專利名稱：水稻胚乳甜質(zhì)控制基因su1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及水稻甜質(zhì)胚乳及淀粉構(gòu)成控制基因SU1，該基因編碼的蛋白質(zhì)及其功能類似物，編碼其的核苷酸序列，含有該核苷酸的載體和含有該載體的宿主細(xì)胞；另外，本發(fā)明還涉及控制植物器官甜度及淀粉構(gòu)成的方法和改良植物器官甜度及淀粉構(gòu)成育種的方法。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來一直認(rèn)為異淀粉酶只在淀粉徹底水解如種子萌發(fā)時(shí)起作用，然而最近的研究表明，異淀粉酶還參與胚乳支鏈淀粉的合成，并且起重要作用[1]。異淀粉酶的缺失導(dǎo)致高分支α-葡聚糖的合成，形成植物糖元和sugary型支鏈淀粉，它們分別存在于水稻胚乳的內(nèi)部和外部[2]。sugary型支鏈淀粉所含的DP(degree ofpolymerization)＜12(結(jié)構(gòu)單元小，糖鏈短)的短鏈較多，而DP＞13～24的糖鏈比正常支鏈淀粉淀粉的糖鏈少，這種支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的改變，影響胚乳淀粉的形態(tài)和理化特性。
甜質(zhì)胚乳是農(nóng)作物的特異性狀。在玉米中，人們已發(fā)現(xiàn)了許多玉米籽粒儲(chǔ)藏多糖的突變體，例如sugary和shrunken等[3]，由于這些特異的胚乳性狀的發(fā)現(xiàn)使玉米還成為食品化學(xué)中重要的工業(yè)原料。甜質(zhì)水稻胚乳因可溶性多糖含量增加而淀粉含量下降，其胚乳含糖量提高，米飯?zhí)鸲贸?，而被列為新型的功能性食品開發(fā)的重要原料。
首先，從表型上描述水稻甜質(zhì)胚乳，突變體種子收獲干燥后，糙米透明皺縮或呈琥珀色[4，5]；經(jīng)KI-I(碘-碘化鉀溶液)染色后，胚乳層外圍染色較淺，而中間部分則不染色[3]。通過化學(xué)分析可以證實(shí)水稻甜質(zhì)胚乳可溶性糖含量高，從口感上也可以確定水稻甜質(zhì)胚乳帶有甜味[4，5]，使用糊化溫度測(cè)定可以發(fā)現(xiàn)水稻甜質(zhì)胚乳的糊化溫度下降[4]。生化分析表明，水稻甜質(zhì)胚乳中異淀粉酶和R酶(極限糊精酶)活性顯著降低，尤其是異淀粉酶在胚乳中幾乎完全缺乏活性，這種變化導(dǎo)致淀粉不能正常合成和積累[7～9]。異淀粉酶在淀粉粒的正常形成過程中，尤其是對(duì)中、長(zhǎng)支鏈淀粉的形成，以及種子發(fā)芽過程中支鏈淀粉的水解時(shí)起主要作用，因此該性狀也與胚乳甜度及淀粉構(gòu)成有關(guān)。
經(jīng)典遺傳分析表明，水稻甜質(zhì)胚乳基因位于第8染色體。1999年，F(xiàn)ujita首先獲得水稻異淀粉酶的cDNA克隆，該克隆與編碼玉米異淀粉酶的sugary-1有著很高同源性，有人據(jù)此推測(cè)水稻SU1基因可能編碼水稻異淀粉酶的基因[10，11]，但未見有進(jìn)一步的克隆證實(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述研究背景，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種控制水稻甜質(zhì)胚乳的基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由本發(fā)明的控制水稻稻米甜質(zhì)胚乳的基因所編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種含有本發(fā)明的控制水稻稻米甜質(zhì)胚乳的基因的植物表達(dá)載體。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種培育植物的方法，該方法可使植物淀粉的主要儲(chǔ)藏器官的甜度和淀粉構(gòu)成發(fā)生變化。
本發(fā)明提供了一種控制水稻稻米甜質(zhì)胚乳的基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制水稻稻米甜質(zhì)胚乳的功能的核苷酸序列。
嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7％SDS)中，65℃預(yù)雜交30min；棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7％SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65℃雜交12小時(shí)；棄雜交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。
本發(fā)明的控制水稻稻米甜質(zhì)胚乳的基因優(yōu)選具有如圖6和SEQ IDNO1所示的DNA序列。
本發(fā)明還提供了一種由上述核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)優(yōu)選具有如圖7和SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明中的SEQ ID NO2和圖7所示的蛋白質(zhì)屬于淀粉去分支酶家族，與玉米SU1異淀粉酶的同源性為87％，直接參與支鏈淀粉生物合成。
本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明的控制水稻稻米甜質(zhì)胚乳的基因的植物表達(dá)載體。這種表達(dá)載體可以是如圖4所示的pCAMSU1，該載體可以表達(dá)由上述核酸序列編碼的多肽。
