,到從個體珠(和彈性物(spring))方面描述多種核苷酸的粗粒度模型4〇^。典型 的示例包括利用連續(xù)懦蟲狀鏈(WLC)模型的Kratky-Porod模型、利用Marko和Siggia插入的 珠-彈性物模型 43_47,和基于非線性彈性彈性物(FENE)的模型26'27' 48。合適的模型必須解析 納米限域的長度規(guī)模，但沒有持續(xù)長度的有限離散化，因?yàn)?，針對區(qū)段擴(kuò)散的特征時間比特 征鏈-擴(kuò)散時間要短好幾個數(shù)量級。Kratky-Porod或較高分辨率模型需要大量的計(jì)算(在珠 和鏈擴(kuò)散時間之間存在8個數(shù)量級的時間標(biāo)度）。在光譜的另一端，根據(jù)單一彈性物來描述 10-20個持續(xù)長度的連續(xù)WLC模型不具有描述納米縫限域所需的分辨率。
[0069] Yeh等.17進(jìn)行了由彈性物連接的珠-彈性物鏈的模擬，以描述其對于DNA啞鈴進(jìn)行 的實(shí)驗(yàn)。然而，從彈性物的WLC表現(xiàn)法開始，其修改了該定律直至在模型和實(shí)驗(yàn)之間觀察到 一致性。然而，仍然不明這一方法是否能夠描述寬范圍條件的DNA大分子，以及，其是否能夠 真實(shí)地預(yù)測。一個好的折衷辦法，并且用于我們的研究中的那一個，是由Underhi Il-Doyle (UD)模型4941提供。UD模型最初開發(fā)用于Θ-溶劑;在該工作中，我們納入了排除體積力和流 體動力學(xué)相互作用，以描述良好溶劑條件，并生成Zimm尺寸變換。溶解在粘性溶劑中的聚合 物分子，由珠-彈性物鏈代表，所述珠-彈性物鏈由通過Ns = Nb-I彈性物連接的Nb珠組成。我 們的限制系統(tǒng)的條件是雷諾數(shù)為零，并且慣性忽略不計(jì)。各珠上的力平衡要求
[0071] 對于珠 l，jf是流體動力，.//"是珠-珠排除體積力，/^是珠-壁排除體積力，/f是 布朗力，且.//Λ是1^彈力。
[0072] 采用恒定伸展機(jī)械集合開發(fā)的該模型用于相鄰分子珠之間的連通性。該模型定義 如下I51:
[0074] 其中_f= r/.q.0，qQ是最大彈性物延伸，且r= |x|，x=(x，y，z)。
[0075] 該多項(xiàng)式展開的系數(shù)如下定義：
[0076] αι = 1.〇 (5)
[0077] 〇2 = -7χ (6)
[0081]在該模型的開發(fā)中，Underhill和Doyle49對作為Np, 3的函數(shù)的彈性物定律進(jìn)行了誤 差估計(jì)，并且發(fā)現(xiàn)其以1%的最大誤差(NP,s多4)再現(xiàn)了 DNA的性態(tài)(behavior)。我們選擇了 通過NP,s = 4給定的UD模型的最大長度分辨率。
[0082]對于非結(jié)合的珠-珠相互作用，我們采用了高斯排除體積勢。線性聚合物的稀釋溶 液的中子散射數(shù)據(jù)處于良好溶劑條件中，指示沿所述鏈的小距離處的理想的鏈性態(tài)，和長 距離處的良好溶劑性態(tài)52$。我們認(rèn)為能量的增加歸因于兩個亞分子(或分子團(tuán)(molecular blob))的重疊。認(rèn)為各亞分子具有含第二矩
，的高斯概率分布，其中NP,s是每 彈性物的持續(xù)長度的數(shù)目?？紤]到歸因于兩個高斯卷曲重疊的能量損耗，得出了關(guān)于鏈的 兩個珠之間的排除體積勢的以下表達(dá)式53,55 :
[0084]其中f = -VcDv5COv是與DNA有效直徑相關(guān)的排除體積參數(shù)54' 55，kB是波爾茲曼常 數(shù)，且T是溫度。
[0085]拒斥倫納德-瓊斯勢58,59用于描述珠-壁排除體積相互作用，其中歐幾里德距離被 壁法線方向(normal drection)替換。
[0086]珠-彈性物DNA分子的動力學(xué)通過展開構(gòu)型分布函數(shù)來描述。該函數(shù)的擴(kuò)散方程具 有?？藸?普朗克方程的形式；上述力平衡對應(yīng)于珠位置運(yùn)動的隨機(jī)微分方程的如下系 ^^55, 60,61 ^
[0088] 其中R是包含組成聚合物鏈的珠的3Nb坐標(biāo)的向量，其中Xi指示珠1的笛卡兒坐標(biāo)。
[0089] 長度3Nb的向量Uo代表未擾動的速度場，即，在沒有任何聚合物分子存在的情況下 的速度場。向量F具有長度3N b，其中fi指示對于珠1的總的非布朗、非流體動力作用。最終，dW 的3Nb獨(dú)立分量從具有零平均數(shù)與方差dt的實(shí)值的高斯分布獲得。鏈的珠的運(yùn)動擾亂了整 個流場，其進(jìn)而影響其它珠的運(yùn)動。這些流體動力學(xué)相互作用(HI)通過3N bX3Nb擴(kuò)散張量的 3X3區(qū)塊成分(Dlli)進(jìn)入聚合物鏈動力學(xué)，D = kBTM(M是迀移率張量），其可被分成珠史托克 斯阻力（Stokes drag)和流體動力學(xué)相互作用張量，Ω 1μ;
[0091] 此處δ是3 Χ3恒等矩陣，δ1μ是克羅內(nèi)克符號，而ξ是珠摩擦系數(shù)。布朗擾動通過漲落 耗散定理與流體動力學(xué)相互作用耦合:D = B · Bt。描述系統(tǒng)的特征長度、時間和力比分別通 過珠流體動力學(xué)半徑a、珠擴(kuò)散時間|a2/k BT，和kBT/a來設(shè)定。珠摩擦系數(shù)ξ通過斯托克斯定 律，即，€ = 6：n：ria與洛劑粘度η和a相關(guān)。
