一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法，屬于活性肽技術(shù)領(lǐng)域。針對目前寬體金線蛭活性肽的制備方法，蛋白水解率較低，活性肽損失較大、操作復(fù)雜、不適合工業(yè)化大規(guī)模生成應(yīng)用的問題，本發(fā)明提供了一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法，本發(fā)明通過培育枯草桿菌，提取堿性蛋白酶粗提液，通過鹽析、等電點(diǎn)沉淀及共溶劑沉淀，靜置后分成三相，取中間相酶蛋白沉淀，分離純化得高活性堿性蛋白酶，再用其酶解寬體金線蛭分離蛋白液，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。本發(fā)明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽收率高，抗凝血活性好，操作簡單。
【專利說明】
一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法，屬于活性肽技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)當(dāng)中，因?qū)掦w金線蛭有抗凝血、抗血栓、降血脂等功效，而被廣泛用于治療高血壓、瘀血腫痛等病癥，多年來其具體有效成分仍不清楚。近年來，對其有效活性成分的研究成為一大熱點(diǎn)。呂丹等發(fā)現(xiàn)，活體寬體金線蛭的水分含量為85.61%，粗蛋白含量為11.24%，糖類含量為1.43%，總脂肪含量為0.95%，灰分含量為0.77%。除了水分，蛋白質(zhì)占了該軟體動物的大部分組成。江佩芬等對數(shù)種蛋白質(zhì)水蛭進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭和日本醫(yī)蛭的蛋白條帶較接近。汪波等對七種水蛭可溶性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)七種水蛭的蛋白帶既有相同，又有不同之處。寬體金線蛭的蛋白條帶數(shù)達(dá)到條?？梢钥闯?，不同品種的水蛭蛋白質(zhì)相近，但又存在顯著性差異。在氨基酸分析上，研究者們得出的結(jié)論是，天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸和甘氨酸在寬體金線蛭中占有較高的比例，蛋氨酸、色氨酸比例均較低。寬體金線蛭抗凝抗血栓的功效對內(nèi)源性及外源性凝血均有抑制效果，該作用可能在抵抗血栓形成、溶解已成血栓中有積極意義。不僅能抑制血栓素B2的形成，而且還能提高血漿中6-酮-前列腺素Fla的量，從而促使血管內(nèi)皮抗凝促纖溶活性物質(zhì)的釋放，增加內(nèi)皮細(xì)胞的抗栓能力。但是，目前寬體金線蛭活性肽的制備方法，蛋白水解率較低，活性肽損失較大、操作復(fù)雜、不適合工業(yè)化大規(guī)模生成應(yīng)用，因此，對于體金線蛭活性肽的優(yōu)化研究顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題:針對目前寬體金線蛭活性肽的制備方法，蛋白水解率較低，活性肽損失較大、操作復(fù)雜、不適合工業(yè)化大規(guī)模生成應(yīng)用的問題，本發(fā)明提供了一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法，本發(fā)明通過培育枯草桿菌，提取堿性蛋白酶粗提液，通過鹽析、等電點(diǎn)沉淀及共溶劑沉淀，靜置后分成三相，取中間相酶蛋白沉淀，分離純化得高活性堿性蛋白酶，再用其酶解寬體金線蛭分離蛋白液，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。本發(fā)明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽收率高，抗凝血活性好，操作簡單。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
(1)分別稱取4?5g氯化鈉，0.1?0.2g磷酸二氫鉀，0.01?0.02g七水合硫酸鎂，I?2g蛋白胨，5?6g葡萄糖，加入95?10mL去離子水中，以200?300r/min攪拌20?30min，加熱至沸騰后，保溫20~30min得培養(yǎng)液，按接種量8?10%，將枯草桿菌接種至培養(yǎng)液中，在30~32°C下培養(yǎng)22?24h，量取2?3mL培養(yǎng)液，與1.5?1.6L去離子水混合，分別加入40?42g氯化鈉，1.5?1.6g磷酸二氫鉀，0.15?0.16g七水合硫酸鎂，11?12g牛肉膏，11?12g酵母浸粉，22?24g蔗糖，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.2~10.5，在30~32°(:下，以120~13(^/1^11振蕩發(fā)酵110~120h，將發(fā)酵液置于離心機(jī)中，以12000r/min離心30?40min，取上清液，得粗酶液；
(2)稱取18?25g硫酸銨置于50?55°C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入100?150mL上述粗酶液，加入150?200mL叔丁醇，在22?25°C下，以300?400r/min攬摔20?30min，靜置I?2h，置入離心機(jī)，在4000?5000r/min離心10~15min，收集中間沉淀相，加入100?120mL pH為7.5-7.9磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液，備用；
