一種提高芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率的方法
【專利摘要】本發(fā)明具體涉及一種提高芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。該提高芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率的方法，其特征是在發(fā)酵初期向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加定量乙醛，同時通過加入NaOH使發(fā)酵液PH的處于弱堿性狀態(tài)下，以提高芽孢桿菌的四甲基吡嗪產(chǎn)量。本發(fā)明的優(yōu)點如下：通過在發(fā)酵初期加入乙醛提高了四甲基吡嗪的產(chǎn)量，另外弱堿性條件控制顯著提高四甲基吡嗪產(chǎn)量，該方法不僅經(jīng)濟環(huán)保，而且生產(chǎn)成本低。
【專利說明】
一種提高芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種提高芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 四甲基吡嗪(TTMP)，又名川芎嗪，是中藥川芎中的有效活性成分，可以降血壓，在 治療腦血管、肺水腫、腎臟疾病方面有顯著療效，并在醫(yī)藥合成中被廣泛應(yīng)用，已作為常備 藥品廣泛應(yīng)用于臨床。TTMP又是一種重要的呈香物質(zhì)，天然存在于白酒、可可豆、茶、牛羊豬 肉、奶酪、堅果中，具有烤面包、烤肉等香氣，國家標準GB2760-1996規(guī)定其為允許使用的食 用香料。目前，在白酒行業(yè)中對吡嗪類化合物的研究已有較高的重視度，初步證實了白酒中 TTMP除美拉德途徑產(chǎn)生外，微生物代謝產(chǎn)物途徑也能產(chǎn)生TTMP，但其代謝途徑及調(diào)控機理 尚不明確。
[0003] 釀酒中產(chǎn)生吡嗪類化合物多以細菌發(fā)酵為主，尤其以芽孢桿菌類菌株中的枯草芽 孢桿菌和地衣芽孢桿菌為主。由于釀酒中產(chǎn)生TTMP的合成機理尚不清晰，通過野生菌株利 用自身代謝途徑發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的生產(chǎn)力較低;通過添加前體物質(zhì)(3-羥基丁酮)可以有效強 化代謝通路，但是生產(chǎn)成本較高、成本效益較低;通過發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化及對其發(fā) 酵過程的調(diào)控，可有效提高發(fā)酵體系中TTMP的產(chǎn)量，但存在產(chǎn)物抑制等現(xiàn)象的束縛;通過對 菌株進行基因改造也可有效提高TTMP的產(chǎn)量，但分子改造菌株應(yīng)用于食品發(fā)酵類的生產(chǎn)， 存在遺傳穩(wěn)定性和安全性的隱患，難以進行工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種低生產(chǎn)成本芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率 的方法。
[0005] 本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案如下： 一種提高芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率的方法，以芽孢桿菌為出發(fā)菌株的搖瓶發(fā)酵培 養(yǎng)，其特征是在發(fā)酵初期向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入乙醛至1. 〇 g/L，且在發(fā)酵過程中從第72h開 始，通過流加10m〇l/L NaOH控制發(fā)酵體pH處于弱堿條件下，發(fā)酵溫度為37 °C，繼續(xù)發(fā)酵至 TTMP達到峰值。
[0006] 經(jīng)實驗，所述制作種子液和發(fā)酵過程pH為7.5時取得效果最好。
[0007] 具體操作時，所述芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌(B.lincheniformis BL1)或枯草芽孢 桿菌(B.subtilis BS2)任一株。