[0092] 在常規(guī)基于格林函數(shù)的方法中，明確地計(jì)算出M;所得的用于確定流體速度的矩 陣-向量-運(yùn)算需要0(N2)運(yùn)算。此外，對于非周期性的域，必須納入合適的邊界條件，以正確 計(jì)算速度;例如，對于無滑移邊界，U(X)=O tJendre jack等2'57'62^64將采用有限元法(FEM)的 解法強(qiáng)加邊界條件，其中，二次的尺寸變換限制對于小系統(tǒng)的分析。HernSndez-〇rt i z等65歸 納了Mucha等66開發(fā)的方法，其衡量為(KN^log N)，但局限于縫幾何學(xué)。存在允許在周期性 的域中通過O(NlogN)計(jì)算來計(jì)算M · F的其它方法。例如，存在Ewald加和和Particle-MeshEwald(PME)方法，其基于用于由集中力的周期性陣列驅(qū)動的史托克斯流的Hasimoto 67 解法。在該工作中，流體速度(M · F)采用由Hernandez-Ortiz等25-31'68引入的O(N)GGEM計(jì)算。 GGEM生成M · F而沒有M的明確結(jié)構(gòu)，并且，當(dāng)與B · dW的Fixman69'?中點(diǎn)整合算法和Fixmann 切比雪夫多項(xiàng)式近似值聯(lián)合時，其允許我們通過有效O(N)無矩陣公式26_29適時地設(shè)計(jì)出鏈。 該方法及其實(shí)施的詳細(xì)內(nèi)容將在下文中描述。
[0093]離子強(qiáng)度通過DNA磷酸酯主鏈上的電荷之間的靜電相互作用與納米縫壁的相互作 用來影響DNA構(gòu)象。針對德拜長度(K'篩選這些相互作用，由K2 = 2NAe2I/￥kBT定義(其中Na 是阿伏加德羅氏數(shù)，e是電子電荷，I是離子強(qiáng)度，ε〇是自由空間的介電常數(shù)，且ε是水的介電 常數(shù)）。隨著因離子強(qiáng)度的降低（1.0至0.1 lmM)所致的德拜長度的增加(從10到30nm)，分子 的持續(xù)長度因主鏈樣電荷排斥和通道的有效高度的降低（其進(jìn)而歸因于表面-DNA電荷排 斥)而增加。Odijk34和Skolnick與Fixman72(OSF)已經(jīng)理論地估計(jì)了蠕蟲狀聚合電解質(zhì)卷曲 的持續(xù)長度（Ip)如何受到短程靜電勢的影響。Baumann等通過對DNA大分子73的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 他們的理論預(yù)測，實(shí)現(xiàn)了采用以下形式的表達(dá)式的定量預(yù)測
[0095] 其中1p,q是對應(yīng)于完全篩過的靜電貢獻(xiàn)(electrostatic contribution)的固有持 續(xù)長度（lp,〇 = 50nm)〇
[0096] 在我們的實(shí)驗(yàn)中，啞鈴分子的持續(xù)長度范圍是82.4-358nm。盡管OSF理論的預(yù)測已 引起關(guān)注 74,已知OSF對于離子強(qiáng)度方面的持續(xù)長度給出正確的尺寸變換73,75。如早先所提 及的，離子環(huán)境也在限域中起主要作用，因?yàn)檠b置的表面具有1.1-1.3e/nm 2的電荷密度，含 其本身的德拜長度。我們的BD模擬不納入與壁的直接靜電相互作用;而是，該模型經(jīng)參數(shù)化 以考慮持續(xù)長度的變化，并且根據(jù)該德拜長度來修改壁-排除體積。注意，我們目前正執(zhí)行 完全HI-靜電DNA模型，以更準(zhǔn)確地考慮這些作用，并且將在未來呈現(xiàn)結(jié)果。該模型參數(shù)化采 用大容量人-〇嫩的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行;我們采用1^ = 2]^111具=0.7以111，〈3> = 1.5以111，11) = 53111]1于1 = 10.798mM，和在43.3cP溶劑中于23°C47下為02 = 0.0115以1112/8的2丨_擴(kuò)散系數(shù)(!11鏈）（注意， 實(shí)際粘度(?)要低得多）。
[0097] 然后采用尺寸變換自變數(shù)來獲得不同離子強(qiáng)度下的模型參數(shù)：
[0099] 其中ω~k-kic-HogWffK-4是DNA的有效直徑76'77,而V eff是有效DNA線電荷78'79。 UD模型經(jīng)后續(xù)參數(shù)化以產(chǎn)生離子強(qiáng)度和持續(xù)長度指定的必要尺寸變換；因此，珠-珠排除體 積的范圍被修改成以遵循公式13中給定的尺寸變換54,同時增加珠-壁排除體積范圍， 以算入壁德拜長度。
[0100] 對于納米限域的DNA啞鈴的理論考量
[0101] 采用分析的理論來提供對于納米限域的DNA分子的動力學(xué)性態(tài)的解釋。
[0102] 瓣的自由能。如果我們暫時忽略納米縫的開口，我們可看到啞鈴的一個瓣內(nèi)的DNA 鏈，其呈現(xiàn)為被硬光滑壁限制的伸直長度的長的柔性卷曲。已知兩端固定的卷曲的分配函 數(shù)是自由空間中的高斯函數(shù)減去像電荷誘導(dǎo)的其鏡像形式 8<Μ?2(如果鏈?zhǔn)抢硐氲模┙o定的。 這是因?yàn)槠渲翟诒谔幈仨殰p至零。在一個端點(diǎn)的構(gòu)型集成，衍生出分配函數(shù)G(z;s)，其中ζ 是瓣的另一端到壁的距離，并且所述瓣由長度A = 2M^s/A庫恩(Kuhn)區(qū)段組成。G實(shí)際是 z/si/2Ai/2的函數(shù)，僅其對于z<<si 2Al/2減至81
[0104] 納米縫的開口面積是D Xh(h< <D)。如果z>h，等式14是嚴(yán)格有效的。此處，h = 0 (Ip)，從而納米縫中的DNA(具有零或幾乎沒有后對折(back fold))通過短插入DNA區(qū)段(其 描述具有挑戰(zhàn)性)結(jié)合至瓣(z>~h)。然而，后者的自由能可忽略不計(jì)，由此瓣的自由能表達(dá) 如下
[0106]如果總伸直長度L的DNA迀移通過納米孔而不是納米縫，那么等式15獲得總自由能
[0108]如 Sung 和 Park83 所論證。
[0109]如果瓣是不對稱的，則存在力
