一種用于鑒別鴿子性別的引物、試劑盒及其鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于鑒別鴿子性別的引物、試劑盒及其鑒別方法，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，該引物具有特異性好，分辨率高，擴(kuò)增效果好等優(yōu)點(diǎn)，不需進(jìn)行酶切，直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。而且，相對(duì)于一條特異性產(chǎn)物，兩條特異性產(chǎn)物具有更高的辨識(shí)度，使得擴(kuò)增結(jié)果可以一眼就可以分辨出來(lái)；本發(fā)明還提供了利用所述引物鑒別鴿子性別的方法，該方法在利用上述引物特異性擴(kuò)增的前提下，還能夠通過(guò)簡(jiǎn)化樣品DNA的獲得過(guò)程，縮短了鑒別鴿子性別的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本，利用所述引物鑒別鴿子性別的方法具有廣泛的市場(chǎng)利用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
-種用于鑒別銷子性別的引物、試劑盒及其鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及一種用于鑒別錯(cuò)子性別的 引物、試劑盒及其鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 性別鑒定在家禽的育種、養(yǎng)殖成本的控制等生產(chǎn)環(huán)節(jié)尤為重要。不同性別的個(gè)體 其營(yíng)養(yǎng)需求不同，及早區(qū)分性別可W對(duì)個(gè)體區(qū)別飼養(yǎng);對(duì)于種錯(cuò)養(yǎng)殖，需要合理的性別比 例，早期的性別鑒定將有助于實(shí)現(xiàn)運(yùn)一過(guò)程。
[0003] 錯(cuò)子屬于單態(tài)鳥(niǎo)，其性別不論是在幼鳥(niǎo)還是在成鳥(niǎo)時(shí)期，都很難從外觀及其它行 為上加 W區(qū)別。翻肛鑒別法是目前在家禽生產(chǎn)中運(yùn)用最廣泛的方法，但是初生錯(cuò)體型小，僅 有IOg左右，難W在早期進(jìn)行性別鑒定，只有到5月齡左右才可W用此方法鑒別，且鑒別的結(jié) 果正確率低，耗時(shí)耗力。
[0004] 利用雌雄錯(cuò)子在CHDl基因上序列和拷貝數(shù)的不同，使用對(duì)錯(cuò)子傷害盡可能小的材 料，如羽毛、血液等，運(yùn)用兩步法PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)等 技術(shù)對(duì)錯(cuò)子進(jìn)行性別鑒定。降低檢測(cè)成本，提高成功率，降低技術(shù)口檻，為錯(cuò)子的生產(chǎn)甚至 家禽的生產(chǎn)帶來(lái)革命性的改變;現(xiàn)有技術(shù)中存在一些鑒定錯(cuò)子性別的引物和方法，但公開(kāi) 的引物一些僅僅是擴(kuò)增出一條帶，通過(guò)條帶大小不同來(lái)鑒別錯(cuò)子性別，運(yùn)存在特異性不足， 甚至假陰性的可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種新的用于 鑒別錯(cuò)子性別的引物。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種利用鑒別錯(cuò)子性別的方法。
[0007] 本發(fā)明的第=個(gè)目的是提供含有上述引物的試劑盒。
[000引本發(fā)明的第四個(gè)目的是通過(guò)所述引物或者試劑盒的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過(guò)W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)的： 一種用于鑒別錯(cuò)子性別的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示。
[0010] 發(fā)明人通過(guò)針對(duì)相同的目標(biāo)區(qū)段，設(shè)計(jì)了多組引物，用于檢測(cè)運(yùn)些引物鑒定錯(cuò)子 性別的特異性，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示的引物能夠特異性且靈 敏的鑒別錯(cuò)子性別。
[0011] 因此，本發(fā)明還保護(hù)一種含有SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示引物的試劑盒。