(3)稱取50?SOg新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入200?320mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0?8.5，在35?37 °C恒溫水浴中加熱I?2h，以8000?9000r/min離心15?20min，取上清液，用質(zhì)量濃度為1%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5~5.0，轉(zhuǎn)入離心機(jī)，以8000?9000r/min離心15?20min，取沉淀，加入去離子水至pH為6.8-7.0,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的40?50%，得寬體金線蛭分離蛋白液；
(4)向上述寬體金線輕分離蛋白液中，加入50?60mL上述步驟(2)制備的高活性堿性蛋白酶液，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至8.0-8.5,在50?55°C下，酶解3?4h，置于沸水浴中滅酶10?15min，冷卻后置于5000?6000r/min冷凍離心機(jī)中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥2?3h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
[0005]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:將本發(fā)明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽添加在治療血栓性疾病用醫(yī)藥輸液中，添加量為50?100mg/mL，抗凝血率提高10?12%，血栓性疾病痊愈率提尚5?8%。
[0006]本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:
(I)本發(fā)明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽收率高，抗凝血活性好，操作簡單；
(2 )本發(fā)明制備過程綠色、安全、環(huán)保。
【具體實施方式】
[0007]分別稱取4?5g氯化鈉，0.1?0.2g磷酸二氫鉀，0.01?0.02g七水合硫酸鎂，I?2g蛋白胨，5?6g葡萄糖，加入95?10mL去離子水中，以200?300r/min攪拌20?30min，加熱至沸騰后，保溫20~30min得培養(yǎng)液，按接種量8?10%，將枯草桿菌接種至培養(yǎng)液中，在30~32°C下培養(yǎng)22?24h，量取2?3mL培養(yǎng)液，與1.5~1.6L去離子水混合，分別加入40?42g氯化鈉，1.5~1.6g磷酸二氫鉀，0.15?0.16g七水合硫酸鎂，11?12g牛肉膏，11?12g酵母浸粉，22?24g蔗糖，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.2~10.5，在30~32°(:下，以120~13(^/1^11振蕩發(fā)酵110~120h，將發(fā)酵液置于離心機(jī)中，以12000r/min離心30?40min，取上清液，得粗酶液;稱取18?25g硫酸銨置于50?55°C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入100?150mL上述粗酶液，加入150?200mL叔丁醇，在22?25°C下，以300?400r/min攪拌20?30min，靜置I?2h，置入離心機(jī)，在4000?5000r/ min離心10?15min，收集中間沉淀相，加入100?120mL pH為7.5-7.9磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液;稱取50?80g新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入200?320mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0-8.5,在35?37°C恒溫水浴中加熱卜2h，以8000?9000r/min離心15?20min，取上清液，用質(zhì)量濃度為1%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5~5.0，轉(zhuǎn)入離心機(jī)，以8000?9000r/min離心15?20min，取沉淀，加入去離子水至pH為6.8?7.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的40?50%，得寬體金線蛭分離蛋白液；向上述寬體金線蛭分離蛋白液中，加入50?60mL上述制備的高活性堿性蛋白酶液，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0~8.5，在50?55 °C下，酶解3?4h，置于沸水浴中滅酶10?15min，冷卻后置于5000?6000r/min冷凍離心機(jī)中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥2?3h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
[0008]實例I
