一種與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的snp標(biāo)記及引物和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記及引物和應(yīng)用。檢測引物包括：ASSN1184FI、ASSN1184RI、ASSN1184FO、ASSN1184RO。利用本發(fā)明的與馬氏珠母貝生長性狀相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物，能夠擴(kuò)增出與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP基因型位點，再根據(jù)PCR擴(kuò)增電泳圖可直觀地篩選出生長優(yōu)勢個體用作后備親本進(jìn)行育種，實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種。
【專利說明】
一種與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記及引物和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物遺傳及分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與馬氏珠 母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記及引物和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 馬氏珠母貝是我國及世界上海水珍珠養(yǎng)殖的主要物種。我國自1965年成功地開展 了馬氏珠母貝人工育苗以來，海水珍珠產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為廣東、廣西及海南部分沿海地 區(qū)海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)之一。近10多年，我國海水珍珠的質(zhì)量和產(chǎn)量明顯下降，國際競爭力減 弱，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益下滑。究其原因，除了養(yǎng)殖環(huán)境惡化、養(yǎng)殖技術(shù)落后外，還有一個重要原因 是：多年來不注重種貝的選育和保留，缺乏優(yōu)良品種;種苗質(zhì)量參差不齊，育珠母貝性狀退 化，如生長慢、個體小型、育珠能力減弱等。為了我國海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，培育 適合我國海區(qū)養(yǎng)殖的馬氏珠母貝優(yōu)良品種已迫在眉睫。
[0003] 育種技術(shù)有雜交、選擇育種，生物技術(shù)育種及分子育種等多種方法。分子育種是目 前國內(nèi)外研究的熱點，是育種技術(shù)發(fā)展的主要方向，它具有高效、快捷的特點。分子育種離 不開分子標(biāo)記的開發(fā)，單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide PolymorphiSm,SNP)是由基因 組水平上單一堿基對變異引起DNA序列多態(tài)性(Sachidanandam et al. ,2001)，它是繼RFLP 和SSR分子標(biāo)記后發(fā)展起來的第三代分子標(biāo)記。滿足SNP的條件應(yīng)該是其中的一個等位基因 在群體中的出現(xiàn)的頻率應(yīng)為不小于l%(Kang et al.，2002)。這種變異包括單個堿基的轉(zhuǎn) 換（同型堿基互換）、顛換（異型堿基互換）、插入和缺失，但一般所指的SNP不包括后面兩種 情況。目前所發(fā)現(xiàn)的SNP，絕大部分都只有2種核苷酸，三種以上的核苷酸共存在一個種群中 幾乎不存在，因此SNP是二等位基因多態(tài)性。SNP標(biāo)記具有分布廣泛、遺傳穩(wěn)定和二態(tài)性等特 點，因此在人類的疾病的致病機(jī)制和治療、重要農(nóng)作物和家畜遺傳育種中取得了巨大的成 效。尤其是近幾年來，利用高通量R〇che454測序技術(shù)獲得大量SNP位點并進(jìn)行與性狀的關(guān)聯(lián) 分析及發(fā)現(xiàn)新基因的報道，表明SNP標(biāo)記已經(jīng)成為遺傳學(xué)及MAS主要的工具。而在水產(chǎn)養(yǎng)殖 動物中，利用SNP標(biāo)記進(jìn)行MAS育種技術(shù)還處在早期階段，如群體遺傳多樣性分析、品種鑒 定、性狀關(guān)聯(lián)分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位等遺傳育種領(lǐng)域方面。分子標(biāo)記的出現(xiàn)為 實現(xiàn)基因型選擇提供了可能，因為分子標(biāo)記的基因型是可以識別的。如果目標(biāo)基因與某個 分子標(biāo)記緊密連鎖，那么通過對分子標(biāo)記的基因型進(jìn)行檢測，就能夠獲得目標(biāo)基因的基因 型。因此，可以借助分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀的基因型進(jìn)行選擇，這就是分子標(biāo)記輔助選擇 (marker-assisted seIection ,MAS)。