[0111] 該力作用于DNA上，驅(qū)動其移出納米孔。當(dāng)DNA在偏轉(zhuǎn)范圍條件內(nèi)移動通過納米縫 時，相似力將起主要作用，前提是存在兩個瓣。排除體積的作用相當(dāng)弱；其僅改變公式15中 的數(shù)字系數(shù) 81。
[0112] 對稱的啞鈴。有興趣研究對稱的啞鈴的平衡。如果我們假設(shè)納米縫是長的，并且忽 略靜電，我們可以從等式15得出DNA的總自由能。
[0114] 對于跨越長度ls(；i ? gq的納米縫的伸展的DNA，我們已添加理想的鏈項(xiàng)。長鏈 沿通道往回和往前滑動，并具有全局持續(xù)長度g<<ls。因此，DNA上的力
[0116] 不等于零;嚴(yán)格對稱的啞鈴構(gòu)象無法在平衡中存在。
[0117] 兩個瓣必須縮回納米縫。Farkas等84已在先前強(qiáng)調(diào)了單一瓣的自由能的反直覺 (counterintuitive)性質(zhì)。分離的鏈經(jīng)歷離開壁的偏轉(zhuǎn)力（s是常數(shù)，但z在公式14中變得更 大）。然而，對于附至納米縫中的DNA區(qū)段的瓣，z = h固定不變，并且s是可變的。我們注意到， 公式19中由瓣產(chǎn)生的熵力一般極弱。
[0118] 排除體積作用和無穿流(Nondra i n i ng)限制。圖6中使用DNA樣品的物理性質(zhì)與漸 近范圍條件有多么一致?排除體積參數(shù)zel是對于兩個Kuhn區(qū)段之間的排除體積作用的度 量85。
[0120] 其中，DNA有效直徑是 ω =74.9nm(I = 0.51mM)〇
[0121] 總持續(xù)長度等于113.5nm(來自公式12)。因此，圖6中DNA樣品的Zei范圍是2.5-5.0 (分子大小范圍介于146-582kb)。排除體積作用可視為接近漸近(z el> > 1)。
[0122] 如果DNA分子被視為懦蟲樣鏈，并具有流體動力學(xué)直徑d~2nm，則穿流(draining) 性質(zhì)取決于參數(shù)Ol Jamakawa和Fujii在其著名研究中已對平移摩擦系數(shù) 開發(fā)出一套理論86。此處，DNA卷曲顯示出足夠長，從而，其流體動力學(xué)有效地處于非穿流限 制中。
[0123]納米限域介導(dǎo)的彈出。在其中僅存在單一瓣的情況中，DNA從納米縫彈出，因?yàn)樵?剩下的瓣中納米限域的DNA和其等同物之間存在顯著的自由能差異8749 Aurkhardt在納米 縫中的DNA鏈的自由能表達(dá)式中通過數(shù)字方式計(jì)算出了系數(shù)Cf。
[0125] 其中C1= 1.1036且x = L_s。很明顯，這通常會壓倒來自瓣(等式15)的貢獻(xiàn)，并且鏈 上的力/s = - 3 FcL/'0X恒定。
[0126] DNA受力移出納米縫;力f必須克服DNA上的流體動力學(xué)摩擦，其在此處應(yīng)用的離子 條件下可被有效地視作直桿?？v向尺寸上的摩擦系數(shù)可計(jì)為53
[0128]這獨(dú)立于D，因?yàn)榱黧w動力學(xué)中的上限截止值是較小的標(biāo)度h，其本身遠(yuǎn)大于d。因 此，對于第一近似值，滑動DNA的運(yùn)動方程可表達(dá)為
[0130]隨著DNA的彈出，瓣的大小增加，但其上的摩擦力可在公式23中忽略不計(jì)。從先前 的部分，我們知曉其大小R(s)規(guī)模為s3/5,從而，我們得出dR/dt = -3/5(R(t)/S(t))dx(t)/ dt。此外，在非穿流限制中，擴(kuò)展的瓣上的摩擦系數(shù)是riR(t)，因此，瓣摩擦是高階項(xiàng)。另一個 問題是，縫中的整體流體動力學(xué)的適用程度如何。證據(jù)顯示，對于極緊的二氧化硅納米縫(h 約等于20nm)，該假設(shè)可能存在問題91'92。在我們的情況中，也預(yù)期PDMS納米縫(緊度較低)更 為順滑，盡管我們感覺對于摩擦大小的徹底研究在未來是有保證的。
[0131]等式23易解，并且獲得如先前8749呈現(xiàn)的拋物線方程
[0134] 已假設(shè)DNA在t = 0時填充整個納米縫。如果我們設(shè)定h = 0 .lym，D = lym，lp = 0.1135以111兒=284111，11；5 = 1〇?且(1 = 211111，我們計(jì)算出力|;1^|=131^1'/^111，和彈出時間1^ = 128。 后者與實(shí)驗(yàn)中從納米縫彈出的T4DNA分子的時間呈良好一致。暫時結(jié)論是，整體流體動力學(xué) 實(shí)際上適應(yīng)于納米縫中。相反，發(fā)現(xiàn)在Mannion等89的直角二氧化娃納米通道中的DNA上的實(shí) 驗(yàn)測得的摩擦是通過類似于公式22的表達(dá)式預(yù)測的值的五倍。該差異尚未得到解釋。
[0135] 瓣移位。對于柔性聚合物鏈通過納米孔的移位已進(jìn)行多項(xiàng)計(jì)算和分析研究，如近 期綜述所述93。在我們的實(shí)驗(yàn)中，納米縫中的DNA伸展是極高的，因此我們認(rèn)為似乎合理的 是，DNA瓣的移位動力學(xué)應(yīng)極其相似于納米孔裝置中的情況。將需要進(jìn)行所有鏈波動的完全 分析以在未來證實(shí)這一點(diǎn)。
[0136] 通常，鏈移位通過納米孔需要的時間T1恒量為基于區(qū)段數(shù)量N的冪次定律，即，
[0137] Tl~Ne (26)
[0138] 主要目的曾經(jīng)是準(zhǔn)確計(jì)算β，但這產(chǎn)生了相當(dāng)大的爭論93。這超出了本研究的范圍， 盡管我們在表1中對于β已經(jīng)總結(jié)出若干代表性的預(yù)測。
[0139] 表1.瓣移位時間τι~Νβ的指數(shù)β與區(qū)段^數(shù)目的函數(shù)關(guān)系
