專利名稱：一種提取高純度微囊藻毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微囊藻毒素的提取方法，具體為一種從產(chǎn)毒銅綠微囊藻中提取高純度微囊藻毒素的方法，屬于環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，隨著全球水體富營養(yǎng)化程度的加劇，世界各地有害藻類水華(Harmful Algal Blooms, HABs)事件發(fā)生的頻率和幅度日趨增加。藻類水華已成為嚴(yán)重影響水環(huán)境質(zhì)量和水體生態(tài)安全的全球性問題，不僅極大的危害人類健康和其他生物安全，也給全球造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有些水華藻類在代謝過程中或藻體破裂后向水體中排出藻毒素，給人類健康、水生動物、家禽等帶來極大危害。如銅綠微囊藻所產(chǎn)生的微囊藻毒素 (Microsystins，簡稱MC)是一類具有生物活性的環(huán)狀七肽化合物，近幾十年來，國內(nèi)外動物試驗、人群流行病學(xué)調(diào)查表明微囊藻毒素具有機(jī)體肝毒性、促癌、胚胎毒性、遺傳毒性、免疫損害等作用。
微囊藻毒素是一類具有生物活性的七肽單環(huán)肝毒素，相對分子量在900-1100之間。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的微囊藻毒素的異構(gòu)體達(dá)60多種，其中存在較多且毒性較大的是微囊藻毒素MC-LR，MC-YR，MC-RR。能產(chǎn)生微囊藻毒素的藻類主要有微囊藻(Microcystis)、 魚腥藻(Anabaena)、顫藻(Oscillatoria)和念珠藻(Nostoc)等。由于MC-LR存在較為普遍，毒性較強(qiáng)，且已分離培養(yǎng)出標(biāo)準(zhǔn)純品，故現(xiàn)在藻毒素研究常以其為代表性指標(biāo)，WHO以 MC-LR含量為基準(zhǔn)推薦飲水藻毒素標(biāo)準(zhǔn)為1. O μ g/L。
隨著對微囊藻毒素降解研究的廣泛開展，科研人員對微囊藻毒素樣品的需求量也越來越大，對水體中微囊藻毒素的檢測及降解研究已成為水環(huán)境領(lǐng)域的一項重要研究內(nèi)容。
目前只有少數(shù)幾家國外公司才能購買到高純度(純度95%以上)的MC-LR等標(biāo)準(zhǔn)品，價格昂貴(如美國sigma公司500mg標(biāo)準(zhǔn)品價格約3000元)，購買手續(xù)繁雜，等候時間過長等因素給研究帶來極大的不便。如果實驗所需微囊藻毒素樣品全部靠進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)品來完成，也將大大增加實驗成本。因此，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高純度微囊藻毒素提取方法對于在水環(huán)境及衛(wèi)生領(lǐng)域展開更多關(guān)于微囊藻毒素的研究具有重要意義。
中國專利200910033693公開了一種分離、純化微囊藻毒素的方法，產(chǎn)微囊藻毒素的藍(lán)藻用1 20 80的溶劑提取，提取液通過SPE柱凈化，然后利用恒流泵、C18層析柱、自動部分收集器構(gòu)成的柱層析系統(tǒng)對微囊藻毒素進(jìn)行分離純化，流動相由35 50%水、50 65%甲醇以及0. 05 0. 酸組成。由于甲醇濃度偏低，還有酸的存在會使藻毒素部分降解，塑料或是玻璃容器會對MC有吸附；超聲破碎藻細(xì)胞使其中的藻毒素和其他物質(zhì)同時釋放，不利于高純度藻毒素的獲得。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取高純度微囊藻毒素的方法，該方法高效、經(jīng)濟(jì)、純度高，解決了目前微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴、獲得手續(xù)繁雜等問題。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案為
一種提取高純度微囊藻毒素的方法，包括步驟如下
(1)水樣預(yù)處理將銅綠微囊藻水樣經(jīng)液氮反復(fù)凍融2-4次，以破碎藻細(xì)胞，釋放胞內(nèi)微囊藻毒素MC-LR，然后將凍融后的水樣離心取上清液備用；