與常規(guī)育種方法相比，MAS具有明顯的優(yōu)越性，尤其是 對于那些難于測量、遺傳力較低和在后期才能表現(xiàn)得性狀，且MAS不易受環(huán)境的影響，沒有 性別和年齡的限制，因此，MAS可在早期進(jìn)行選擇，縮短世代間隔，進(jìn)而提高選擇的強(qiáng)度和育 種的效率(Lande and Thompson, 1990)。而目前，發(fā)掘與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo) 記還很少報道，本發(fā)明的目的是提供一種新的與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，提供 一種活體鑒定該SNP的方法，以利于進(jìn)行基因型選擇育種實踐，使基因型選擇育種技術(shù)具有 實際可操作性。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引 物。
[0005] 本發(fā)明的與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物，其特征在于，包括以 下引物：
[0006] ASSNl184FI:5 '-CGATTTGCTAGAAAGCCATTA-3 '；
[0007] ASSNl184RI:5 '-AATTTGTTACAACTTACCTATAATGCAA-3 '；
[0008] ASSNl184F0:5 '-GGTAAAACATTAACACGGATTGA-3 '；
[0009] ASSNl184R0:5 '-ATTGTAATGACTTACCTAAAACGGAT-3 '。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，其特征 在于，所述的SNP標(biāo)記的序列如SEQ ID NO. 1所示，全長為llOObp，所述的SEQ ID NO. 1所示 序列自5'端起第457位堿基為A或T，在SEQ ID NO. 1序列中用w表示該位點。
[0011] 具體如下所示：
[0012] GTGCATGTCCACTTGATGCGACCACTAAAACAGATGCAATAATTGCGAAAGATCGTGCCAAACTAAAATATTTCGAT CGCAAAGTGGTCGTGCACCAAATGAGGAGGGGGCTTTAAAAATGTGATGGCATTTCAGAGAAATATAACTTGGGTTG ATTTTGGTTAGATATGAGAAGGTAAAACATTAACACGGATTGATGGTATTTGGGACAGCTGAAAGTAGATATGAAAA ATAAATACATGTACTGGGTTCGTAGTGAATAAAGTGGAGGGAGGGATATTCAGTACCCTTGTAGTTTGACGTCTTGC TGTTTGACTGTGATGATGTTTTCATATTGTAGGAGATCGTGCTGGTAGTATTCTTTGGCCTGGAGTACGTAGTACGC TTATGGGCAGCAGGCTGTCGTAGTAAATACATTGGTGTTAGAGGACGTCTACGATTTGCTAGAAAGCCAATW(W為A 或T)TCCATTATAGGTAAGTTGTAACAAATTTAAGGTGTTGACCGCCGCCGCCCCCTCCTCTGTCATATCTCTTATG TCCGTCTCCCGATTCGTCTGTGTATTACAAAATGTTATAATCCCCACTAAGAGGCTCTAAATTTCTCCGACCGTTAG AGAGCAAATATCCGTTTTAGGTAAGTCATTACAATTTTTTAGCTTAGCTTCCCTTCCCTACCTAGTCAATGCCTTGT CCGTCTCTCATCTCGTCTGTGTATTATAGAAAACTGCTTTCTCCACACTGAGGCTCCCTATTTTCACCAACAGAGAG TTAGAACAAATATGAGATAGCCCCCTTCCCTTCCTGTCCCATCTCTTGTCCGTCTTTCAGTTTGTCTGTGTATTACA GAAAACTGCAACCTCCACTTGCATATGTAGAGGCTCCCAATTTTCACACACAGAGACACATGATTCGATATAAGAAT CATTAACTCTTTATGTCTTTTACCTTTGCAAATTGTCGTTATTTACGTCTGCAGGTCGACCAGAGCGTCCCGTTACT AGTAGATTAACTTTTTTTAGCAGTGTAAATAATCATGCGTGGAAAAAAGCGTCCTTACCATCTAAATGTCATCGTTA AAGCATCGAATCAATACGGTACGGGAACCGTo
[0013] 本發(fā)明的第三個目的是提供與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記在馬氏珠母貝 分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種檢測馬氏珠母貝具有生長優(yōu)勢的個體的方法，其 特征在于，通過對待測馬氏珠母貝中的上述與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記進(jìn)行檢 測，確定所述待測馬氏珠母貝是否為具有生長優(yōu)勢的個體，確定其是否作為后備親本進(jìn)行 育種。
[0015]優(yōu)選，具體步驟為：
[0016] a、提取待測馬氏珠母貝樣品基因組DNA;