[0142] a在受力移位中，時間與力成反比。此處選擇排除體積指數(shù)V等于3/5。
[0143] 在無偏性移位中，Chuang等94論證了不能將聚合物鏈視作跨越公式15給定的熵障 礙的單一顆粒擴(kuò)散。通過納米孔的擴(kuò)散是集體的，并且跨越距離R~S v(瓣的大小)呈Rouse 樣。然后，應(yīng)將移位時間^變換規(guī)模為NR2(N)~N1+2v(參見表1中的條目）。隨著流體動力學(xué)相 互作用，與N成比例的摩擦系數(shù)減少至N v~R。
[0144] 近期，已有人提出該簡單設(shè)定(scenario)應(yīng)被修改95。納米孔(或納米縫)的存在暗 示移位的動力學(xué)是強(qiáng)烈不均的?？缭娇椎膮^(qū)段的擴(kuò)散造成兩個瓣之間的張力不平衡。受這 些記憶效應(yīng)影響的移位時間有效地變得更長(參見表1)。
[0145] 當(dāng)瓣上的延伸力f足夠大(f R(s)>kBT)時，移位變?yōu)楸黄?，并且^與€成反比。我們 已經(jīng)確證了表1的針對該情況的無記憶效應(yīng)的條目，因?yàn)槠渑c早先的估計(jì) 96不一致。我們的 論證基于消耗率dF/dt。一方面，這等于納米孔開口處的鏈速度V1乘以將瓣卷入的力f。根據(jù) 瓣的半徑R~S v，我們而知曉\^ = -(18/(^ = -(8八1〇(11?/(11：。另一方面，收縮的瓣中的1?01186限 制內(nèi)的消耗率由Nf〇(dR/dt)給定，其中f Q = G〇(dR/dt)是對于區(qū)段的典范力（其中摩擦系數(shù) 為ζ〇)。區(qū)段的典范速度是dR/dt。兩種率必須相等，由此獲得表1中的條目。記憶效應(yīng)產(chǎn)生非 平凡(nontrivial)指數(shù) 97,這也示于表1中。
[0146] 結(jié)果與討論
[0147] 啞鈴形成完全伸展了 DNA分子，并且需要流體動力學(xué)考量。利用實(shí)驗(yàn)和模擬方法， 我們拓展了：除僅來自納米限域的貢獻(xiàn)以外，彈性和流體動力學(xué)貢獻(xiàn)于DNA伸展(源自其自 身卷曲（啞鈴瓣））的想法，這將大幅增強(qiáng)DNA延長。我們通過策略性地使DNA分子穿過納米 縫，采用仔細(xì)定時的電脈沖，在我們的納米縫裝置(示于圖1)中創(chuàng)造了DNA啞鈴。調(diào)節(jié)條件， 以允許DNA端占據(jù)耦合納米縫入口的兩個微通道，產(chǎn)生了包含無規(guī)卷曲的啞鈴瓣。所述裝置 的納米縫部分內(nèi)的DNA伸展通過熒光強(qiáng)度測量來評估，并且將同一分子的納米縫部分與微 通道部分做比較:S/L= lsfm/Smf s;其中fm是整個分子的整合的熒光強(qiáng)度，f 4P1S是縫中的分 子部分的熒光強(qiáng)度和長度，且Sm是分子的已知長度(μπι;經(jīng)染料校正）。
[0148] 我們預(yù)期離子強(qiáng)度會通過對于持續(xù)長度或聚合物硬度的靜電作用，以及裝置具有 的靜電環(huán)境來影響DNA伸展5。因此，我們通過改變同時包圍樣品和裝置的緩沖劑離子強(qiáng)度 評價了這些因素對于DNA伸展的共同作用。圖3顯示DNA伸展，采用Τ4和λ-噬菌體DNA，作為離 子強(qiáng)度的函數(shù)，I e [ 0.11，1.0 ]mM，來自實(shí)驗(yàn)和BD模擬（I e [ 0. 5，10 ]mM;參見材料和實(shí)驗(yàn)方 法）。隨著離子強(qiáng)度降低，納米縫中的DNA伸展增加，如先前由Jo等5報道的那樣。然而，本文 中，相比無啞鈴的分子納米限域(S/L = 0.62±0.08; 1 = 0.47mM)，啞鈴彈性力的附加聯(lián)合使 DNA伸展大幅增強(qiáng)了顯著的37% (S/L = 0.85 ±0.16; I = 0.51mM)。進(jìn)一步降低離子強(qiáng)度能夠 呈現(xiàn)完全伸展的（3/1=1.06±0.19;1 = 0.1111^)0嫩分子。我們采用人-0嫩作為已知大小的 熒光內(nèi)標(biāo)，在縫中進(jìn)一步驗(yàn)證了這些伸展估計(jì)結(jié)果，用于對λ-多聯(lián)體DNA啞鈴(限制部分）的 整合的熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化：. 87 ±0.14，N= 231; I = 0.48mM)，這與先前針對T4DNA獲得 的值(0.85 ± 0.16; I = 0.5ImM)相似。發(fā)現(xiàn)針對T4和λ實(shí)驗(yàn)的伸展值一致（圖3)，表示伸展測 量方法的一致性和再現(xiàn)性。
[0149] 圖3還通過與實(shí)驗(yàn)相比的BD模擬顯示我們的理論預(yù)測的結(jié)果。完整起見，顯示用于 包括波動流體動力學(xué)相互作用(HI)的計(jì)算，以及當(dāng)所述相互作用忽略不計(jì)時的計(jì)算(無穿 流模型，F(xiàn)D)的結(jié)果。注意，鏈的部分處于納米縫中，并且此處，預(yù)計(jì)HI經(jīng)篩過并起次要作用。 然而，如圖3所示結(jié)果指示，HI對啞鈴動力學(xué)有顯著貢獻(xiàn)，并且大幅影響分子伸展。這可通過 微通道中（縫外）的瓣的Zimm動力學(xué)影響插入納米縫內(nèi)的鏈區(qū)段的動力學(xué)來解釋。兩種趨勢 在模擬結(jié)果均可被辨別:對于I>1.0 mM，伸展接近常數(shù)，而對于I <0.74mM，觀察到突然的增 加。在后者范圍內(nèi)，鏈的持續(xù)長度達(dá)到與納米縫高度(約IOOnm)相當(dāng)?shù)闹?，由此在Odi jk范圍 條件中設(shè)置了限域水平。注意，這些離子強(qiáng)度條件下的限域大小小于l〇〇nm，因?yàn)楸谟衅渥?己的離子云。