一種培養(yǎng)基中菌體濃度的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種測(cè)定復(fù)合培養(yǎng)基中菌體濃度的改 進(jìn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 菌體濃度的測(cè)定是反映微生物生長(zhǎng)代謝情況的一項(xiàng)重要指標(biāo)，需要較為準(zhǔn)確的數(shù) 據(jù)才能較好控制各項(xiàng)生產(chǎn)流程。現(xiàn)有工業(yè)化微生物發(fā)酵過(guò)程中，由于經(jīng)常使用含有大量固 休成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，如黃豆餅粉、花生餅粉等，而運(yùn)些固體成分與菌體混在一起，使發(fā)酵 液中菌體濃度的測(cè)定成為一個(gè)復(fù)雜而又困難的問(wèn)題，長(zhǎng)期W來(lái)一直懸而未決。
[0003] 目前大多數(shù)抗生素工廠測(cè)定發(fā)酵液菌體濃度時(shí)，一般均是采用裝量體積法(細(xì)胞 堆積容積測(cè)量法，離屯、壓縮細(xì)胞體積法，The Packed-Cell volume Me1:hod)。但實(shí)際使用過(guò) 程中，運(yùn)種方法受發(fā)酵液中固體原料成分的影響較大，而且在菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期使用該方法 時(shí)，所測(cè)菌體濃度值的增加主要是一些脂類(lèi)及次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的結(jié)果，并不能真正代表 菌體濃度的變化。因而裝量體積法測(cè)得的數(shù)值是菌體濃度及固體培養(yǎng)基成分兩個(gè)變量互相 加合的結(jié)果，并不能反應(yīng)真正的菌體濃度。并且，使用該方法測(cè)定的數(shù)據(jù)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中 無(wú)明顯規(guī)律，也無(wú)法反映菌體真正的生長(zhǎng)規(guī)律。
[0004] 現(xiàn)有菌體濃度測(cè)定中，另外一種較為準(zhǔn)確和常用的測(cè)定方法是測(cè)定培養(yǎng)基中菌體 所含核酸的濃度，把核酸的量作為衡量菌體濃度的指標(biāo)，而菌體中核酸的提取主要通過(guò)TCA 萃取法獲得。但實(shí)際使用過(guò)程中，該方法受培養(yǎng)基成分影響較大。例如，發(fā)酵培養(yǎng)基中如果 含有不溶性成分如黃豆粉、花生粉等，其可能含有少量核酸或核酸類(lèi)似物，而運(yùn)些物質(zhì)與菌 體中的核酸一起被萃取入TCA中，從而給測(cè)定帶來(lái)一定程度的干擾;尤其是當(dāng)培養(yǎng)基中采用 胚芽粉類(lèi)物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，其含有高含量的核酸，經(jīng)常會(huì)對(duì)測(cè)量值造成嚴(yán)重的干擾。因 而對(duì)該方法尚需進(jìn)一步地改進(jìn)，W獲得更為準(zhǔn)確的菌體濃度數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)型的測(cè)定發(fā)酵液中核酸濃度的TCA測(cè)定法，從而 更為準(zhǔn)確的反映菌體濃度數(shù)據(jù)。
[0006] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案詳述如下。