[0008] 1.弱堿性條件控制提高TTMP產(chǎn)量 利用地衣芽抱桿菌（Baclicus lincheniformis BL1)、枯草芽抱桿菌（Baclicus subtilis BS2)利用發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的過程中，通過流加10mol/L NaOH控制 發(fā)酵體系pH呈弱堿性條件，期間向裝有200ml含70 g/L葡萄糖的YPG發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三 角瓶的發(fā)酵體系中，以每12 h補加5 mL濃度為1 mg/mL的葡萄糖溶液，發(fā)酵時間分別為 168h、192h。
[0009] 2.發(fā)酵初期添加乙醛 (1)在地衣芽孢桿菌(B.lincheniformis BL1)搖瓶發(fā)酵初期，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入乙 醛至1.0 g/L的乙醛，發(fā)酵時間為168h。
[0010] (2)在枯草芽孢桿菌(B.subtilis BS2)搖瓶發(fā)酵初期，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入乙醛 至1.0 g/L，發(fā)酵時間為192h。
[0011] 制作種子液，搖瓶制作種子液的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基的各種成份g / L計： 蛋白胨1 〇、酵母浸粉5、氯化鈉10，pH 7.0，121 ° C滅菌20min;培養(yǎng)方法:在無菌條件下，用接 種環(huán)取一環(huán)活化好的芽孢桿菌種接種到裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 °C、 200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h，然后按接種量2 % (V/V)接到裝有50 mL含10 g/L葡萄糖的 LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 °C、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h，調(diào)整菌體生長量OD600為0.05,作為種子液。
[0012]上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基也可以采用YPG培養(yǎng)基，所用YPG培養(yǎng)基每L含葡萄糖100 g， 蛋白胨30 g，酵母浸粉10 g，磷酸氫二銨30 g，pH調(diào)至7.5，121°C。
[0013] 發(fā)酵培養(yǎng)方法:將種子液按4 %的接種量(V/V)接種到裝有200ml含70 g/L葡萄糖 的YPG培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)，期間每12h補加5ml濃度為lmg/ 1111的葡萄糖溶液。從第7211開始，通過流加1〇111〇1/1他0田空制發(fā)酵體系?!1均為7.5，繼續(xù)發(fā)酵 至TTMP達到峰值。
[0014] 本發(fā)明提高芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率的方法的有益效果：生產(chǎn)過程操作簡 單，綠色環(huán)保，反應(yīng)溫和、且成本低，僅需要在發(fā)酵初期添加乙醛就可以調(diào)控提高發(fā)酵產(chǎn)物 3-羥基丁酮，四甲基吡嗪(TTMP)的產(chǎn)量。另外乙醛做為國家標準GB2760-1996規(guī)定的允許使 用的食用添加劑，本發(fā)明提高芽孢桿菌產(chǎn)四甲基吡嗪產(chǎn)量的作用優(yōu)越于培養(yǎng)基及發(fā)酵條件 的優(yōu)化方法，比通過分子改造菌株提高TTMP產(chǎn)量更安全穩(wěn)定，對環(huán)境無污染、無毒害，低用 量、無公害，操作簡單，用途廣等優(yōu)點。該技術(shù)符合我國節(jié)能減排的要求，并且可以變通運用 除地衣、枯草芽孢桿菌之外的類似機理的生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)當中去，具有廣闊的應(yīng)用前景，且適 于工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0015]圖1葡萄糖在BL1和BS2兩種芽孢桿菌中生成3-羥基丁酮和TTMP的共通代謝途 徑。
[0016] 圖2添加乙醛調(diào)控(實心)對B.lincheniformis BL1的TTMP產(chǎn)量（▲)菌體量(·） 和葡萄糖利用率（)的影響。