[0017] b、采用上述的檢測引物 ASSNl 184FI、ASSN1184RI、ASSN1184F0、ASSN1184R0 對馬氏 珠母貝樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0018] C、根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對馬氏珠母貝樣品進(jìn)行基因型分型，當(dāng)只出現(xiàn)310bp大小1條 帶的為TT基因型，該馬氏珠母貝樣品判別為具有生長優(yōu)勢的個體，作為后備親本進(jìn)行育種。
[0019] 優(yōu)選，所述的PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為：25yL;PCR反應(yīng)體系如下：包含馬氏珠母 貝樣品基因組DNA 40ng，I X PCR Mixture，檢測引物ASSNl 184FI、ASSN1184RI各0 · 8μΜ， ASSNl 184F0、ASSNl 184R0各0 · 2μΜ，0 · IU Taq DNA酶，余量為水；反應(yīng)條件為：94°C，4min; 94 °C30s，57°C30s，72°C45s，35 個循環(huán)；72°C 延伸 lOmin。
[0020] 優(yōu)選，所述的提取待測馬氏珠母貝樣品基因組DNA是提取待測馬氏珠母貝樣品的 鰓組織的基因組DNA。
[0021] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種用于檢測與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記 的試劑盒，其特征在于，包括上述的與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物。 [0022]利用本發(fā)明的與馬氏珠母貝生長性狀相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物，能夠擴(kuò)增出 與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP基因型位點，再根據(jù)PCR擴(kuò)增電泳圖可直觀地篩選出生長 優(yōu)勢個體用作后備親本進(jìn)行育種，實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種。
【附圖說明】：
[0023]圖1是與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的擴(kuò)增電泳圖，其中泳道1-12和泳道 14-25為馬氏珠母貝樣品，13為DL2000Maker，條帶從上往下依次為2000bp，1000bp，750bp， 500bp，250bp，IOObp。
【具體實施方式】：
[0024]以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0025] 實施例1:
[0026]隨機(jī)取來自于同一群體的120個馬氏珠母貝個體，清洗干凈后，測量每個貝的生長 性狀(殼高、殼長、殼寬和體重），用開口器打開貝殼，用剪刀剪取一塊鰓組織置于95%乙醇 中，于-20°C保存，--對應(yīng)記錄，將取樣后的貝繼續(xù)養(yǎng)殖。使用HiPure Universal DNA Kit (廣州美基生物公司）對來自120個馬氏珠母貝的鰓組織的基因組DNA進(jìn)行提取，相關(guān)操作參 見試劑盒說明書進(jìn)行。DNA提取后，于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度 計測量DNA的濃度和純度，于-20 °C保存。
[0027]與馬氏珠母貝生長性狀相關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物為：
[0028] ASSNl184FI:5 '-CGATTTGCTAGAAAGCCATTA-3 '；
[0029] ASSNl184RI:5 '-AATTTGTTACAACTTACCTATAATGCAA-3 '；
[0030] ASSNl184F0:5 '-GGTAAAACATTAACACGGATTGA-3 '；
[0031 ] ASSNl184R0:5 '-ATTGTAATGACTTACCTAAAACGGAT-3 '。
[0032]用上述引物 ASSNl 184FI、ASSN1184RI、ASSN1184F0、ASSN1184R0 對馬氏珠母貝樣品 基因組DNA在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下:擴(kuò)增體系25yL，包含馬氏珠母貝樣品 基因組DNA 0.5yL(40ng)，10XPCR Mixture 2·5μL，10μΜ檢測引物ASSN1184FI、ASSN1184RI 各2yL，ΙΟμΜ檢測引物ASSNl 184F0、ASSN1184R0各0 · 5yL，0 · IU Taq DNA酶（Takara公司），雙 蒸水補(bǔ)足至 25yL。反應(yīng)條件為:94°(：，411^11;941€3〇8,57 1€3〇8,721€458,35個循環(huán)；72°(：延伸 10min〇