分別稱取4g氯化鈉，0.1g磷酸二氫鉀，0.0lg七水合硫酸鎂，Ig蛋白胨，5g葡萄糖，加入95mL去離子水中，以200r/min攪拌20min，加熱至沸騰后，保溫20min得培養(yǎng)液，按接種量8%，將枯草桿菌接種至培養(yǎng)液中，在300C下培養(yǎng)22h，量取2mL培養(yǎng)液，與1.5L去尚子水混合，分別加入40g氯化鈉，1.5g磷酸二氫鉀，0.15g七水合硫酸鎂，I Ig牛肉膏，I Ig酵母浸粉，22g蔗糖，用質(zhì)量濃度為I %氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至10.2，在30 °C下，以120r/min振蕩發(fā)酵I 1h，將發(fā)酵液置于離心機(jī)中，以12000r/min離心30min，取上清液，得粗酶液;稱取18g硫酸銨置于50°C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入10mL上述粗酶液，加入150mL叔丁醇，在22°C下，以300r/min攪拌20min，靜置lh，置入離心機(jī)，在4000r/min離心1min，收集中間沉淀相，加入10mL pH為7.5磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液;稱取50g新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入200mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，在350C恒溫水浴中加熱Ih，以8000r/min離心15min，取上清液，用質(zhì)量濃度為1%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，轉(zhuǎn)入離心機(jī)，以8000r/min離心15min，取沉淀，加入去離子水至pH為6.8，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的40%，得寬體金線蛭分離蛋白液；向上述寬體金線蛭分離蛋白液中，加入50mL上述制備的高活性堿性蛋白酶液，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，在50 0C下，酶解3h，置于沸水浴中滅酶1min，冷卻后置于5000r/min冷凍離心機(jī)中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥2h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
[0009]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:將本發(fā)明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽添加在治療血栓性疾病用醫(yī)藥輸液中，添加量為50mg/mL，抗凝血率提高10%，血栓性疾病痊愈率提高5%。
[0010]實例2
分別稱取4.5g氯化鈉，0.15g磷酸二氫鉀，0.015g七水合硫酸鎂，1.5g蛋白胨，5.5g葡萄糖，加入98mL去離子水中，以250r/min攪拌25min，加熱至沸騰后，保溫25min得培養(yǎng)液，按接種量9%，將枯草桿菌接種至培養(yǎng)液中，在310C下培養(yǎng)23h，量取2.5mL培養(yǎng)液，與1.55L去尚子水混合，分別加入41g氯化鈉，1.55g磷酸二氫鉀，0.15g七水合硫酸鎂，11.5g牛肉膏，11.5g酵母浸粉，23g蔗糖，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.3，在31°C下，以125r/min振蕩發(fā)酵115h，將發(fā)酵液置于離心機(jī)中，以12000r/min離心35min，取上清液，得粗酶液;稱取20g硫酸銨置于52 °C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入120mL上述粗酶液，加入180mL叔丁醇，在23 °C下，以350r/min攪拌25min，靜置1.5h，置入離心機(jī)，在45001'/111；[11離心121]1；[11，收集中間沉淀相，加入11011^ pH為7.8磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液;稱取70g新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入280mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.2，在35?37 °C恒溫水浴中加熱1.5h，以8500r/min離心18min，取上清液，用質(zhì)量濃度為1%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.8，轉(zhuǎn)入離心機(jī)，以8500r/min離心18min，取沉淀，加入去離子水至pH為6.9，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的45%，得寬體金線蛭分離蛋白液；向上述寬體金線蛭分離蛋白液中，加入55mL上述制備的高活性堿性蛋白酶液，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.2，在52 0C下，酶解3.5h，置于沸水浴中滅酶12min，冷卻后置于5500r/min冷凍離心機(jī)中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥2.5h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
[0011]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:將本發(fā)明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽添加在治療血栓性疾病用醫(yī)藥輸液中，添加量為80mg/mL，抗凝血率提高11%，血栓性疾病痊愈率提高7%。
[0012]實例3
