香蕉抗氧化相關(guān)蛋白MaBBI1及其基因的新應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了香蕉抗氧化相關(guān)蛋白MaBBI1及其編碼基因在改良植物對氧化脅迫耐受性和抗病菌的應(yīng)用。該基因在工程菌釀酒酵母中表達(dá)可以提高酵母對H2O2脅迫的耐受能力，表明MaBBI1蛋白具有抗氧化的能力，同時(shí)誘導(dǎo)分離純化到的MaBBI1蛋白在體外還具有抑制病原菌生長的效果，表明MaBBI1蛋白具有抗菌肽的功能。該基因具有應(yīng)用于植物抗病害遺傳工程育種的潛力，通過調(diào)控該基因在植物中的表達(dá)，可以改變轉(zhuǎn)基因植物對病原菌的耐受性。
【專利說明】
香蕉抗氧化相關(guān)蛋白MaBBM及其基因的新應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及香蕉抗氧化相關(guān)蛋白MaBBIl (Musa acuminata Bowman-Birk inhibitor j_)及其編碼基因和在調(diào)控釀酒酵母對氧化脅迫耐受 性和/抗病原菌方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 已有研究表明，自然界多數(shù)逆境脅迫均可引起細(xì)胞不同程度的氧化損傷，H202作為 一種活性氧，其在細(xì)胞內(nèi)大量積累能夠破壞氧化代謝平衡，對細(xì)胞造成氧化損傷。抗氧化的 作用途徑之一是通過阻止超氧化物陰離子基團(tuán)的釋放從而達(dá)到抗氧化的目的。BBI (Bowman-Birk inh ib i tor)是一種富含半胱氨酸的植物蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、糜蛋白 酶及彈性蛋白酶等絲氨酸蛋白酶均有抑制作用，BBI可以抑制病原菌蛋白酶對寄主細(xì)胞的 降解，使病原菌營養(yǎng)不足，生長繁殖受限，浸染與擴(kuò)展受阻，從而達(dá)到抗病的目的。另外，BBI 蛋白可以抑制自由基的產(chǎn)生、減少活性氧的含量，有效清除細(xì)胞內(nèi)富余的活性氧，降低細(xì)胞 的氧化損傷，維持細(xì)胞內(nèi)氧化代謝的平衡，從而達(dá)到抗氧化的作用。
[0003] 香蕉測序品種芭蕉亞種的基因序列表明，香蕉中至少存在9個(gè)BBI相關(guān)蛋白。參與 應(yīng)答香蕉激素處理、逆境脅迫的表達(dá)反應(yīng)。該基因編碼一個(gè)香蕉抗氧化相關(guān)蛋白基因，該基 因在NCBI (http://www.ncbi ? nlm.nih.gov/)已公布的測序品種巴蕉亞種(Musa acuminata subsp)的編號為L0C103995028,命名為MaBBIl(Musa acuminata Bowman-Birk inhibitor 1)。該基因編碼一個(gè)包含381個(gè)核苷酸的開放閱讀框，其序列如SEQ ID NO. 1所示。其編碼蛋 白具有126個(gè)氨基酸殘基，其序列如SEQ ID N0.2所示。
[0004] 寒冷、干旱、鹽堿、機(jī)械損傷等逆境脅迫均可引起植物細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子的積累而 導(dǎo)致氧化損傷，繼而導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量下降，品質(zhì)不佳。因此，通過克隆香蕉氧化脅迫耐受相 關(guān)基因，并研究該基因?qū)ο憬犊寡趸饔玫挠绊?，具有重要的意義。
[0005] 目前，還沒有文獻(xiàn)報(bào)道香蕉抗氧化相關(guān)蛋白MaBBIl基因是否能影響氧化損傷在香 蕉中的耐受。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種香蕉抗氧化相關(guān)蛋白MaBBIl及其編碼基因 MaBBIl的新應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白MaBBIl，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其編碼 基因MaBBIl的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。應(yīng)當(dāng)理解，考慮到密碼子的簡并性， 在不改變氨基酸序列的前提下，對上述編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行修改，也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍內(nèi)。