[0012] 該試劑盒可用于工業(yè)生產(chǎn)，從而實(shí)現(xiàn)快速鑒別錯(cuò)子性別的產(chǎn)業(yè)化，優(yōu)選地，所述試 劑盒還包括PCR反應(yīng)液、DNA提取液。
[0013] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所述DNA提取液可W是現(xiàn)有技術(shù)中存在的能夠提取到錯(cuò)子 DNA(無(wú)論是羽毛DNA還是血液DNA)的提取液，只要能夠提取到錯(cuò)子DNA用于PCR，都適用于 本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0014] 在實(shí)際生產(chǎn)中，10日齡甚至更小的錯(cuò)子沒(méi)有足夠采集的羽毛。因此可W嘗試通過(guò) 血液樣品來(lái)檢測(cè)錯(cuò)子的性別，運(yùn)一時(shí)期的乳錯(cuò)行動(dòng)能力及反應(yīng)能力都比較差，且錯(cuò)子的性 情比較溫順，因此采血液時(shí)不會(huì)造成較大的應(yīng)激，對(duì)錯(cuò)子造成的危害較小。
[0015] 因此優(yōu)選地，所述DNA提取液可W是血液樣裂解液和羽毛樣裂解液;所述血液樣裂 解液選自DMSO、TE緩沖液或者雙蒸水;所述羽毛樣裂解液為PBS緩沖液。
[0016] 本發(fā)明還提供上述引物或者上述試劑盒在鑒別錯(cuò)子性別中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明還提供一種鑒別錯(cuò)子性別的PCR方法，包括W下步驟： 51. 加入沈Q ID NO a和沈Q ID NO: 2所述引物，樣品DNA，PCR反應(yīng)液進(jìn)行PCR反應(yīng)； 52. PCR反應(yīng)后采用凝膠電泳分析電泳條帶大小，進(jìn)行結(jié)果判定:若顯示大小分別為 474bp與319bp的兩條電泳條帶，則為雌性;若顯示大小為474bp的一條電泳條帶，則為雄性。
[0018] 優(yōu)選地，S2所述樣品DNA通過(guò)樣品前處理獲得，所述樣品前處理是指:若選擇錯(cuò)子 羽毛樣品，則收集羽毛，并與PBS緩沖液混合完成樣品的前處理;若選擇錯(cuò)子血液樣品，則收 集血液，并與TE緩沖液、雙蒸水或者DMSO混合完后樣品的前處理。
[0019] 另外，發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)錯(cuò)子羽毛毛囊中膽存有足夠性別鑒定所用的血液，運(yùn) 使得原本耗時(shí)耗力的采血工作變得簡(jiǎn)單，一個(gè)人就可W完成操作且不需要借助任何工具， 該方法的可操作性顯著增強(qiáng)，因此優(yōu)選地，所述血液包括靜脈血液和羽毛毛囊中的血液。
[0020] 優(yōu)選地，上述方法中，Sl所述PCR反應(yīng)的體系為:2微升樣品DNA，10微升PCR反應(yīng)液、 權(quán)利要求1所述引物IOyM各1微升，余量為雙蒸水，反應(yīng)體系的總體積為20微升。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果： 本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)多組引物，篩選出了中用于鑒別錯(cuò)子性別的引物，所述引物的序列如 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示，該引物具有特異性好，分辨率高，擴(kuò)增效果好等優(yōu)點(diǎn)，不 需進(jìn)行酶切，直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。而且，相對(duì)于一條特異性產(chǎn)物，兩條特異性產(chǎn)物具 有更高的辨識(shí)度，使得擴(kuò)增結(jié)果可W-眼就可W分辨出來(lái);本發(fā)明還提供了利用所述引物 鑒別錯(cuò)子性別的方法，該方法在利用上述引物特異性擴(kuò)增的前提下，還能夠通過(guò)簡(jiǎn)化樣品 DNA的獲得過(guò)程，縮短了鑒別錯(cuò)子性別的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本，利用所述引物鑒別錯(cuò)子性別 的方法具有廣泛的市場(chǎng)利用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為利用引物CHD646擴(kuò)增雄錯(cuò)和雌錯(cuò)的PCR結(jié)果，其中，M為Markera~12為雄錯(cuò) 樣本，13~24為雌錯(cuò)樣本。
[0023] 圖2為利用引物CHD520擴(kuò)增雄錯(cuò)和雌錯(cuò)的PCR結(jié)果，其中，M為Markera~12為雄錯(cuò) 樣本，13~24為雌錯(cuò)樣本。