[0033] PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖(廣州康龍科技生物公司)凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電 泳圖譜。分型電泳圖如圖1所示，出現(xiàn)具有310bp和206bp大小2條帶的為AT基因型（泳道3,4， 6,8,9，10，11，12，15，17，18,23)，只出現(xiàn)31(^?大小1條帶的為1'1'基因型（泳道1，2,5,7,21， 22,24)，只出現(xiàn)206匕?大小1條帶的為4六基因型（泳道14，16，19,20,25)。在這120個個體中， TT基因型個體22個，殼高、殼長、殼寬和體重分別為62.39cm、62.93cm、23.88cm、38.98g，AT 基因型個體59個，殼高、殼長、殼寬和體重分別為61.29cm、62.78cm、23.56cm、37.22g，AA基 因型個體37個，殼高、殼長、殼寬和體重分別為58.80cm、59.80cm、23.23cm、33.8g，具有TT基 因型的個體的生長性狀值最大，AT基因型個體的生長性狀值次之，AA基因型個體的性狀值 最小。利用SPSS19.0軟件中的一般線性模型(GLM)進(jìn)行標(biāo)記與生長性狀的相關(guān)性分析，基因 型對應(yīng)性狀均值之間的差異用Duancan進(jìn)行多重比較分析，TT基因型個體的殼高、殼長、殼 寬和體重顯著大于AT基因型個體和AA基因型個體(P<0.05)，即認(rèn)為它們之間具有顯著的 統(tǒng)計學(xué)差異。有利基因型為TT，可挑選出TT基因型的個體作為后備親本，以培育優(yōu)良后代。
【主權(quán)項】
1. 一種與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物，其特征在于，包括以下引 物： ASSN1184FI:5 '-CGATTTGCTAGAAAGCCATTA-3 '； ASSN1184RI:5 '-AATTTGTTACAACTTACCTATAATGCAA-3 '； ASSN1184F0:5 '-GGTAAAACATTAACACGGATTGA-3 '； ASSN1184R0:5 '-ATTGTAATGACTTACCTAAAACGGAT-3 '。2. -種與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，其特征在于，所述的SNP標(biāo)記的序列如 SEQ ID NO. 1所示，所述的SEQ ID NO. 1所示序列自5'端起第457位堿基為AST。3. 權(quán)利要求2所述的與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記在馬氏珠母貝分子標(biāo)記輔 助育種中的應(yīng)用。4. 一種檢測馬氏珠母貝具有生長優(yōu)勢的個體的方法，其特征在于，通過對待測馬氏珠 母貝中的權(quán)利要求2所述的與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記進(jìn)行檢測，確定所述待測 馬氏珠母貝是否為具有生長優(yōu)勢的個體，確定其是否作為后備親本進(jìn)行育種。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： a、 提取待測馬氏珠母貝樣品基因組DNA; b、 采用權(quán)利要求 1 所述的檢測引物 ASSN1184FI、ASSN1184RI、ASSN1184F0、ASSN1184R0 對馬氏珠母貝樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； c、 根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對馬氏珠母貝樣品進(jìn)行基因型分型，當(dāng)只出現(xiàn)310bp大小1條帶的 為TT基因型，該馬氏珠母貝樣品判別為具有生長優(yōu)勢的個體，作為后備親本進(jìn)行育種。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)體系為:25yL; PCR反應(yīng)體系如下：包含馬氏珠母貝樣品基因組DNA 40ng，lXPCR Mixture，檢測引物 ASSN1184FI、ASSN1184RI各0·8μΜ，ASSN1184F0、ASSN1184R0各0·2μΜ，0· 1U Taq DNA酶，余量 為水;反應(yīng)條件為:94°(：，411^11;941€3〇8,57 1€3〇8,721€458,35個循環(huán)；72°(：延伸1〇11^11。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的提取待測馬氏珠母貝樣品基因組 DNA是提取待測馬氏珠母貝樣品的鰓組織的基因組DNA。8. -種用于檢測與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的試劑盒，其特征在于，包括權(quán) 利要求1所述的與馬氏珠母貝生長性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記的檢測引物。
【文檔編號】C12N15/11GK106086216SQ201610674361
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月16日 公開號201610674361.3, CN 106086216 A, CN 106086216A, CN 201610674361, CN-A-106086216, CN106086216 A, CN106086216A, CN201610674361, CN201610674361.3
【發(fā)明人】何毛賢, 韋國建
【申請人】中國科學(xué)院南海海洋研究所