[0008] 氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白MaBBIl和/或MaBBIl基因 在提高轉(zhuǎn)基因植物對氧化脅迫的耐受和/或抗病原菌中的應(yīng)用，所述MaBBI 1基因的cDNA為 如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO. 1互補(bǔ)配對的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a 氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白的核苷酸序列。
[0009]優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物為香蕉。
[0010]優(yōu)選地，造成氧化脅迫的氧化劑為H2O2。
[0011] 氨基酸序列如SEQ ID如.2所示的]\^8811和/或1^8811基因在香蕉育種中調(diào)控香 蕉抗氧化和/或抗病原菌的應(yīng)用，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序 列，或?yàn)榕cSEQ ID NO. 1互補(bǔ)配對的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示 的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白的核苷酸序列。
[0012]本發(fā)明將MaBBIl基因應(yīng)用于植物基因工程中，用于改變轉(zhuǎn)基因植物對氧化脅迫耐 受的可能性。本發(fā)明公開了 MaBBIl基因在甲基紫精、重金屬鎘、寒冷、干旱下的誘導(dǎo)表達(dá)特 征，表明了該基因參與直接的氧化脅迫和多種逆境脅迫的應(yīng)答。本發(fā)明采用real-time RT-PCR的方法鑒定了 MaBBIl基因在甲基紫精、重金屬鎘、寒冷、干旱逆境脅迫及激素處理下的 表達(dá)特征，表明該基因在包括氧化脅迫在內(nèi)的多種脅迫處理下均有誘導(dǎo)表達(dá)的特征，而在 葉中的表現(xiàn)尤其明顯，論證了該基因?yàn)橄憬扼w內(nèi)應(yīng)答氧化脅迫及其他脅迫的重要基因，進(jìn) 一步延伸了該基因作為影響香蕉氧化脅迫的候選功能基因。在本發(fā)明中，MaBBIl基因的表 達(dá)還受茉莉酸甲酯、水楊酸、赤霉素、脫落酸誘導(dǎo)，進(jìn)一步表明了該基因也參與調(diào)控了上述 代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，可將該基因應(yīng)用于上述基因工程領(lǐng)域。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是公開一種釀酒酵母重組表達(dá)載體及其應(yīng)用，該重組載體插入 了MaBBIl基因。將該重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母中，通過半乳糖誘導(dǎo)該基因在酵母中的超 表達(dá)，能夠在H 2〇2脅迫下，提高酵母對H2〇2的耐受，以及表達(dá)純化得到的MaBBI 1蛋白具有抗 病菌的作用。
[0014] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0015] 插入有MaBBIl基因的釀酒酵母重組表達(dá)載體，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.2互補(bǔ)配對的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列 如SEQ ID N0.2所示的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白的核苷酸序列。
[0016] 上述釀酒酵母重組表達(dá)載體在提高工程菌株釀酒酵母對h2〇2的耐受性和/或抗病 原菌中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的另一目的是提供一種改良香蕉中氧化脅迫的耐受性和/或抗病原菌的生 物制劑。
[0018] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0019] -種提高香蕉中氧化脅迫耐受性的生物制劑，其活性成份為上述釀酒酵母重組表 達(dá)載體，或其活性成份含有MaBBIl基因，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID NO. 1所示的核 苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO. 1互補(bǔ)配對的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白的核苷酸序列。