[0024] 圖3為利用引物CHD243擴(kuò)增雄錯(cuò)和雌錯(cuò)的PCR結(jié)果，其中，M為Marker，1~12為雄錯(cuò) 樣本，13~24為雌錯(cuò)樣本。
[0025] 圖4為雄錯(cuò)子和雌錯(cuò)子在解剖學(xué)上的差異。
[0026] 圖5為不同裂解液處理樣品得到的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，M為Marker;泳道1~4，5~ 8,9~12，13~16，17~20分別是用雙蒸水、IXTE緩沖液、pH=8.0的PBS緩沖液、1%SDS溶 液、2.5M NaCl處理樣品得到的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。
[0027] 圖6為不同濃度TE緩沖液處理血液樣PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果;其中，M為Marker;泳道1~ 4,5~8,9 ~12，13~16，17~20,21~24分別是用0.25XTE，0.5XTE，1XTE，2XTE，4XTE，8 X TE緩沖液處理后PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，圖中灰色框所示為擴(kuò)增效果最好的處理組。
[0028] 圖7為不同濃度DMSO處理血液樣PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，其中，M為Marker;泳道1~4,5 ~8,9~12，13~16，17~20,21~24分別是用0.25%、0.5%、1%、2%、4%、8%0150水溶液處理后 PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，紅框中所示的為擴(kuò)增效果最好的處理組。
[00巧]圖8為2%DMS0處理血液樣對(duì)雌錯(cuò)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果(A)和2%DMS0處理血液樣 對(duì)雄錯(cuò)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果(B)。
[0030] 圖9為PBS緩沖液作為裂解液處理羽毛樣PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，其中，M為Marker;泳道 1~6，7~12分別是6羽雌錯(cuò)和6羽雄錯(cuò)的羽毛樣品經(jīng)過(guò)1 X PBS處理后PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。
[0031] 圖10為不同濃度的PBS緩沖液作為裂解液處理羽毛樣PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，其中，M為 Marker;泳道1~4,5~8，9~12,13~16,17~20,21~24分別是4羽（2羽雌錯(cuò)和2羽雄錯(cuò)）的 羽毛樣品經(jīng)過(guò)0.25 X PBS、0.5 X PBS、1 X PBS、2 X PBS、4 X PBS、8 X PBS 處理后PCR擴(kuò)增的產(chǎn) 物。
[0032] 圖11為1 XPBS處理羽毛樣對(duì)雄錯(cuò)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。
[0033] 圖12為1 XPBS處理羽毛樣對(duì)雌錯(cuò)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。
[0034] 圖13為錯(cuò)子羽毛毛囊中獲得的新鮮血液。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單 修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的常規(guī)手段。
[0036] 羽毛結(jié)構(gòu)較為完整的錯(cuò)子，一般是10日齡左右至成年錯(cuò)子。從待測(cè)的錯(cuò)子身上拔 下羽毛2~討良，必須具有毛囊結(jié)構(gòu)，裝入無(wú)菌塑料封袋中待測(cè)，早期使用肝素鋼真空采血管 從錯(cuò)子翅膀采集靜脈血樣品1~2毫升，后期我們發(fā)現(xiàn)乳錯(cuò)羽毛毛囊中含有豐富的血液，也 可用作錯(cuò)子性別鑒定血液樣樣品。
[0037] 實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)和特異性實(shí)驗(yàn) 靜脈血液樣處理方法:前期用移液器取血液5微升，按照1:30的體積比稀釋到含有血 液樣裂解液的A管中。