(2) SPE固相萃取柱的預(yù)處理、MC-LR的富集與純化用甲醇清洗固相萃取柱2_4 次，再用超純水清洗2-4次；向清洗后的固相萃取柱內(nèi)通入步驟(1)的上清液過柱，過柱完后用甲醇水溶液作淋洗液清洗富集了 MC-LR的固相萃取柱，除去雜質(zhì)；
(3)MC-LR的溶出與濃縮用100%甲醇作為洗脫液清洗富集了 MC-LR的固相萃取柱以洗脫MC-LR，使MC-LR溶出，將溶出的MC-LR-甲醇混合溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，40-60°C， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10-20min。
上述步驟(1)中所述的銅綠微囊藻水樣藻細(xì)胞濃度約IO7個/ml，所述的離心在 8000-10000rpm速度下離心8-12分鐘。
步驟O)中所述的固相萃取柱為C18固相萃取柱；所述的過柱速度均為5ml/min ； 所述的甲醇水溶液濃度為10% -20% (ν/ν)，洗滌1-2次。
本發(fā)明的有益效果是
(1)本專利用的是100%的色譜純甲醇作流動相，提取效果更好，樣品保留更穩(wěn)定，而且經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，藻毒素樣品的純度更高，可提取得到毫克級MC-LR，雜質(zhì)少，純度高；
(2)微囊藻樣品中的MC包括胞外MC和胞內(nèi)MC，因此，總MC為胞外MC與胞內(nèi)MC 之和，本研究采用液氮凍融的方法使藻細(xì)胞破壁，可同時獲取胞內(nèi)與胞外MC，省去了傳統(tǒng)過濾方法中截留并且萃取濾膜殘渣的步驟，操作方法簡便、環(huán)保，而且安全、經(jīng)濟(jì)；
(3)易于工業(yè)化生產(chǎn)；
(4)樣品來源于實驗室培養(yǎng)的產(chǎn)毒銅綠微囊藻，原材料價廉、易得；在研究微囊藻毒素的同時還可以研究銅綠微囊藻的產(chǎn)毒變化規(guī)律等。


圖1為實施例1樣品的液相色譜圖2為實施例1樣品與F5反應(yīng)后的色譜圖。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
銅綠微囊藻水樣可以采集也可實驗室擴(kuò)大培養(yǎng)。
實施例1
一種提取高純度微囊藻毒素的方法，包括步驟如下
(1)取銅綠微囊藻水樣(藻種購自中科院水生所，編號905，活化后藻細(xì)胞濃度約為IO7個/ml) 100ml，經(jīng)液氮凍融兩次后離心(effendorf，8000r/min，IOmin)，將上清液置入空白玻璃瓶。
(2)先用IOml甲醇(色譜純)清洗C18固相萃取柱2次，過柱速度5ml/min，然后用20ml超純水清洗C18富集柱2次，過柱速度仍為5ml/min ；
將上清液經(jīng)固相萃取裝置通入清洗過的C18固相萃取柱(過柱速度為5ml/min)， 然后用20ml 10%的甲醇作為淋洗液連續(xù)清洗2次C18富集柱(過柱速度仍為5ml/min)。
(3)用IOml甲醇作為洗脫液清洗C18富集柱2次，將MC-LR溶出于空白玻璃瓶中。 將溶出的20ml MC-LR-甲醇混合溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min，濃縮至1ml。
實施例2 —種提取高純度微囊藻毒素的方法，包括步驟如下
(1)取銅綠微囊藻水樣(藻種購自中科院水生所，編號905，活化后藻細(xì)胞濃度約為IO7個/ml) 100ml，經(jīng)液氮凍融兩次后離心(effendorf，8000r/min，IOmin)，將上清液置入空白玻璃瓶。
(2)先用IOml甲醇(色譜純)清洗C18固相萃取柱2次，過柱速度5ml/min，然后用20ml超純水清洗C18富集柱2次，過柱速度仍為5ml/min ；
將上清液經(jīng)固相萃取裝置通入清洗過的C18固相萃取柱(過柱速度為5ml/min)， 然后用20ml 10%的甲醇作為淋洗液連續(xù)清洗2次C18富集柱(過柱速度仍為5ml/min)。
(3)用IOml甲醇作為洗脫液清洗C18富集柱2次，將MC-LR溶出于空白玻璃瓶中。 將溶出的20ml MC-LR-甲醇混合溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min，濃縮至1ml。
試驗1
將實施例1濃縮定容后的Iml樣品用0. 22 μ m的玻璃纖維濾膜過濾，濾液裝入液相瓶，進(jìn)高效液相儀分析檢測。根據(jù)保留時間定性，根據(jù)峰面積以外標(biāo)法定量。