[0020] -種提高香蕉中抗病原菌的生物制劑，其活性成份為權(quán)利要求5所述的釀酒酵母 重組表達(dá)載體，或其活性成份含有MaBBIl基因，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID NO. 1所 示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.1互補(bǔ)配對的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白的核苷酸序列；或其活性成份為氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的香蕉MaBBI 1蛋白。優(yōu)選地，所述病原菌是大腸桿菌。
[0021] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0022]在本發(fā)明中，我們通過對篩選文庫獲得的MaBBIl基因的進(jìn)行應(yīng)用性探索，發(fā)現(xiàn)該 基因以下應(yīng)用方式:一方面，該基因在釀酒酵母中的超量表達(dá)能夠提高酵母對H2〇2的耐受 性。另一方面，通過誘導(dǎo)原核超表達(dá)制備的MaBBIl蛋白在體外具有抑制病原菌生長的作用。 [0023] 本發(fā)明也可推廣至農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，通過改變MaBBIl基因在農(nóng)作物中的表達(dá)， 一方面可以調(diào)控農(nóng)作物對多種逆境脅迫引起氧化損傷的耐受性。另一方面可以調(diào)控農(nóng)作物 對病害的耐受性。從改變農(nóng)作物對多種逆境脅迫的適應(yīng)性。
[0024] MaBB11基因具有應(yīng)用于植物抗病害遺傳工程育種的潛力，通過調(diào)控該基因在植物 中的表達(dá)，可以改變轉(zhuǎn)基因植物對病原菌的耐受性。從而克服逆境脅迫引起的氧化損傷以 及病原菌感染而導(dǎo)致的品質(zhì)下降問題。該基因具有應(yīng)用于農(nóng)作物抗氧化和抗病原菌的遺傳 工程育種的潛力。
【附圖說明】
[0025]圖1示香蕉MaBBIl基因應(yīng)答氧化脅迫及其他逆境和激素脅迫的real-time RT-PCR 檢測。
[0026] 圖2示構(gòu)建完成的釀酒酵母重組表達(dá)載體MaBBIl-pYES260示意圖。
[0027] 圖3示轉(zhuǎn)化MaBBIl_pYES260的轉(zhuǎn)基因酵母A skn7對H202脅迫的耐受性提高。
[0028] 圖4示轉(zhuǎn)化MaBBIl_pYES260的轉(zhuǎn)基因酵母A yapl對H202脅迫的耐受性提高。
[0029] 圖5示構(gòu)建完成的MaBB 11蛋白表達(dá)載體MaBB 11 -PGEX-6p-l示意圖。
[0030] 圖6示成功誘導(dǎo)、純化GST-MaBBIl重組蛋白。
[0031] 圖7示復(fù)性的GST-MaBBIl重組蛋白體外抑制大腸桿菌(DH5a)生長圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]本發(fā)明描述了該MaBBIl基因在生物工程方面的應(yīng)用。將本基因在釀酒酵母中誘導(dǎo) 表達(dá)，可以提高酵母對H2〇2的耐受性;依次列推，由于該基因來源于香蕉，通過控制該基因在 香蕉中的表達(dá)，也可將該基因應(yīng)用于香蕉基因工程育種，用于培育耐氧化的香蕉轉(zhuǎn)基因品 種。
[0033] MaBBIl基因cDNA序列（SEQ ID N0.1)
[0035] MaBBIl蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO.2)
[0037] 本發(fā)明以巴西小果野蕉苗葉為材料提取RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模 板，設(shè)計(jì)引物 MaBBI 1YEF: 5 ' -TACCGAGCTCGGATCCATGAGGTACAACATGGTGG-3 ' 和 MaBBI 1YER: 5 ' - TAGATGCATGCTCGAGCTACTGGGCGAGGAGCG-3'，并采用高保真的Taq酶擴(kuò)增MaBBI 1 基因的cDNA 閱讀框全長，回收得到的片段連接于酵母表達(dá)載體PYES260,形成重組載體MaBBIl-PYES260,并測序。
[0038]采用醋酸鋰的方法將重組載體MaBBIl_pYES260轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母中，采用誘導(dǎo)的 極限培養(yǎng)基(添加半乳糖)培養(yǎng)酵母轉(zhuǎn)化子克隆，以轉(zhuǎn)化PYES260空載體的酵母菌株為對照， 30°C培養(yǎng)酵母至OD600為1.5-2，用于檢測轉(zhuǎn)基因酵母菌對H 2〇2脅迫的耐受性。
[0039]以下通過實(shí)施例結(jié)合圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0040] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989)中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售 產(chǎn)品。