[0007] -種培養(yǎng)基中菌體濃度的測(cè)定方法，具體包括W下步驟： (1)取待測(cè)發(fā)酵液，將發(fā)酵液在45 °C~50°C保溫20~40min，優(yōu)選50°C保溫30min;所述發(fā) 酵液保溫結(jié)束后發(fā)酵液粘度下降，流動(dòng)性較好； 然后在保溫結(jié)束后的發(fā)酵液中加入纖維素酶和果膠酶，混合均勻W對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行酶 解，期間可每隔5min W顛倒混勻； 所述發(fā)酵液例如可為金霉素發(fā)酵液，具體例如正常發(fā)酵0~12化的金霉素發(fā)酵液或者培 養(yǎng)0~36h的金霉素種子液； 所述纖維素酶和果膠酶的總加入量為發(fā)酵液質(zhì)量的2%~4%;其中纖維素酶(酶活力> 25 萬(wàn)u/g)和果膠酶(酶活力> 10萬(wàn)U/g)的質(zhì)量比為1:1.5~2.0,酶解時(shí)溫度控制在35°C~50°C， 酶解時(shí)間含化，但不宜超過(guò)化，W避免酶解過(guò)長(zhǎng)時(shí)間從而影響發(fā)酵液品質(zhì)； (2)將步驟(1)中酶解完成后的發(fā)酵液，0°C、3000Xg離屯、lOmin，棄上清，保留沉淀物； (3 )向步驟(2 )的沉淀物中加入2 °C~4 °C的5% (V/V)的TCA (Ξ氯乙酸)溶液，充分?jǐn)埌?洗涂沉淀物，〇°C、3000 X g離屯、10分鐘，棄上清;重復(fù)此步驟一次； TCA溶液比例與樣品溶液（即步驟（1)中所取待測(cè)發(fā)酵液)的體積比例為1:1~1.5;優(yōu)選 比例為1:1.5，但由于此時(shí)TCA用量偏大，因而可根據(jù)實(shí)際情況適量調(diào)整； (4)向步驟(3)的沉淀中加5%(V/V) TCA，充分?jǐn)埌瑁缓笤?00°C的水浴中攬拌抽提10~ 15min，再然后置于冰水中冷卻，0°C、3000 X g離屯、10分鐘，取上清，棄沉淀物； 巧)將步驟(4)上清液用5% (V/V)TCA適當(dāng)稀釋?zhuān)琌D260測(cè)定吸光度，根據(jù)W下公式計(jì)算核 酸濃度：
式中：〇化6〇nm為T(mén)CA萃取液在260nm處所測(cè)得的吸光值；N為T(mén)CA萃取液稀釋的倍數(shù)； 0.022表示核酸濃度為1微克/毫升時(shí)的吸光值，此數(shù)值為一常數(shù)。
[000引本發(fā)明的主要技術(shù)思路為:纖維素酶和果膠酶的添加，破壞了復(fù)合培養(yǎng)基中部分 植物物料(黃豆粉、玉米粉、花生粉等）的細(xì)胞壁(生物酶對(duì)微生物細(xì)胞沒(méi)有影響），從而使植 物胞內(nèi)的核酸釋放到細(xì)胞外，而所釋放出來(lái)的植物內(nèi)容物通過(guò)后續(xù)的離屯、、去上清等步驟 隨著其他雜質(zhì)被去除，從而避免培養(yǎng)基原料中的核酸及其類(lèi)似物對(duì)測(cè)量結(jié)果所造成的干 擾。
[0009] 總體而言，本發(fā)明屬于一種測(cè)定發(fā)酵液中核酸濃度的改進(jìn)型的TCA法，其改進(jìn)點(diǎn)主 要體現(xiàn)在:該方法通過(guò)對(duì)發(fā)酵液的適當(dāng)酶解處理，較好避免了從培養(yǎng)基中提取菌體核酸時(shí) 固體成分中如黃豆粉、花生粉等物料中所含核酸或類(lèi)似物的干擾，可W較為準(zhǔn)確和充分的 提取發(fā)酵液中菌體的核酸，從而更為真實(shí)地反映發(fā)酵液中菌體量，從而為更好為發(fā)酵生產(chǎn) 提供參考和指導(dǎo)，表現(xiàn)出較好地實(shí)用價(jià)值和推廣應(yīng)用意義。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為本發(fā)明與現(xiàn)有測(cè)定方法對(duì)某批次金霉素發(fā)酵液中不同發(fā)酵時(shí)間的核酸濃度 的測(cè)定結(jié)果對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步解釋說(shuō)明。在介紹具體實(shí)施例前，對(duì)本發(fā)明中 部分試驗(yàn)設(shè)備及物料情況簡(jiǎn)要介紹如下。
[0012] 下述實(shí)施例中金霉素發(fā)酵液由駐馬店華中正大有限公司提供，采用金色鏈霉菌制 備而成，金霉素發(fā)酵液的制備流程大致如下所述： (1) 斜面菌絲制備，將沙±管保存的金色鏈霉菌抱子采用斜面培養(yǎng)方式，32Γ ± rc培 養(yǎng)3~5天制備母瓶斜面菌絲； (2) 種子液制備，將步驟(1)中母瓶?jī)?nèi)的斜面菌絲接種培養(yǎng)瓶，26 °C~32 °C、230轉(zhuǎn)/分搖 瓶培養(yǎng)18~24h制備種子液； (3) 金霉素發(fā)酵液制備，將步驟(2)中種子液接種于發(fā)酵罐內(nèi)，26°C~3(rC、pH5.4~6.5 條件下進(jìn)行培養(yǎng)，即為金霉素發(fā)酵液； 發(fā)酵罐內(nèi)金霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的具體成分為（1L):花生餅粉20g、黃豆餅粉18g、玉米淀 粉80g、酵母粉7.0g、玉米漿12g、豆油3g、淀粉酶O.lg、氯化鋼2.0g、硫酸錠6g、碳酸巧 7.0g、硫酸儀0.2g、憐酸二氨鐘0.3g，pH自然。