分別稱取5g氯化鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.02g七水合硫酸鎂，2g蛋白胨，6g葡萄糖，加入10mL去離子水中，以300r/min攪拌30min，加熱至沸騰后，保溫30min得培養(yǎng)液，按接種量10%，將枯草桿菌接種至培養(yǎng)液中，在32°C下培養(yǎng)24h，量取3mL培養(yǎng)液，與1.6L去尚子水混合，分別加入42g氯化鈉，1.6g磷酸二氫鉀，0.16g七水合硫酸鎂，12g牛肉膏，12g酵母浸粉，24g蔗糖，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.5，在32°C下，以130r/min振蕩發(fā)酵120h，將發(fā)酵液置于離心機(jī)中，以12000r/min離心40min，取上清液，得粗酶液;稱取25g硫酸銨置于55°C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入150mL上述粗酶液，加入200mL叔丁醇，在25°C下，以400r/min攪拌30min，靜置2h，置入離心機(jī)，在5000r/min離心15min，收集中間沉淀相，加入120mL pH為7.9磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液;稱取SOg新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入320mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，在37°C恒溫水浴中加熱2h，以9000r/min離心20min，取上清液，用質(zhì)量濃度為1%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5，轉(zhuǎn)入離心機(jī)，以9000r/min離心20min，取沉淀，加入去離子水至pH為7.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的50%，得寬體金線蛭分離蛋白液；向上述寬體金線蛭分離蛋白液中，加入60mL上述制備的高活性堿性蛋白酶液，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，在55 °C下，酶解4h，置于沸水浴中滅酶15min，冷卻后置于6000r/min冷凍離心機(jī)中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥3h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
[0013]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:將本發(fā)明制備的寬體金線蛭抗凝血活性肽添加在治療血栓性疾病用醫(yī)藥輸液中，添加量為100mg/mL，抗凝血率提高12%，血栓性疾病痊愈率提高8%。
【主權(quán)項】
1.一種寬體金線蛭抗凝血活性肽的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)分別稱取4?5g氯化鈉，0.1?0.2g磷酸二氫鉀，0.0l?0.02g七水合硫酸鎂，I?2g蛋白胨，5?6g葡萄糖，加入95?10mL去離子水中，以200?300r/min攪拌20?30min，加熱至沸騰后，保溫20~30min得培養(yǎng)液，按接種量8?10%，將枯草桿菌接種至培養(yǎng)液中，在30~32°C下培養(yǎng)22?24h，量取2?3mL培養(yǎng)液，與1.5~1.6L去離子水混合，分別加入40?42g氯化鈉，1.5~1.6g磷酸二氫鉀，0.15?0.16g七水合硫酸鎂，11?12g牛肉膏，11?12g酵母浸粉，22?24g蔗糖，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.2~10.5，在30~32°(:下，以120~13(^/1^11振蕩發(fā)酵110~120h，將發(fā)酵液置于離心機(jī)中，以12000r/min離心30?40min，取上清液，得粗酶液； (2)稱取18?25g硫酸銨置于50?55°C干燥箱干燥至恒重，加入粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，將過篩后的硫酸銨粉加入100?150mL上述粗酶液，加入150?200mL叔丁醇，在22?25°C下，以300?400r/min攬摔20?30min，靜置I?2h，置入離心機(jī)，在4000?5000r/min離心10~15min，收集中間沉淀相，加入100?120mL pH為7.5-7.9磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得高活性堿性蛋白酶液，備用； (3)稱取50?SOg新鮮的寬體金線蛭，用去離子水洗滌至洗滌液呈中性，并加入200?320mL去離子水中，混合均勻后打碎勻漿，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0?8.5，在35?37 °C恒溫水浴中加熱I?2h，以8000?9000r/min離心15?20min，取上清液，用質(zhì)量濃度為1%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5~5.0，轉(zhuǎn)入離心機(jī)，以8000?9000r/min離心15?20min，取沉淀，加入去離子水至pH為6.8-7.0,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的40?50%，得寬體金線蛭分離蛋白液； (4)向上述寬體金線輕分離蛋白液中，加入50?60mL上述步驟(2)制備的高活性堿性蛋白酶液，用質(zhì)量濃度為1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至8.0-8.5,在50?55°C下，酶解3?4h，置于沸水浴中滅酶10?15min，冷卻后置于5000?6000r/min冷凍離心機(jī)中，取上清液，減壓濃縮后加入冷凍干燥箱中干燥2?3h，得寬體金線蛭抗凝血活性肽。
【文檔編號】C12N9/56GK106086135SQ201610462169
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】袁春華, 王龍
【申請人】袁春華