[0041] 除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí) 施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語"和/或"包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列 項(xiàng)目的任意的和所有的組合。
[0042]實(shí)施例l:MaBBIl基因的表達(dá)受甲基紫精(MV)、重金屬鎘、低溫、甘露醇(Manntiol) 誘導(dǎo)及激素茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)的調(diào)控。
[0043] 本研究用巴西小果野巴蕉苗(Musa acuminata)兩周的出根苗為實(shí)驗(yàn)材料，23°C培 養(yǎng)室（16h光照/8h黑暗）用1/2MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，分別用甲基紫精（100yM)、CdCl2 (0 ? 5mM)、4°C、甘露醇（200yM)、茉莉酸（100yM)、水楊酸（100yM)、赤霉素（100yM)、ABA(100y 1)、處理。收集脅迫處理011、111、611、2411后的香蕉葉和根各0.58，用于提取總1?^。1?^的提取 依照Magen公司HiPure Plant RNA Kits(R4151)的說明書進(jìn)行。采用兩步法以總RNA為模板 逆轉(zhuǎn)錄cDNAdcDNA鏈的合成依照全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的說明書進(jìn)行。
[0044]通過網(wǎng)站QuantPrime(http: //www. quantprime ? de/)在線設(shè)計(jì)real-time RT-PCR 引物。引物序列如下所示。MaBBI IF : ATGGACCGGATCCCCAACTA和MaBBI 1R : Green Supermix的說明書配制real time RT-PCR反應(yīng)體系(冰上操作）。選用的香蕉內(nèi)參基 因八0'頂，引物如下：]\^八0'11^^(5'-丁66丁八丁66八八6(^6(^66丁八-3'）和]\^八0'11^1?(5'-TCTGCTGGAATGTGCTGAGG-3'）（SEQ ID N0.5和SEQ ID 勵(lì).6)。采用兩步法?0?反應(yīng)，擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn) 程序如下：
[0046] 所有檢測均采用兩個(gè)生物學(xué)樣本重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)樣本進(jìn)行三次重復(fù)檢測反應(yīng)。 引物第一次使用時(shí)添加程序Stage3檢測溶解曲線，確認(rèn)引物的特異性。
[0047] 當(dāng)植物感受到逆境脅迫后，能夠通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程將刺激信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部， 調(diào)控基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成，從而減少逆境脅迫對自身的傷害。外界逆境脅迫均可引 起細(xì)胞不同程度的氧化損傷，BBI蛋白可以抑制自由基的產(chǎn)生、減少活性氧的含量，有效清 除細(xì)胞內(nèi)富余的活性氧，降低細(xì)胞的氧化損傷，維持細(xì)胞內(nèi)氧化代謝的平衡，從而達(dá)到抗氧 化的作用。如圖1所示，在氧化脅迫（甲基紫精模擬)處理下，MaBBIl基因在根和葉中的表達(dá) 量均明顯上調(diào)。MaBB 11基因在根中的表達(dá)收到重金屬鎘的誘導(dǎo)，在葉中的表達(dá)收到低溫和 干旱脅迫(甘露醇模擬）的誘導(dǎo)。在茉莉酸和脫落酸處理下，MaBBIl基因在根和葉中的表達(dá) 量均顯著提高。在水楊酸和赤霉素處理下，MaBBIl基因在葉中的表達(dá)量均顯著提高?；虻?表達(dá)總是與其功能相聯(lián)系，表明MaBBIl基因參與應(yīng)答甲基紫精、重金屬鎘、低溫和甘露醇脅 迫引起的氧化損傷，以及作為茉莉酸、水楊酸、赤霉素、脫落酸信號調(diào)節(jié)途徑的下游基因，參 與上述植物激素介導(dǎo)的對逆境脅迫的應(yīng)答。