[OOU]實(shí)施例1 本實(shí)施例所提供的培養(yǎng)基中菌體濃度的測(cè)定方法，具體包括W下步驟： (1) 取發(fā)酵化(即發(fā)酵罐內(nèi)金霉素發(fā)酵培養(yǎng)基消毒后尚未接種前)的金霉素發(fā)酵液5mL， 將發(fā)酵液在50°C保溫30min;保溫結(jié)束后發(fā)酵液粘度下降，流動(dòng)性較好，3min內(nèi)無(wú)大量沉淀 現(xiàn)象。
[0014] 需要解釋的是，不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液的粘度差異較大，未接種時(shí)粘度在IsW內(nèi)， 而正常發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵液的粘度在^153左右，發(fā)酵液粘度采用毛細(xì)管粘度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。
[0015] 然后加入纖維素酶和果膠酶，混合均勻W對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行酶解，期間可每隔5minW 顛倒混勻； 纖維素酶和果膠酶的總加入量為發(fā)酵液質(zhì)量的2.6%，其中纖維素酶(酶活力=25萬(wàn)U/g) 和果膠酶(酶活力=10萬(wàn)U/g)用量分別為0.05、0.08g，酶解溫度控制在40°C，酶解時(shí)間化； (2) 將步驟(1)中酶解完成后發(fā)酵液，0°C、3000Xg離屯、lOmin，棄上清； (3 )向步驟(2)的沉淀物中加入4 °C的5% (V/V)的TCA溶液5mL，充分?jǐn)埌柘赐砍恋砦铮? °C、3000 X g離屯、10分鐘，棄上清;重復(fù)此步驟一次； (4) 向步驟（3)的沉淀中加5% TCA 5mL，充分?jǐn)埌?，然后?00°C的水浴中攬拌抽提 15min，再然后置于冰水中冷卻，0°C、3000 X g離屯、10分鐘，取上清，棄沉淀物； 巧)將步驟(4)上清液用5% TCA適當(dāng)稀釋?zhuān)琌D260測(cè)定吸光度，根據(jù)W下公式計(jì)算核酸濃 度：
[0016] 計(jì)算表明，此時(shí)金霉素發(fā)酵液中核酸濃度為0.17mg/mL。由于此時(shí)發(fā)酵液中尚未接 種金霉素發(fā)酵菌株，因而可W認(rèn)為培養(yǎng)基中的花生餅粉、黃豆餅粉等固體物料中含有微量 核酸物質(zhì)，從而容易對(duì)后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中核酸濃度測(cè)定造成一定影響。
[0017] 對(duì)比例 同樣操作方法下，在省略保溫和酶解操作前提下（即省略上述步驟(1))，對(duì)同一批次金 霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中核酸濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，核酸濃度為2.73 mg/mL。
[0018] 從本實(shí)施例和對(duì)比例的檢測(cè)結(jié)果可W看出，通過(guò)酶解處理后，可大幅度降低原有 發(fā)酵液中核酸的影響，可為生產(chǎn)過(guò)程中真實(shí)的菌體濃度檢測(cè)提供較好保障。
[0019] 實(shí)施例2 與實(shí)施例1相同，對(duì)同一批次的金霉素發(fā)酵液中核酸濃度進(jìn)行測(cè)定，僅調(diào)整步驟（1)中 發(fā)酵液保溫溫度為45°C，保溫時(shí)間30min。最后計(jì)算結(jié)果表明，菌絲體核酸濃度為0.29mg/ rnL ο