此時，潛在的物理學(xué)變得復(fù)雜，這歸因于與鏈和壁相關(guān)聯(lián)的離子云之間的相互 作用。然而，一項(xiàng)主要作用是有效限域大小的減小，即，鏈持續(xù)長度增加和壁之間的"自由" 可用空間減少。我們的伸展模擬遵循實(shí)驗(yàn)觀察到的趨勢，但略微向下預(yù)測（$5%)實(shí)驗(yàn)數(shù) 據(jù)。我們將差異歸結(jié)于我們的模型中并不包括的完全靜電相互作用。還應(yīng)注意，不可能采用 現(xiàn)有模型用于實(shí)驗(yàn)中考慮的兩種最低離子強(qiáng)度條件，因?yàn)槌掷m(xù)長度高于限域（l P>l〇〇nm)。 這些點(diǎn)之外，模擬揭示啞鈴介導(dǎo)的伸展之后潛在的物理現(xiàn)象，并且最重要地，瓣處的HI作用 和靜電相互作用之間的關(guān)鍵相互影響協(xié)助限制并延長DNA分子。
[0150] 圖4提供了不同方向上的分子伸展的比較，均在存在和不存在HI的情況下進(jìn)行。納 米縫之外，伸展以全部方向進(jìn)行，S1(軸向）、&(垂直)和&(限域)處于范圍30-32%內(nèi)（其中 Si= I最大(Xi)-最小(Xi) I i，對于鏈i的第i向）。因此，Si是在各方向上具有最長分離的鏈的 兩個區(qū)段之間的距離。不同的是，當(dāng)納入HI時，納米縫中的區(qū)段顯示三個方向中的明顯差 異。第一，軸向S 1I的伸展在納入HI的情況下總是高于不納入HI的情況(FD鏈hHI S1伸展總 是低于總伸展約5-7%，指示其為總伸展的主要貢獻(xiàn)者。另一方面，具有55-60%的離子強(qiáng)度 范圍時，F(xiàn)D S1伸展保持恒定。納米縫中的垂直方向的S2伸展，在無 HI的情況下介于范圍20-25% (Π )鏈）；這與納米縫外觀察到的情況相似。納米縫中的HI S2伸展是10-15%。垂直伸展 中的該變化指示納米縫中的hi和ro分子構(gòu)象之間的明顯差異。ro鏈沒有"感覺到"啞鈴瓣， 由此允許鏈在納米縫寬度方向上進(jìn)行偽隨機(jī)的步移（圖4中的底部鏈）；不同的是，HI啞鈴顯 示"集合的"性態(tài)，其增加在軸向方向上的伸展，并阻止鏈在納米縫寬度方向上自由移動;凈 結(jié)果是生成"剛性"啞鈴（圖4中的上部鏈）?？傊瑔♀彉?gòu)象導(dǎo)致偽納米通道中的DNA分子延 長。通過我們的低離子強(qiáng)度條件增強(qiáng)的靜電相互作用，使DNA分子的限域更加明顯。注意，德 拜長度范圍從IlmM時的3nm到0.1 lmM時的30nm。重要的是，在低離子強(qiáng)度下，德拜長度與納 米縫高度相當(dāng)，這是不可被忽視的作用98。該靜電作用協(xié)同聯(lián)合集合的HI和納米限域，大幅 增強(qiáng)了 DNA伸展。
[0151] 德拜長度考量。鑒于這些模擬結(jié)果(其強(qiáng)調(diào)了裝置壁對DNA伸展的靜電作用），我們 通過實(shí)驗(yàn)研究了德拜長度如何影響納米限域"，該研究采用TIRF顯微鏡(參見材料和實(shí)驗(yàn)方 法），通過研究帶負(fù)電的膠乳珠(24nm)在納米縫中的擴(kuò)散動力學(xué)來進(jìn)行。想法是，珠擴(kuò)散率 將可測量地被擾亂，作為離子強(qiáng)度的函數(shù)，這歸因于珠（24nm)和裝置（22nm，I = 0.20mM; 3nm，I = IOmM)的應(yīng)計(jì)的德拜長度。對于0.1997mM和9.987mM NaCl，平均周期性可檢測地不 同，即，分別為8±3s和12±4s(N=16珠），由此暗示德拜長度會有效限制納米縫的高度（即， 珠擴(kuò)散在更低的離子強(qiáng)度下更受限制）。這些觀察結(jié)果證實(shí)了一旦離子強(qiáng)度降低，限制方向 上的鏈運(yùn)動性的突然降低。在較高離子強(qiáng)度條件下，限制方向上的模擬的DNA運(yùn)動性(擴(kuò)散） 是約90nm，其在較低離子強(qiáng)度條件下變?yōu)闃O小的l-5nm〇
[0152] DNA大小如何影響啞鈴伸展和弛豫時間。圖5顯示DNA伸展作為分子大小的函數(shù) (97kb-582kb;I = 0.51mM)，采用一系列λ多聯(lián)體。注意，一旦分子伸直長度超過納米縫長度 的兩倍以確保確信的啞鈴形成，相同裝置可用于任何大小的分子的均一呈現(xiàn)。該圖中，包括 實(shí)驗(yàn)和模擬的結(jié)果。對于啞鈴構(gòu)象，我們計(jì)算了納米縫內(nèi)的鏈區(qū)段的軸向位置的平均方差。 重要的是，該迀移率指示對于納米縫內(nèi)部的帶標(biāo)記DNA特征的光學(xué)測量的可靠程度;模擬結(jié) 果顯示對于1 = 111^，迀移率為150±2(^?，且對于1 = 0.511111為100±2(^?。我們注意到，最 終，啞鈴的兩個瓣不使構(gòu)象穩(wěn)定化，甚至當(dāng)啞鈴對稱時也是如此(參見理論考量部分）。