[0017] 圖3添加乙醛調(diào)控(實心）對B.subtilis BS2的TTMP產(chǎn)量（▲)菌體量（·）和葡萄 糖利用率（)的影響。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明，本發(fā)明利用芽孢桿菌生產(chǎn) 四甲基吡嗪的方法，以芽孢桿菌為出發(fā)菌株的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，其特征是在發(fā)酵初期向發(fā)酵 培養(yǎng)基中加入乙醛至1.0 g/L，且在發(fā)酵過程中從第72h開始，通過流加10m〇l/L NaOH控制 發(fā)酵體pH處于弱堿條件下，發(fā)酵溫度為37 °C，繼續(xù)發(fā)酵至TTMP達到峰值。
[0019] 實施例一:應(yīng)用pH控制發(fā)酵提高芽孢桿菌產(chǎn)TTMP的能力 步驟一:種子液的準備:在無菌條件下，用接種環(huán)取一環(huán)活化好的芽孢桿菌種接種到裝 有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 °C、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h，然后按接種量 2 % (V/V)接到裝有50 mL含10 g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 °C、200 r/ min搖床振蕩培養(yǎng)12 h，調(diào)整菌體濃度(OD600)為0.05，作為種子液。
[0020] 步驟二:將種子液按4 %的接種量(V/V)接種到裝有200ml含70 g/L葡萄糖的YPG培 養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)，期間每12h補加 5ml濃度為lmg/ml的葡萄 糖溶液，從第72h開始，通過流加 10m〇l/L NaOH控制發(fā)酵體系pH為6.5-8.5，繼續(xù)發(fā)酵至TTMP 達到峰值，發(fā)酵過程中間隔一定時間取樣分析發(fā)酵液中菌體濃度(〇D6Q())、TTMP和3-羥基丁 酮的含量。不同pH控制值下地衣芽孢桿菌(Baclicus lincheniformis BL1)、枯草芽孢桿菌 (Baclicus subtilis BS2)的菌體濃度(0D6Q())、TTMP和3-羥基丁酮的最大產(chǎn)量分別如表1所 示，當控制發(fā)酵液pH值為7.5時，地衣芽孢桿菌(B. lincheniformis BL1)和枯草芽孢桿菌 (B.subtilis BS2)的菌體濃度(0D6Q())、TTMP和3-羥基丁酮的產(chǎn)量均能達到最大值。
[0021 ]表 1 培養(yǎng)條件中pH對B. lincheniformis BL1 和B.subtilis BS2產(chǎn)物3-羥基丁酮和 TTMP的影響
3從接種到3-羥基丁酮產(chǎn)量達到最高時的發(fā)酵時間。 1 b從接種到TTMP產(chǎn)量達到最高時的發(fā)酵時間。
[0023]數(shù)據(jù)是三組實驗的平均值和標準偏差。
[0024]實施例二:應(yīng)用發(fā)酵初期添加乙醛調(diào)控TTMP產(chǎn)量的能力 按照實施例1中的種子液制備及控制發(fā)酵液pH值為7.5時的發(fā)酵方法，在發(fā)酵初期向培 養(yǎng)基加入梯度濃度的乙醛:1.0，2.0，4.0和8.0 g/L，進行發(fā)酵試驗至TTMP達到峰值，發(fā)酵過 程中間隔一定時間取樣分析發(fā)酵液中菌體濃度(〇D_)、TTMP和3-羥基丁酮的含量。
[0025] 1)隨著乙醛添加量由0 g/L增加到1.0 g/L，地衣芽孢桿菌（B.lincheniformis BL1)產(chǎn)TTMP的最高產(chǎn)量由37.89 g/L提高到43.13 g/L。當培養(yǎng)基中乙醛的添加量提高到 1.0 g/L以上時，發(fā)酵產(chǎn)物TTMP的產(chǎn)量不再增加并且隨著乙醛添加量的增加有所減少。同 時，隨著添加乙醛量的增加，細胞生長受到較大影響。乙醛的添加，可以提高TTMP和3-羥基 丁酮的產(chǎn)量，對菌體細胞生長量有較大抑制作用，對葡萄糖利用率也有影響，見表2,圖2。綜 合考慮發(fā)酵時間以及乙醛添加量、產(chǎn)物量，可見，乙醛調(diào)控地衣芽孢桿菌 (B.lincheniformis BL1)發(fā)酵產(chǎn)物，最佳添加量為1.0 g/L，發(fā)酵168h可以得到43.13 g/L TTMP的產(chǎn)量?？傮w上，添加乙醛調(diào)控3-羥基丁酮和TTMP的產(chǎn)量影響有一致性，針對地衣芽孢 桿菌(B. lincheniformis BL1)的發(fā)酵生產(chǎn)是有效可行的。