實驗所用HPLC為AgilentllOO高效液相色譜儀，色譜柱為SB-C18反向分析柱；流動相為甲醇水(含0. 三氟乙酸)=70 30(V/V)；流速為0.7ml/min;紫外檢測波長為238nm ；樣品注入量5μ 1 ；柱溫40°C ；經(jīng)檢測，該樣品MC-LR的濃度為98. 5mg/L。檢測該樣品的液相色譜圖如圖1所示?？梢钥闯?，色譜圖幾乎沒有雜峰，主峰很明顯，為MC-LR， 說明樣品純度較高，雜質(zhì)少。
試驗2
取產(chǎn)毒銅綠微囊藻液100ml (藻細(xì)胞濃度約為IO7個/ml)，經(jīng)液氮凍融兩次后離心 (effendorf, 8000r/min, lOmin)，將上清液置入空白玻璃瓶。往瓶中加入20ml微囊藻毒素降解菌F5的菌液(細(xì)菌濃度約IO9個/ml)，放入振蕩培養(yǎng)箱(25°C，220r/min)，反應(yīng)5d后檢測結(jié)果。
對玻璃瓶中的MC-LR濃度的檢測按照試驗1的步驟進(jìn)行操作。檢測結(jié)果表明，與微囊藻毒素降解菌F5反應(yīng)后，瓶中MC-LR的濃度為^ang/L，經(jīng)計算F5對MC-LR的降解率為 68. 1%，這一結(jié)果與用MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品測試的結(jié)果相差無幾。從而說明，在研究微囊藻毒素降解實驗時，完全可以自行培養(yǎng)微囊藻進(jìn)而提取微囊藻毒素，且提取的藻毒素濃度為毫克級， 純度較高，一般高?；蚩蒲性核鶎嶒炇壹纯蓪崿F(xiàn)，將大大節(jié)約實驗成本，提高實驗效率。試驗2中與F5反應(yīng)后的樣品色譜圖如圖2所示。
如上所述，對本發(fā)明的實施例進(jìn)行了詳細(xì)地說明，但是只要實質(zhì)上沒有脫離本發(fā)明的發(fā)明點及效果可以有很多的變形，這對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，這樣的變形例也全部包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種提取高純度微囊藻毒素的方法，其特征是，包括步驟如下(1)水樣預(yù)處理將銅綠微囊藻水樣經(jīng)液氮反復(fù)凍融2-4次，以破碎藻細(xì)胞，釋放胞內(nèi)微囊藻毒素MC-LR，然后將凍融后的水樣離心取上清液備用；(2)SPE固相萃取柱的預(yù)處理、MC-LR的富集與純化用甲醇清洗固相萃取柱2-4次，再用超純水清洗2-4次；向清洗后的固相萃取柱內(nèi)通入步驟(1)的上清液過柱，過柱完后用甲醇水溶液作淋洗液清洗富集了 MC-LR的固相萃取柱，除去雜質(zhì)；(3)MC-LR的溶出與濃縮用100%甲醇作為洗脫液清洗富集了MC-LR的固相萃取柱以洗脫MC-LR，使MC-LR溶出，將溶出的MC-LR-甲醇混合溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，40-60°C，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 10-20min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取高純度微囊藻毒素的方法，其特征是，步驟(1)中所述的離心是在8000-10000rpm速度下離心8-12分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取高純度微囊藻毒素的方法，其特征是，步驟( 中所述的固相萃取柱為C18固相萃取柱；所述的過柱速度均為5ml/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取高純度微囊藻毒素的方法，其特征是，步驟( 中所述的甲醇水溶液濃度為10% -20%，洗滌1-2次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提取高純度微囊藻毒素的方法，先將銅綠微囊藻水樣經(jīng)液氮反復(fù)凍融，將凍融后的水樣離心取上清液備用，對C18固相萃取柱預(yù)處理，將水樣中MC-LR用C18固相萃取柱富集純化；將MC-LR溶出并濃縮得到產(chǎn)品。本發(fā)明可提取得到毫克級MC-LR，雜質(zhì)少，純度高；采用液氮凍融的方法使藻細(xì)胞破壁，操作方法簡便，且可以使細(xì)胞內(nèi)胞外MC-LR完全釋放出來，而且環(huán)保、安全、經(jīng)濟(jì)。
文檔編號C07K1/14GK102516367SQ20111045513
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者母銳敏, 石敬華, 袁學(xué)良, 韓雪梅 申請人:山東建筑大學(xué)