[0020] 實(shí)施例3 與實(shí)施例1相同，對(duì)同一批次的金霉素發(fā)酵液中核酸濃度進(jìn)行測(cè)定，僅調(diào)整酶解時(shí)生物 酶的比例，生物酶的具體用量為：纖維素酶0.07g、果膠酶0.13g，最后計(jì)算核酸濃度為 0.06mg/mL。從此結(jié)果可W看出，此時(shí)發(fā)酵液中原有的核酸量對(duì)于后續(xù)測(cè)定幾乎沒(méi)有影響。
[0021]依據(jù)此操作方法，對(duì)金霉素發(fā)酵液不同發(fā)酵時(shí)間后發(fā)酵液中菌體濃度進(jìn)行測(cè)定， 同時(shí)按照現(xiàn)有（即對(duì)比例中操作方法)操作方法進(jìn)行測(cè)定，相關(guān)測(cè)定結(jié)果如圖1所示。從圖1 可W看出，本發(fā)明所提供的改進(jìn)后的TCA測(cè)定法，可較好解決發(fā)酵培養(yǎng)前期菌株濃度測(cè)量不 準(zhǔn)確的弊端，更能反映菌體真實(shí)的生長(zhǎng)規(guī)律，因而可W更好指導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種培養(yǎng)基中菌體濃度的測(cè)定方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟： (1) 取待測(cè)發(fā)酵液，將發(fā)酵液在45 °O50°C下保溫20~40min;然后加入纖維素酶和果膠 酶，以對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行酶解； 所述纖維素酶和果膠酶的總加入量為發(fā)酵液質(zhì)量的2%~4%; 以質(zhì)量比計(jì)，纖維素酶:果膠酶=1:1.5~2.0,其中纖維素酶酶活2 25萬(wàn)U/g，果膠酶酶活 之10萬(wàn)U/g; 酶解溫度控制在35°O50°C，酶解時(shí)間2 lh，但不超過(guò)5h; (2) 將步驟(1)中酶解完成后的發(fā)酵液離心，棄上清，保留沉淀物； (3) 向步驟(2)的沉淀物中加入2°C~4°C的5%體積分?jǐn)?shù)的TCA溶液，洗滌沉淀物，離心， 棄上清;重復(fù)此步驟一次； TCA溶液與步驟(1)中所取待測(cè)發(fā)酵液的體積比例為1:1~1.5; (4) 向步驟(3 )的沉淀中加5%體積分?jǐn)?shù)的TCA溶液，攪拌，然后在100 °C的水浴中抽提10 ~15min，再置于冰水中冷卻，離心，取上清液，棄沉淀物； (5) 將步驟(4)所得上清液用5% TCA溶液稀釋?zhuān)琌D26Q測(cè)定吸光度，根據(jù)以下公式計(jì)算核 酸濃度：式中:〇D26QnmSTCA萃取液在260nm處所測(cè)得的吸光值;N為T(mén)CA萃取液稀釋的倍數(shù)。2. 如權(quán)利要求1中所述培養(yǎng)基中菌體濃度的測(cè)定方法，其特征在于，所述發(fā)酵液為金霉 素發(fā)酵液。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合培養(yǎng)基中測(cè)定菌體濃度的改進(jìn)方法。該方法包括發(fā)酵液保溫、酶解、TCA萃取、吸光度測(cè)定、計(jì)算等步驟。本發(fā)明改進(jìn)點(diǎn)主要體現(xiàn)在：該方法通過(guò)對(duì)發(fā)酵液的適當(dāng)酶解處理，較好避免了從培養(yǎng)基中提取菌體核酸時(shí)固體成分中如黃豆粉、花生粉等物料中所含核酸或類(lèi)似物的干擾，可以較為準(zhǔn)確和充分的提取發(fā)酵液中菌體的核酸，從而更為真實(shí)地反映發(fā)酵液中菌體量，從而為更好為發(fā)酵生產(chǎn)提供參考和指導(dǎo)，表現(xiàn)出較好地實(shí)用價(jià)值和推廣應(yīng)用意義。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12Q1/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105671184
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610185344
【發(fā)明人】李大攀, 李書(shū)至, 常坤, 郭雙, 李俊, 陳浩然, 李冰
【申請(qǐng)人】駐馬店華中正大有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月29日