[0048] 實(shí)施例2:MaBBIl基因的克隆和酵母重組表達(dá)載體MaBBIl-pYES260的構(gòu)建 [0049] 取巴西小果野蕉幼苗的葉，提取幼葉的RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計(jì) 引物MaBBI 1YEF: 5 ' -TACCGAGCTCGGATCCATGAGGTACAACATGGTGG-3 ' 和]\^8811丫￡1?:5'-TAGATGCATGCTCGAGCTACTGGGCGAGGAGCG-3'（SEQ ID N 0.7和SEQ ID N0.8)，采用高保真的 Taq酶PCR擴(kuò)增MaBBIl基因的cDNA閱讀框全長。采用的PCR體系參考TaKaRa公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer說明書。擴(kuò)增的DNA片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits說明書。回收得到的片段用于插入至酵母表達(dá)載體pYES60中。釀酒酵母表達(dá) 載體PYES260經(jīng)BamHI和Xhol雙酶切處理，回收線性化質(zhì)粒?；厥蘸蟮腗aBBI 1片段和線性化 pYES260質(zhì)粒經(jīng)Nanodrop公司紫外分光光度計(jì)測定濃度，采用TaKaRa(Clontech)公司的 In-I?U.si〇n?_HD Cloning Ki t進(jìn)行DNA片段和載體的同源重組連接。按照說明書的方法將反 應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定為正確的陽性 克隆后，保存質(zhì)粒備用。經(jīng)測序分析后，MaBBIl的cDNA核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所編 碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。構(gòu)建好的釀酒酵母重組表達(dá)載體MaBBIl-PYES260如圖2所示。
[0050]實(shí)施例3:MaBBIl基因在釀酒酵母中的表達(dá)提高酵母對氧化脅迫的耐受性 [0051 ] 培養(yǎng)釀酒酵母菌株A skn7和A yapl(購自歐洲酵母研究中心Euroscarf，http:// web ? uni-frankfurt ? de/fbl5/mikro/euroscarf /，菌株編號Y02900和Y00569)，用pYES260 質(zhì)粒和重組的MaBBI l-pYES260對上述酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由于MaBBI 1基因是置于酵母半乳糖誘 導(dǎo)的啟動子PGAL1調(diào)控之下(見圖1所示），將MaBBIl-pYES260轉(zhuǎn)化釀酒酵母并置于添加半乳 糖的生長選擇合成培養(yǎng)基（Selective Growth Synthetic Medium，SD medium)上生長，即 可誘導(dǎo)MaBBIl在酵母中異源超量表達(dá)。
[0052]酵母轉(zhuǎn)化采用的方法為醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，具體步驟如下：
[0053] 1)接種待轉(zhuǎn)化的酵母菌株A skn7和A yapl的單菌落分別于5mL YPD液體培養(yǎng)基 中，于30°C恒溫?fù)u床(200rpm)，培養(yǎng)過夜達(dá)到飽和。
[0054] 2)按照1: 100比例轉(zhuǎn)移上述培養(yǎng)物到20mL YPD液體培養(yǎng)基中于30°C恒溫?fù)u床 (200rpm)繼續(xù)培養(yǎng)，搖3-5h至菌液0D_值達(dá)0 ? 4-0 ? 6 ?
[0055] 3)培養(yǎng)液在室溫條件下4000g離心5min，收集細(xì)胞。細(xì)胞用10mL無菌超純水重懸， 再于室溫下5000-6000g離心5min，沉淀細(xì)胞。
[0056] 4)細(xì)胞用2mL鋰鹽溶液重懸，鋰鹽溶液按照下表配制(現(xiàn)配現(xiàn)用）：
[0058] 5)將2yL待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和10yL變性鮭魚精一起加入1.5mL離心管中混勻。
[0059] 6)往每個(gè)離心管中加入200此用鋰鹽溶液重懸的細(xì)胞懸液，再加入lmL新鮮配制的 PEG溶液。PEG溶液的配方為：
[0061 ] 3(TC 搖蕩溫育 30min。
[0062] 7)于42°C熱激15min，室溫下離心5s，細(xì)胞沉淀用200yL-l mL 1XTE緩沖液（從10 X儲液新鮮配制）重懸，并取其中200yL涂布在添加了半乳糖的SD固體培養(yǎng)基平板上。30 °C 培養(yǎng)2-5天，直到出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。