[0038] 羽毛毛囊中血液樣處理方法:將新采摘的羽毛沿毛羽向毛球按壓，可W收集10微 升甚至更多的新鮮血液，加入150微升血液樣裂解液。
[0039] 羽毛樣處理方法:將收集的羽毛沿根部剪下3~4毫米，置于含有150微升羽毛樣 裂解液的B管中，室溫放置2分鐘。
[0040] PCR擴(kuò)增程序如下： (1)在PCR儀中按照預(yù)先設(shè)定好的程序，98°C加熱10分鐘，之后4°C冷卻十分鐘，將A管或 B管取出，1.2X 1〇4 g離屯、10分鐘。
[0041] (2)將A管或B管中的上清轉(zhuǎn)移至新PCR管中，取2微升作為PCR反應(yīng)的模板，之后依 次加入10微升化rmix化qTM'、6微升的雙蒸水W及每一對(duì)上下游引物各1微升，總計(jì)20微升體 系(每一對(duì)上下游引物序列如表1所示）。
[0042] (3)將加好的體系放入PCR儀中按照如下程序進(jìn)行反應(yīng):a. 94°C預(yù)變性，加熱5分 鐘;b. 94°C變性，加熱30秒;C. 53.5°C退火，反應(yīng)30秒;d. 72°C延伸，反應(yīng)30秒;之后從b到 d進(jìn)行38個(gè)循環(huán);f. 72°C再延伸反應(yīng)5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后跑瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶數(shù)量 和大小進(jìn)行結(jié)果判定。
[0043] CHD646合成的目的片段分別為CHD-Z和C皿-W，其長(zhǎng)度分別為646bp和52化P，其PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖1，從圖1中可W看出，無(wú)論是公錯(cuò)樣品，還是母錯(cuò)樣品均擴(kuò)增出了兩條條帶， 且條帶長(zhǎng)度相近，不能夠?qū)⒉煌詣e的錯(cuò)子區(qū)分開(kāi)來(lái)，且引物中存在非特異性結(jié)合，即產(chǎn)生 了錯(cuò)誤擴(kuò)增，片段剛好為52化P左右。
[0044] CHD520合成的目的片段分別為CHD-Z和C皿-W，其長(zhǎng)度分別為52化P和394bp，其PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖2,從圖2中可W看出，該引物未能夠擴(kuò)增出可W有效分辨錯(cuò)子性別的條帶，只 在520bp處擴(kuò)增到了條帶。說(shuō)明該引物的特異性較差，上下游引物GC含量差異大導(dǎo)致退火溫 度等條件不一致，進(jìn)而導(dǎo)致了擴(kuò)增的失敗。
[0045] CHD243合成的目的片段為CHD-W，其長(zhǎng)度為243bp，本引物設(shè)計(jì)的思路是根據(jù)CHDl 基因在ZW染色體上序列的不同，設(shè)計(jì)一條CHD-W特異的引物進(jìn)行擴(kuò)增，公錯(cuò)擴(kuò)增不出條帶， 母錯(cuò)在243bp處有一條條帶，從而鑒定錯(cuò)子性別。其PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3,從圖3中可W看出， 未擴(kuò)增出條帶的樣本不能直接進(jìn)行判定，既有可能是公錯(cuò)也有可能是未能有效擴(kuò)增的母 錯(cuò)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，該引物在最適溫度下的擴(kuò)增結(jié)果并不理想，運(yùn)可能與引物本身 的特異性有關(guān)，其對(duì)低濃度質(zhì)量較差的模板DM的擴(kuò)增效率比較低，因此不適合作為錯(cuò)子性 別鑒定的引物。
[0046] CHD457合成的目的片段分別為CHD-Z和C皿-W，其長(zhǎng)度分別為457bp和308bp，其PCR 擴(kuò)增結(jié)果表明：引物存在非特異性結(jié)合，即產(chǎn)生了錯(cuò)誤擴(kuò)增，且片段剛好為1000 bp左右，該 引物不能作為錯(cuò)子性別鑒定的引物。
[0047] CHD474合成的目的片段分別為CHD-Z和C皿-W，其長(zhǎng)度分別為474bp和319bp，其PCR 擴(kuò)增結(jié)果表明：利用該引物PCR擴(kuò)增雌錯(cuò)樣品，可在瓊脂糖凝膠電泳上顯示兩條長(zhǎng)度分別為 474bp與319bp的條帶，而雄錯(cuò)只能擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度為474bp的條帶，因此判斷出待測(cè)樣品的 性別;CHD474的上游引物和下游引物的序列分別為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2。