本發(fā)明還提供了一種培育植物的方法，該方法可使植物淀粉的主要儲(chǔ)藏器官的甜度和淀粉構(gòu)成發(fā)生變化，包括用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株的步驟。


下面結(jié)合附圖對(duì)理解本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對(duì)本發(fā)明作限定。
附圖1.水稻F2代植株所結(jié)種子的表型鑒定附圖2.SU1在水稻第8染色體上的初步定位圖附圖3.SU1基因的精細(xì)定位及物理定位附圖4.轉(zhuǎn)基因后su1突變體恢復(fù)正常表型附圖5.載體pCAMSU1質(zhì)粒圖譜附圖6.SU1的核苷酸序列附圖7.SU1所編碼的氨基酸序列具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)理解本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對(duì)本發(fā)明作限定。
實(shí)施例1水稻甜質(zhì)胚乳控制基因SU1的克隆1.水稻材料水稻(Oryza sativa ssp.)甜質(zhì)胚乳突變體su1(中國(guó)水稻研究所使用EMS(甲基磺酸乙酯)誘變獲得)[4，5]和常規(guī)水稻品種93-11(購(gòu)自中國(guó)水稻研究所)。
2.分析和定位群體純合的秈稻品種93-11和粳稻突變體su1進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代自交，共得到6,870個(gè)F2個(gè)體，并從中選出1,450個(gè)個(gè)體作為定位群體。在苗期每株取2克左右的嫩葉，用來提取DNA。
3、通過SSR(Simple Sequence Repeat)，STS(Sequence-tagged Sites)，和CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)標(biāo)記定位SU1基因采用改進(jìn)的CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide)方法[12]從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。取大約100mg水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于100μl超純水中。每一個(gè)SSR、STS或CAPS反應(yīng)用1μl DNA樣品。
在SU1基因的初步定位階段，對(duì)由10個(gè)F2個(gè)體組成的混合池進(jìn)行SSR分析，發(fā)現(xiàn)SU1基因與第8號(hào)染色體RM149和RM447標(biāo)記連鎖，并定位于二標(biāo)記間。為此將SU1初步定位在SSR標(biāo)記RM149和RM447之間。
4、SU1基因的精細(xì)定位為了將SU1定位在一個(gè)PAC(P1artificial chromosome)克隆上，我們用已公布的水稻品種Nipponbare的PAC文庫(kù)(http//rgp.dna.affrc.go.jp)序列構(gòu)建了SU1位點(diǎn)附近的重疊群(contig)，設(shè)計(jì)PCR引物(見表1中的a、b、e、f)，分別以兩個(gè)親本(su1突變體和93-11)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94℃預(yù)變性5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10mins)。以此發(fā)展了標(biāo)記并最終將其定位在一個(gè)PAC克隆AP005509上。根據(jù)公布的PAC克隆AP005509的序列(http//rgp.dna.affrc.go.jp)，發(fā)展了新的標(biāo)記(見表1的c、d)，最后通過連鎖分析將SU1定位在分子標(biāo)記c與d之間45kb的范圍之內(nèi)。對(duì)該45kb基因組序列進(jìn)行測(cè)序。
表1克隆SU1基因所用引物序列

5、SU1部分cDNA基因的獲得與功能的預(yù)測(cè)首先對(duì)45kb的全長(zhǎng)基因組序列用HMM軟件(http//www.softberry.com/berry.phtml)預(yù)測(cè)可能的編碼區(qū)(ORF)，發(fā)現(xiàn)其間有9個(gè)開放閱讀框，其中一閱讀框編碼異淀粉；擴(kuò)大序列范圍預(yù)測(cè)，并將基因產(chǎn)物用blastX軟件預(yù)測(cè)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。用DNAStar軟件(Lasergene)MegAlign程序中的ClustalW方法進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比較和進(jìn)化樹分析。同時(shí)又設(shè)計(jì)一對(duì)引物SUF(5’ttagagaggctcacaaacgggg3’)和SUR(5’tcttcctcaatcttttgaccgac 3’)以秈稻93-11總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(70℃10mins，42℃60mins，99℃5mins，4℃5mins，美國(guó)Promega公司生產(chǎn)的Reverse Transcript ion System)并用ABI3730DNA analyzers型測(cè)序儀測(cè)序，得到了SU1基因的cDNA序列。在上述研究的基礎(chǔ)上推測(cè)該基因可能編碼一種異淀粉酶，與玉米的SU1異淀粉酶極其相似。