[0026] 2)隨著乙醛添加量由0 g/L增加到1.0 g/L，枯草芽孢桿菌(B.subtilis BS2)產(chǎn) TTMP的最高產(chǎn)量由21.84 g/L提高到27.64 g/LJTMP的合成受添加乙醛的影響，當培養(yǎng)基 中乙醛的添加量提高到1.0 g/L以上時，發(fā)酵產(chǎn)物TTMP的產(chǎn)量不再增加并且隨著乙醛添加 量的增加有較大降低，當乙醛的添加量提高到8.0 g/L時，TTMP和3-羥基丁酮的產(chǎn)量都降到 1.0 g/L以下。同時，隨著乙醛添加量的增加，細胞生長受到較大影響。乙醛的添加，可以提 高TTMP和3-羥基丁酮的產(chǎn)量，對菌體細胞生長量有很大的抑制作用，對葡萄糖利用率也有 影響，見表2,圖3。綜合考慮發(fā)酵時間以及乙醛添加量、產(chǎn)物量，可見，乙醛調(diào)控枯草芽孢桿 菌(B.subtilis BS2)發(fā)酵產(chǎn)物，最佳添加量為1.0 g/L，發(fā)酵192h可以得到27.64 g/L TTMP 的產(chǎn)量?？傮w上，添加乙醛調(diào)控3-羥基丁酮和TTMP的產(chǎn)量影響有一致性，針對枯草芽孢桿菌 (B.subtilis BS2)的發(fā)酵生產(chǎn)是有效可行的。
[0027]表2乙醛調(diào)控對B.lincheniformis BL1 和B.subtilis BS2產(chǎn)物3-羥基丁酮和TTMP 的影響

3從接種到3-羥基丁酮產(chǎn)量達到最高時的發(fā)酵時間。
[0028] b從接種到TTMP產(chǎn)量達到最高時的發(fā)酵時間。
[0029]數(shù)據(jù)是三組實驗的平均值和標準偏差。
[0030]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非以限定本發(fā)明，對本領(lǐng)域的技術(shù) 人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做 出其它各種相應(yīng)的改變和修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。 [0031 ] 在研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期定量添加乙醛能夠?qū)⒌匾卵挎邨U菌(B. lincheniformis BL1)TTMP的產(chǎn)量提高13.8 %，達到43.13 g/L;能夠?qū)⒖莶菅挎邨U菌(B.subtilis BS2)的 TTMP產(chǎn)量提高26.6 %，達到27.64 g/L，同時也能提高兩種芽孢桿菌3-羥基丁酮的產(chǎn)量。研 究人員推測發(fā)酵初期添加乙醛可能對催化3-羥基丁酮生成乙醛的3-羥基丁酮脫氫酶系活 性具有抑制作用，阻遏自身乙醛的合成，從而減少消耗3_羥基丁酮形成乙醛的程度，同時能 夠增強乙醛向乙酰輔酶A的代謝生成，間接反饋抑制丙酮酸向乙酰輔酶A的代謝支路，增強 丙酮酸向3-羥基丁酮的代謝支路，增大TTMP的前體物質(zhì)3-羥基丁酮的積累量，從而提高 TTMP的產(chǎn)量，兩種芽孢桿菌的共通代謝途徑如圖1所示。
【主權(quán)項】
1. 一種提高芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率的方法，以芽孢桿菌為出發(fā)菌株的搖瓶發(fā)酵 培養(yǎng)，其特征是在發(fā)酵初期向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入乙醛至1.0 g/L，且在發(fā)酵過程中從第72h 開始，通過流加 10m〇l/L NaOH控制發(fā)酵體pH處于弱堿條件下，發(fā)酵溫度為37 °C，繼續(xù)發(fā)酵 至TTMP達到峰值。2. 如權(quán)利要求1所述的提高芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率的方法，其特征是:所述制作 種子液和發(fā)酵過程pH為7.5。3. 如權(quán)利要求1所述的提高芽孢桿菌發(fā)酵四甲基吡嗪產(chǎn)率的方法，其特征是:所述芽孢 桿菌為地衣芽孢桿菌(B. lincheniformis BL1)或枯草芽孢桿菌(B. subtilis BS2)任一株。
【文檔編號】C12P17/12GK105838751SQ201610151073
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月17日
【發(fā)明人】孟武, 王瑞明, 王松江, 王騰飛, 王婷
【申請人】齊魯工業(yè)大學(xué), 諸城東曉生物科技有限公司