[0153] 通過以與伸展實(shí)驗(yàn)相同的方式荷載分子來分析啞鈴分子的有效弛豫時間。然而， 在動力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，一些分子必須在7h時程中采用衰減照明成像，以防止光致斷裂(其將摧毀 啞鈴）。明亮的啞鈴瓣限閾于圖像數(shù)據(jù)中供于其分析，使得納米縫中連接DNA主鏈不可見。觀 察到分子的最末時間點(diǎn)確定縫中啞鈴的弛豫時間;我們?nèi)缓髮o定分子大小的全部弛豫時 間平均化(無關(guān)相對的瓣大小）。通過施加電場來檢查測量完成后的留下的分子的偽表面附 著;附著的分子不包括在我們的數(shù)據(jù)集中。并且，排除SlOOkb的分子，因?yàn)樗鼈冃纬煽焖偎?弛的小瓣。弛豫時間是單一 DNA瓣的移位時間加上DNA鏈從納米縫彈出的彈出時間。后一項(xiàng) 時間顯示極短，通常為約10秒。這與我們基于熵彈出而理論估計(jì)的12秒非常一致;納米縫中 的水性溶劑的粘度似乎與整體的粘度相近。彈出時間是簡單、細(xì)微的修正，我們已從弛豫時 間扣減該項(xiàng)。所得的移位時間繪于圖6,針對λ多聯(lián)體（黑色）、T4(白色），和花中間原體 (M. f Iorum)(灰色)DNA分子。依賴性變量不是DNA分子的實(shí)際分子量，而是啞鈴的兩個瓣的 分子量(Ml)，因?yàn)槲覀円褟闹锌蹨p納米縫中的DNA質(zhì)量。該校正對于較小的質(zhì)量而言是有意 義的。圖6中，我們已將瓣移位時間與冪定律τ~MI 1·23擬合(如果我們就原始弛豫時間繪圖， 指數(shù)將是1.71)。啞鈴瓣熒光強(qiáng)度隨時間波動直至一個瓣滑入納米縫(箭頭b)，然后，該分子 通過納米縫進(jìn)入微通道底部，并離開進(jìn)入微通道(箭頭c)。出于本申請目的，對于小圖是上 述運(yùn)動的時間推移這一理解要比圖6的小圖中的詳細(xì)內(nèi)容更為關(guān)鍵。
[0154]我們的指數(shù)1.23排除了無偏性移位（參見表1，其中我們還顯示DNA鏈?zhǔn)怯行Х谴?流的，并且完全發(fā)揮了排除體積效應(yīng)）。其與對于納米孔情況中具有流體動力學(xué)相互作用的 受力移位預(yù)測的指數(shù)1.13相當(dāng)97。然而，目前，難以排除不具有記憶效應(yīng)的移位的理論。整體 上，長DNA鏈的摩擦性質(zhì)可以是非穿流的。然而，對于附著至納米縫或納米孔的瓣，聚合物構(gòu) 象是高度不均勻的?？烧撟C鏈的部分符合Rouse動力學(xué)，因此預(yù)測的指數(shù)將介于0.8和1.2 (表1)。我們的指數(shù)1.23也似乎與Stom等 1(XW()2對于DNA通過硅氧化物納米孔的移位所檢測 到的值1.27-致。然而，其離子強(qiáng)度是高的（I = IM)，因此排除體積弱，并且其鏈接近于理想 (表1中v=l/2)。我們自己的（未公開)分析顯示，圖6中的上部的瓣實(shí)際上在似乎恒定的外 力下移位進(jìn)入納米縫。該力的來源目前尚不清楚;其不可能是熵來源，如在理論考量中所討 論，因?yàn)樵摿O弱。這些中度的力導(dǎo)致冗長的移位和弛豫時間。
[0155] 在文獻(xiàn)liat^lt35中關(guān)于de Gennes和Odijk限域范圍條件之間的轉(zhuǎn)換存在一些爭論 或困惑。本文的一組實(shí)驗(yàn)協(xié)助明晰上述爭論中的一個問題，因?yàn)槠湟言跇O低鹽濃度中進(jìn)行。 離子強(qiáng)度的降低具有兩個主要后果：由裝置表面的德拜長度所致的增強(qiáng)的有效限域，和鏈 持續(xù)長度的增加。我們的實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示，一旦有效限域等于鏈持續(xù)長度，即可實(shí)現(xiàn) Odijk范圍條件。這一特征明顯與建議有效DNA直徑，ω，對de Gennes-Odijk轉(zhuǎn)換具有主要 作用的其它結(jié)論11矛盾。然而，該矛盾明顯歸因于參考文獻(xiàn)11中的離子強(qiáng)度遠(yuǎn)高于本文所用 的離子強(qiáng)度。Wang等 1(36已嘗試顯示參考文獻(xiàn)11中的結(jié)果如何與中間的范圍條件擬合。圖3包 括對于de Gennes理論（S/L~（ω lp)1/3(Dh)_1/3)和Odi jk理論（S/L~1_[ (D/lP)2/3+(h/lP )2/3])(對于D= ΙμπιXh = IOOnm納米縫)的伸展預(yù)測。初始時，可從圖中推斷該實(shí)驗(yàn)并不遵循 任何尺寸變換范圍條件;然而，我們必須想到啞鈴構(gòu)象會仿效納米通道限域。換言之，DNA啞 鈴"感覺"有效、較低的通道寬度。一旦納入該效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)遵循涵蓋陰影區(qū)域的Odijk預(yù)測（圖 3);即，對于31 1\11納米縫和11\11通道的0(^1^預(yù)測。如同1'.0(^1^ 16'33'34指出的，他的理論并 不包括嚴(yán)格的靜電相互作用；因此，他的方法在本文考慮的較低離子強(qiáng)度條件下將會稍微 向下預(yù)測伸展。我們目前開發(fā)了一種改進(jìn)的分子模型，以考慮完全靜電相互作用 25。一旦啞 鈴形成，并且分子以完全伸展的方式呈現(xiàn)，自然的問題是檢測納米縫中鏈的迀移率和啞鈴 的弛豫時間。然而，本文報道的啞鈴動力學(xué)顯示將能支持利用成像的基因組分析方案(其需 要一致伸展的DNA分子)的弛豫時間。向低離子強(qiáng)度溶液添加蔗糖并降低溫度（即，荷載后改 變)將提高溶液粘度并延長啞鈴分子的弛豫時間。
[0156] 現(xiàn)代基因組分析需要由DNA大分子獨(dú)特呈現(xiàn)的長范圍的序列信息。同樣地，本文采 用緊密聯(lián)合的實(shí)驗(yàn)和模擬方法提供的結(jié)果已提供用于設(shè)計(jì)和執(zhí)行較新基因組分析系統(tǒng)的 實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。這些進(jìn)展可以大幅增強(qiáng)我們對基因組結(jié)構(gòu)的理解的方式提供用于完全放 大極長DNA分子本身提供的信息優(yōu)勢的手段。
[0157] 附錄
[0158] 通用幾何學(xué)Ewald樣方法和O(N)算法25-31。流體速度M · F采用Hernandez-Ortiz 等28引入的0 (N) GGEM計(jì)算。對于GGEM的簡要描述以對于Nb點(diǎn)力的分布驅(qū)動的流來考慮史托 克斯系統(tǒng)方程起始，