[004引實(shí)施例2裂解液篩選實(shí)驗(yàn)(血液樣） 樣品處理方法同實(shí)施例U運(yùn)里選用了血液樣），PCR擴(kuò)增程序如下： (1)在PCR儀中按照預(yù)先設(shè)定好的程序，98°C加熱10分鐘，之后4°C冷卻十分鐘，將A管或 B管取出，1.2X 104 g離屯、10分鐘。
[0049] (2)將A管或B管中的上清轉(zhuǎn)移至新PCR管中，取2微升作為PCR反應(yīng)的模板，之后依 次加入10微升Permix化qTM'、6微升的雙蒸水W及上下游引物各1微升，總計(jì)20微升體系（上 下游引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示）。
[0050] 沈Q ID N0:l:5'-TTCTGAGGATGGAAATGAGT-3' 沈Q ID N0:2:5'-AGCAATGGTTACAACACTTC-3' (3 )將加好的體系放入PCR儀中按照如下程序進(jìn)行反應(yīng):a. 94 °C預(yù)變性，加熱5分鐘;b. 94 °C變性，加熱30秒;C . 53.5 °C退火，反應(yīng)30秒;d. 72 °C延伸，反應(yīng)30秒;之后從b到d進(jìn)行 38個(gè)循環(huán);f. 72°C再延伸反應(yīng)5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后跑瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶數(shù)量和大小 進(jìn)行結(jié)果判定。
[0051] 我們通過(guò)解剖獲得了性別確定的雄錯(cuò)子W及雌錯(cuò)子樣品各30只。圖4示的是雄錯(cuò) 子和雌錯(cuò)子在解剖上的差異。
[0052] 本實(shí)施例分別用雙蒸水、1 XTE緩沖液、pH=8.0的PBS緩沖液、1%SDS溶液、2.5M 化Cl作為樣品裂解液，其擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明：雙蒸水W及IXTE緩沖液處理的 PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果有清晰可辨的條帶，其他幾種溶液沒(méi)有擴(kuò)增出明顯條帶；1 X TE緩沖液擴(kuò) 增所得的溶液的條帶質(zhì)量較雙蒸水處理好，所W選用TE緩沖液用作進(jìn)一步試驗(yàn)。
[0053] 接下來(lái)選擇0.25 X TE，0.5 X TE，1 X TE，2 X TE，4 X TE，8 X TE的緩沖液處理血液樣， 其擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明IXTE緩沖液具有較好的實(shí)驗(yàn)效果。
[0化4] 本實(shí)施例還嘗試用二甲基亞楓(DMSO)，結(jié)果如圖7所示，由此可知二甲基亞諷在從 0.25%到8%濃度條件下都能夠取得較理想的擴(kuò)增效果，同時(shí)可W確定2%濃度的DMSO作為裂 解液最優(yōu)濃度，用2%濃度的DMSO作為裂解液，SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2作為引物，分別用 30只雄錯(cuò)和雌錯(cuò)驗(yàn)證，結(jié)果如圖8和9。
[0055] 圖8A中，30只雌錯(cuò)子的血液樣經(jīng)2% DMSO處理的結(jié)果顯示，所有的樣品都擴(kuò)增出了 清晰明顯的兩條條帶，與圖8B中30只雄錯(cuò)子擴(kuò)增出的一條條帶對(duì)比明顯，且條帶的長(zhǎng)度均 符合預(yù)期，由此可W認(rèn)為2% DMSO處理血液樣品PCR擴(kuò)增進(jìn)行性別鑒定的結(jié)果具有準(zhǔn)確率百 分之百且重復(fù)性良好的特點(diǎn)。
[0056] 實(shí)施例3裂解液篩選實(shí)驗(yàn)(羽毛樣） 錯(cuò)子羽毛中富含蛋白成分，運(yùn)給有效地?cái)U(kuò)增帶來(lái)很大的難度;我們前期摸索了多種羽 毛樣裂解液，其中，WPBS緩沖液作為羽毛樣裂解液具有很大的可行性，其擴(kuò)增結(jié)果如圖9。
[0057]接下來(lái)實(shí)驗(yàn)PBS緩沖液的濃度為擴(kuò)增結(jié)果的影響，結(jié)果如圖10,最終確定IXPBS作 為錯(cuò)子羽毛樣的裂解液。用IXPBS作為裂解液，SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2作為引物，分別 用30只雄錯(cuò)和雌錯(cuò)驗(yàn)證，結(jié)果如圖11和12。