[0063] 挑取酵母菌株A skn7和Ayapl轉(zhuǎn)化空載體pYES260和MaBBIl基因超表達(dá)載體 MaBBIl-pYES260的單克隆，接種于2ml添加了半乳糖的SD液體培養(yǎng)基中，30°C恒溫?fù)u床 (200rpm)培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000將菌液進(jìn)行逐級稀釋，分別 吸取2yl逐級稀釋的菌液滴至添加有不同濃度(0.25禮、0.40禮、0.601111)11 202的30(添加半乳 糖)固體培養(yǎng)基平板上。30°C培養(yǎng)2天，觀察酵母生長情況。
[0064] 如圖3、4所示，超表達(dá)MaBBIl基因的轉(zhuǎn)基因酵母相比較于轉(zhuǎn)化空載體pYES260的A skn7和Ayapl酵母突變株而言，能夠在添加〇.25mM H2〇2的SD中生長，而未表達(dá)MaBBIl基因 的酵母(轉(zhuǎn)化空載體PYES260)則不能生長，表明MaBBIl基因在酵母中的表達(dá)能夠提高酵母 對氧化脅迫的耐受性。
[0065] 實(shí)施例4 :MaBBI 1蛋白表達(dá)載體MaBBI l-PGEX-6p-l的構(gòu)建
[0066] 以MaBBIl-pYES260 質(zhì)粒為模版，設(shè)計(jì)引物MaBBIlPEF:5'_ GGGGCCCCTGGGATCCATGAGGTACAACATGGTG-3mMaBBIlYER:5'_ Taq酶PCR擴(kuò)增MaBBIl基因的全長。采用的PCR體系參考TaKaRa公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer說明書?；厥盏玫降钠斡糜诓迦胫恋鞍妆磉_(dá)載體PGEX_6p_l 中。蛋白表達(dá)載體PGEX-6p-l經(jīng)BamHI酶切處理，回收線性化質(zhì)粒。回收后的MaBBI 1片段和線 性化PGEX-6p_l質(zhì)粒經(jīng)Nanodrop公司紫外分光光度計(jì)測定濃度，采用TaKaRa( Clontech)公 司的丨n-Fusion'SHD Cloning Kit進(jìn)行DNA片段和載體的同源重組連接。按照說明書的方法 將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)菌株。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定為正確的 陽性克隆后，保存質(zhì)粒備用。經(jīng)測序分析后，MaBBIl的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。構(gòu)建好的釀酒酵母重組表達(dá)載體MaBBIl-PGEX-6p-l如圖5所示。
[0067] 實(shí)施例5:MaBBIl蛋白誘導(dǎo)及純化
[0068] 將測序正確MaBBIl-PGEX-6p_l轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rossetta菌株中，用100ml的2XYT溶 液（加Kan，Amp，Crm，三種抗生素）培養(yǎng)含有MaBBI 1-GST的Rossetta菌株，37°C，200rpm，待 0D600至0.4-0.6時(shí)，加入終濃度為0.2mM的IPTG，37°C，200rpm再搖4h，取菌體進(jìn)行SDS聚丙 烯酰胺凝膠電泳，電泳檢測誘導(dǎo)結(jié)果如圖6-A所示。將菌液離心后收集菌體置于冰上，用4ml 1 XPBS buffer重懸，用03的探頭，在冰上用20%的功率超聲破碎上述混合樣品，超聲 9sec，停止9sec，共超聲30min至菌液變得清澈。lOOOOrpm離心30min。取上清和沉淀，SDS聚 丙烯酰胺凝膠電泳，MaBBIl蛋白形成包涵體在沉淀中如圖6-B所示，故需將包涵體變性再復(fù) 性。
[0069] 包涵體變性復(fù)性過程為：將沉淀用洗滌緩沖液（10mM Tris-HCL pH7.8,300mM NaCl，lmM EDTA，l%TritonX-100，lM urea)洗滌，再加入2ml溶解緩沖液（50mM Tirs-HCl pH7 ? 8，5mM MgC12，2? 5mM0-mercaptoethanol，0? 1 %Tween20，8M urea)重懸，用3的探頭， 在冰上用20%的功率超聲破碎上述混合樣品，超聲986〇，停止986〇，共超聲3〇111；[11至沉淀溶 解。lOOOOrpm離心30min，取上清。再往上清中逐滴加入復(fù)性緩沖液(0.4M L-Arginine，2mM DTT，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH8.0)至尿素終濃度為 1M。將復(fù)性液用lXPBS(pH8.0)透 析，PGE20000濃縮至體積為2ml，電泳檢測如圖6-C所示。
[0070] 實(shí)施例6:MaBBIl蛋白體外抑制大腸桿菌(DH5a)生長