[0161]其中η是流體粘度，且力密度是
[0163] 其中fi是在?點(diǎn)對流體施加的力。
[0164] 27的方程可基于StokeSlet28'1()7來撰寫，并且并入M · F結(jié)果。如果清楚地計(jì)算，該 結(jié)果是需要〇(N2)計(jì)算的矩陣-向量運(yùn)算。GGEM針對不進(jìn)行矩陣-向量操作的任何幾何學(xué)(具 有合適的邊界條件)隱含地確定結(jié)果。其始于對公式27中力-密度表達(dá)的重述，P(X)=P 1(X) +Pg(X)，采用光滑函數(shù)g(x)，類似于常規(guī)Particle-Mesh Ewald法這篩出函數(shù)滿足因 素
[0165] /^sEa's]g(x)dx = l (29)
[0166] 通過史托克斯方程的線性，將流體速度寫為兩部分的加和，對于各力-密度采用分 開的方程。"局部密度"
[0168]驅(qū)動局部速度，U1(X)，其基于對未結(jié)合的域的假設(shè)來計(jì)算：
[0170] 其中Gi(X)包括自由空間格里斯函數(shù)，或Stokeslet，減去獲自Stokes等式方程的 光滑化的Stokes I et，其中強(qiáng)迫項(xiàng)通過光滑函數(shù)g (X)來修改。
[0171] 對于史托克斯方程，我們發(fā)現(xiàn)由下式定義的修改的高斯光滑函數(shù)
[0173]產(chǎn)生關(guān)于&^)的簡單表達(dá)式：
[0175] 因?yàn)镚1(X)在長度標(biāo)度α-l上呈指數(shù)衰減，在實(shí)踐中，可計(jì)算局部速度，如同常規(guī) Ewald方法中的那樣，僅通過考慮各粒子1的鄰近因素5Μ11。
[0176] 對于本工作，點(diǎn)-粒子近似值是不希望的;具體而言，隨著鏈大小的增加，粒子重疊 (具有非物理速度)的概率將增加。為了避免該問題，珠流體動力學(xué)半徑，a，可用于確定給出 非單一速度的新光滑化的力密度。該通過將Stokeslet用規(guī)則化的Stokeslet替代來實(shí)現(xiàn)， 采用相同修改的高斯，其中α被ξ替代，其中ξ~εΓ1，產(chǎn)生
[0178]其中，上標(biāo)R表示規(guī)則化的力密度。對于1^ = 38/(31)1/2,最大流體速度等于半徑a的 粒子的流體速度并且對迀移率保持正定28,112。
[0179]全局速度，Ug(X)，歸因于力分布Pg(X)，其通過下式給定
[0181] 對于通用域，我們發(fā)現(xiàn)史托克斯等式方程在數(shù)字上需要m(x)+Ug(x)滿足合適的邊 界條件。在無滑動邊界，我們要求u g(X)=-m(X)。對于與周期性的邊界條件相關(guān)的問題，可 采用傅立葉技術(shù)來確保全局速度U g(X)的周期性。局部速度的周期性，U1(X)，采用最小成像 法則來獲得。
[0182] 在該情況中，全局貢獻(xiàn)采用FEM公式來解得，其中對于速度采用8-節(jié)實(shí)體單 元27，113,而對于對應(yīng)的全局壓強(qiáng)采用常數(shù)單元。線性系統(tǒng)的解通過快速LU分解解算器對于 稀疏矩陣SUPER-LU 114'115進(jìn)行。矩陣的LU分解僅在模擬開始時進(jìn)行；在時間推進(jìn)過程中，唯 一必要的計(jì)算是回代(back-substitution)，使GGEM算法高度有效(~O(N)，鑒于矩陣的稀 疏特性）。鑒于GGEM解法獨(dú)立于α，對于該參數(shù)的合適的選擇基于對于計(jì)算的時間的最優(yōu)化。 在全局計(jì)算中，為了獲得準(zhǔn)確的解法，篩的大小必須小于光滑函數(shù)的規(guī)模，其為cT 1。因此，篩 的分辨率規(guī)模為M~α3;各個回代尺度的成本是M2,導(dǎo)致總?cè)殖杀镜囊?guī)模為α 6。在局部計(jì)算 中，必須計(jì)算處于鄰接列表中的所有的對(pair)的貢獻(xiàn)，該列表通過局部格林函數(shù)的衰減 來確定。局部格林函數(shù)在距離CT 1上衰減，因此各粒子的鄰接物數(shù)量的規(guī)模為NcT3。必須對所 有的對進(jìn)行該計(jì)算，其為粒子數(shù)目乘以每粒子鄰接物的數(shù)目，獲得局部計(jì)算成本，其規(guī)模為 N2cT3。對于α使總（局部和全局)計(jì)算成本最小化，獲得規(guī)模為acipt~N 2/9的最優(yōu)化的α，和規(guī)模 為〇(Ν4/3)的總成本。如果我們已經(jīng)選擇了不同的、線性方法用于解法(GMRES，雙輒法 116)，全 局成本的規(guī)模將為α3,導(dǎo)致α_~Ν1/3的最優(yōu)值和規(guī)模為O(N)的總計(jì)算成本。
[0183] 因?yàn)镚GEM產(chǎn)生M · F而不明確構(gòu)建M，希望時間-整合公式10而不需要該結(jié)果，即， "無矩陣"公式。Fixman69'?提出了一種方法，以時間-整合該系統(tǒng)而無需評價f/iR-D:
[0186] 僅剩的步驟是以無矩陣方式評價B-1 · dWc^nFixman71所述，這可通過Chebyshev多 項(xiàng)式近似方法完成，該方法僅需要矩陣-向量結(jié)果，并不需要矩陣本身。該方法已在無限的 或周期性的域中被實(shí)施26- 28,3()，62,64，117， 118;采用GGEM，可以直接一般化為任意域。
[0187]已通過一個或多個優(yōu)選的實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解由明確描述的那些產(chǎn) 生的許多等同方案、替代方案、變化方案和修改方案是可能的并在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0188] 參考文獻(xiàn)