[005引由圖11和圖12我們可W知道，使用IXPBS處理羽毛樣品之后經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)，瓊脂糖 凝膠電泳，可W擴(kuò)增出分辨性別的條帶。不過(guò)，圖12中的部分樣品的電泳圖顯示有比較明顯 的拖帶，運(yùn)可能是由于錯(cuò)子羽毛中含有更復(fù)雜的成分，W及由于膽藏的時(shí)間過(guò)久，樣品有一 定程度上的變質(zhì)。但是并不影響我們分辨待測(cè)樣品的性別。同理，在圖13中的母錯(cuò)樣品中， 存在有部分未能擴(kuò)增出474bp條帶的樣品，運(yùn)是由于樣品的DNA濃度低，優(yōu)先擴(kuò)增了較短的 片段。在實(shí)際操作中?？蒞直接認(rèn)定擴(kuò)增出319bp條帶的待測(cè)樣品即為雌性，故上述結(jié)果均 可W有效的鑒別錯(cuò)子性別。
[0059] 實(shí)施例4試劑盒的組裝 所述用于鑒定錯(cuò)子性別的試劑盒包含PCR反應(yīng)液(如化rmix化qTM'）、裂解液1、裂解液2 W及SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所述引物，其中，裂解液1為血液樣的裂解液(DMS0、1XTE 緩沖液或者雙蒸水），裂解液2為羽毛樣的裂解液(1 X PBS緩沖液）。
[0060] 所述試劑盒的PCR反應(yīng)體系為：2微升裂解后的樣品作為PCR反應(yīng)的模板，10微升 化MixhqTMi,6微升的雙蒸水W及SEQ ID NOa和沈Q ID N0:2所述引物IOiiM各1微升，總體 積為20微升。
[0061 ]所述裂解后的樣品通過(guò)W下方法得到的： 靜脈血液樣處理方法:前期用移液器取血液5微升，按照1:30的體積比稀釋到含有血 液樣裂解液的A管中。
[0062] 羽毛毛囊中血液樣處理方法:將新采摘的羽毛沿毛羽向毛球按壓，可W收集10微 升甚至更多的新鮮血液，加入150微升血液樣裂解液。
[0063] 羽毛樣處理方法:將收集的羽毛沿根部剪下3~4毫米，置于含有150微升羽毛樣 裂解液的B管中，室溫放置2分鐘。
[0064] 所述試劑盒的PCR反應(yīng)條件為:a. 94°C預(yù)變性，加熱5分鐘;b. 94°C變性，加熱30 秒;C. 53.5°C退火，反應(yīng)30秒;d. 72°C延伸，反應(yīng)30秒;之后從b到d進(jìn)行38個(gè)循環(huán);f. 72°C 再延伸反應(yīng)5分鐘。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于鑒別鴿子性別的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2所示。2. 含有權(quán)利要求1所述引物的試劑盒。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)液、DNA提取 液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取液為血液樣裂解液和羽毛 樣裂解液，其中，血液樣裂解液選自DMSO、TE緩沖液或者雙蒸水;所述羽毛樣裂解液為PBS緩 沖液。5. 權(quán)利要求1所述引物或者權(quán)利要求2所述試劑盒在鑒別鴿子性別中的應(yīng)用。6. -種鑒別鴿子性別的PCR方法，其特征在于，包括以下步驟：51. 加入權(quán)利要求1所述引物，樣品DNA，PCR反應(yīng)液進(jìn)行PCR反應(yīng)； 52. PCR反應(yīng)后采用凝膠電泳分析電泳條帶大小，進(jìn)行結(jié)果判定:若顯示大小分別為 474bp與319bp的兩條電泳條帶，則為雌性;若顯示大小為474bp的一條電泳條帶，則為雄性。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，S2所述樣品DNA通過(guò)樣品前處理獲得，所述 樣品前處理是指:若選擇鴿子羽毛樣品，則收集羽毛，并與PBS緩沖液混合完成樣品的前處 理;若選擇鴿子血液樣品，則收集血液，并與TE緩沖液、雙蒸水或者DMSO混合完后樣品的前 處理。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述血液包括靜脈血液和羽毛毛囊中的血 液。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，Sl所述PCR反應(yīng)的體系為:2微升樣品DNA， 10微升PCR反應(yīng)液、權(quán)利要求1所述引物1 ΟμΜ各1微升，余量為雙蒸水，反應(yīng)體系的總體積為 20微升。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105925690SQ201610320748
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】王修啟, 梁少杰, 陳明霞, 高春起, 嚴(yán)會(huì)超
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)