[0071]采用瓊脂擴(kuò)散的牛津杯法測試復(fù)性的MaBBIl蛋白對大腸桿菌(DH5a)活性的抑制。 采用牛血清蛋白BSA作為陰性對照，將樣品MaBBIl蛋白（實(shí)施例5純化得到)和對照BSA用PBS 緩沖液溶解，使樣品和對照的濃度分別為〇.35mg ? ml/1。
[0072] 在大腸桿菌的抑制實(shí)驗(yàn)中，先在平板上薄鋪一層新鮮LB固體培養(yǎng)基，待冷卻凝固 后將兩個(gè)高溫滅菌的牛津杯分別置于平板上，用搖培過夜的菌液與加熱溶解并冷卻至55°C 的新鮮LB固體培養(yǎng)基以1:250比例混合稀釋成菌懸液，并將菌懸液均勻涂布在新鮮LB固體 培養(yǎng)基上，待菌懸液凝固時(shí)拔掉牛津杯，分別往每個(gè)牛津杯孔中加入1 〇〇此樣品溶液與對 照，放置于37°C恒溫箱培養(yǎng)15h，抑菌效果如圖7所示，加入了 MaBBIl蛋白的牛津杯孔周圍形 成了一個(gè)抑菌圈，大腸桿菌不能生長，而加入牛血清蛋白的牛津杯孔周圍的大腸桿菌則正 常生長?？梢?，所述MaBBI 1蛋白可以調(diào)控農(nóng)作物對病害的耐受性。從改變農(nóng)作物對多種逆境 脅迫的適應(yīng)性。
[0073] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 氨基酸序列如SEQ ID ^).2所示的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白1^8811和/或1^8811基因在 提高轉(zhuǎn)基因植物對氧化脅迫的耐受和/或抗病原菌中的應(yīng)用，所述MaBBI 1基因的cDNA為如 SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.1互補(bǔ)配對的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，所述轉(zhuǎn)基因植物為香蕉。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，造成氧化脅迫的氧化劑為H2〇2。4. 氨基酸序列如SEQ ID ^).2所示的1&^811和/或1^^811基因在香蕉育種中調(diào)控香蕉 抗氧化和/或抗病原菌的應(yīng)用，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序 列，或?yàn)榕cSEQ ID NO. 1互補(bǔ)配對的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示 的香蕉抗氧化相關(guān)相關(guān)蛋白的核苷酸序列。5. 插入有MaBBI 1基因的釀酒酵母重組表達(dá)載體，所述MaBBI 1基因的cDNA為如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.2互補(bǔ)配對的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列 如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白的核苷酸序列。6. 權(quán)利要求5所述的釀酒酵母重組表達(dá)載體在提高工程菌株釀酒酵母對H2〇2的耐受性 和/或抗病原菌中的應(yīng)用。7. -種提高香蕉中氧化脅迫耐受性的生物制劑，其特征是，其活性成份為權(quán)利要求5所 述的釀酒酵母重組表達(dá)載體，或其活性成份含有MaBBI 1基因，所述MaBBI 1基因的cDNA為如 SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.1互補(bǔ)配對的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白的核苷酸序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物制劑，其特征是，造成氧化脅迫的氧化劑為H2〇2。9. 一種提高香蕉中抗病原菌的生物制劑，其特征是，其活性成份為權(quán)利要求5所述的釀 酒酵母重組表達(dá)載體，或其活性成份含有MaBBIl基因，所述MaBBIl基因的cDNA為如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或?yàn)榕cSEQ ID NO.1互補(bǔ)配對的核苷酸序列，或?yàn)榫幋a氨基酸序列 如SEQ ID NO.2所示的香蕉抗氧化相關(guān)蛋白的核苷酸序列；或其活性成份為氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示的香蕉MaBBIl蛋白。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物制劑，其特征是，所述病原菌是大腸桿菌。
【文檔編號】A01P1/00GK105820240SQ201610333529
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】楊禮香, 黃司法, 唐志敏
【申請人】廣州大學(xué)