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種微流體裝置，其包含： 第一微通道； 第二微通道； 在所述第一和第二微通道之間延長的納米縫，所述納米縫提供所述第一和第二微通道 之間的流體路徑； 核酸分子，其具有第一端部、第二端部，和位于所述第一端部和所述第二端部之間的中 部;和 位于所述納米縫和第一和第二微通道中的離子緩沖劑； 所述第一微通道包含所述納米縫的第一端附近的第一簇集區(qū)，且所述第二微通道包含 所述納米縫的第二端附近的第二簇集區(qū)，所述第一簇集區(qū)包含第一端部，所述第二簇集區(qū) 包含第二端部，并且所述納米縫包含所述中部， 所述核酸分子具有大于所述納米縫的納米縫長度的伸直長度，并且 所述離子緩沖劑的離子強(qiáng)度與所述納米縫和核酸分子的靜電或流體動力學(xué)性質(zhì)聯(lián)合 提供加和的德拜長度，所述加和的德拜長度大于或等于納米縫高度或納米縫寬度，其中，所 述納米縫高度或納米縫寬度是所述納米縫的最小物理尺寸。2. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述納米縫的納米縫寬度小于或等于Iwii或 納米縫高度小于或等于IOOnm03. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述納米縫長度小于或等于所述核酸分子伸 直長度的一半。4. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述微通道中的至少一個具有一個或多個如 下特征:微通道寬度約為20μηι，微通道長度約為10mm，和微通道高度約為1.66μηι。5. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，所述裝置還包含溫度調(diào)節(jié)模塊。6. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述離子緩沖劑的溫度小于或等于20°C。7. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述離子緩沖劑還包含粘度調(diào)節(jié)劑。8. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述核酸分子具有至少約30秒的弛豫時間。9. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述核酸分子是DNA分子。10. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中，所述核酸分子的伸直長度是所述納米縫的 納米縫長度的至少兩倍。11. 一種使核酸分子在離子緩沖劑中伸展的方法，所述方法包括： 使所述核酸分子定位，以使所述核酸分子的中部占據(jù)納米縫，所述核酸分子的第一端 部占據(jù)納米縫的第一端附近的第一簇集區(qū)，并且所述核酸分子的第二端部占據(jù)納米縫的第 二端附近的第二簇集區(qū)， 所述納米縫、所述第一簇集區(qū)和所述第二簇集區(qū)包含所述離子緩沖劑， 所述核酸分子的伸直長度大于所述納米縫長度，和 所述離子緩沖劑的離子強(qiáng)度與所述納米縫和核酸分子的靜電或流體動力學(xué)性質(zhì)聯(lián)合 提供加和的德拜長度，所述加和的德拜長度大于或等于納米縫高度或納米縫寬度，其中，所 述納米縫高度或納米縫寬度是所述納米縫的最小物理尺寸。12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，使所述核酸分子定位包括:使所述核酸分子穿過 所述納米縫。13. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，使所述核酸分子定位包括:動電學(xué)驅(qū)動所述核酸 分子的中部進(jìn)入所述納米縫。14. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述納米縫的納米縫寬度小于或等于Ιμπι或納米 縫高度小于或等于IOOnm015. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述納米縫長度小于或等于所述核酸分子的伸直 長度的一半。16. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述微通道中的至少一個具有一個或多個如下特 征:微通道寬度約為20μηι，微通道長度約為10mm，和微通道高度約為1.66μηι。17. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述離子緩沖劑的溫度小于或等于20°C。18. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述離子緩沖劑還包含粘度調(diào)節(jié)劑。19. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述核酸分子具有至少約30秒的弛豫時間。20. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述核酸分子是DNA分子。21. 如權(quán)利要求11所述的方法，所述方法還包括對所述中部的至少部分成像。
【文檔編號】G01N33/487GK105934276SQ201480062363
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2014年9月12日
【發(fā)明人】D·C·施瓦茨, K·考納福斯基-謝弗, J·埃爾南德斯-奧爾蒂斯, T·奧代克, J·迪帕波羅, K·朱
【申請人】威斯康星校友研究基金會, 萊頓大學(xué), 芝加哥大學(xué)