6、突變體SU1基因序列的比較通過對(duì)93-11、突變體su1及其原始親本的SU1基因所在位點(diǎn)的DNA序列的比較，并與表型結(jié)果相對(duì)應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了引起表型差異的基因改變位置，表明堿基替換是造成水稻甜質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。
實(shí)施例2水稻甜質(zhì)胚乳控制基因SU1的功能互補(bǔ)及轉(zhuǎn)基因研究根據(jù)秈稻93-11SU1基因的序列設(shè)計(jì)引物，用引物SUP1F，SUP1R，SUP2F，SUP2R，SUP3F和SUP3R，(序列見附件1)分3段高保真擴(kuò)增93-11(序列見表1，94℃預(yù)變性5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min并用ABI3730DNA analyzers型測(cè)序儀測(cè)序(ABI公司，美國(guó))，挑選序列完全正確的克隆利用共有的Sma I和Kpn I位點(diǎn)將它們連接成一個(gè)10kb片段，包含起始密碼子ATG上游的3,372個(gè)堿基和終止密碼子TGA后的425個(gè)堿基的全長(zhǎng)序列，克隆到雙元載體pCAMBIA1300(購(gòu)自CAMIA公司，澳大利亞)中，獲得了用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pCAMSU1(圖4)。質(zhì)粒通過電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(AgroBacteriumtumefaciens)株系EHA105(購(gòu)自CAMIA公司，澳大利亞)中轉(zhuǎn)化水稻。將su1突變體的幼胚脫殼滅菌，接種到誘導(dǎo)愈傷組織的MS培養(yǎng)基[13]中。在28℃的培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)3周，從盾片處生長(zhǎng)出愈傷組織，挑選生長(zhǎng)旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷組織，用作轉(zhuǎn)化的受體。用含有雙元質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌EHA105菌株侵染水稻愈傷組織，在黑暗處25℃培養(yǎng)3天后，在含有50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株。將潮霉素抗性植株在陰涼處煉苗，幾天后移栽到水田，結(jié)實(shí)后收種進(jìn)行表型鑒定。共收獲12個(gè)株系的T0代種子，其中籽粒胚乳表現(xiàn)為陽性的有8個(gè)株系，證明SU1基因已經(jīng)整合進(jìn)受體基因組內(nèi)并能夠正確表達(dá)(見附圖4)。
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130 135 140Pro Leu Asp Pro Leu Phe Asn Arg Thr Gly Asn Val Trp His Val Phe145 150 155 160Ile Glu Gly Glu Leu His Asn Met Leu Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly165 170 175Met Phe Ala Pro His Cys Gly Gln Tyr Phe Asp Val Ser Asn Val Val180 185 190Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Val Ile Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val195 200 205Pro Gly Pro Gly Gly Asp Cys Trp Pro Gln Met Ala Gly Met Ile Pro210 215 220Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp Trp Gln Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr225 230 235 240Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile Tyr Glu Met His Leu Arg Gly Phe Thr245 250 255Lys His Ser Ser Ser Asn Val Glu His Pro Gly Thr Tyr Ile Gly Ala260 265 270Ile Ser Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Glu Leu Gly Val Asn Cys Val Glu275 280 285Leu Met Pro Cys His Glu Phe Asn Glu Leu Glu Tyr Phe Ser Cys Ser290 295 300Ser Lys Met Asn Phe Trp Gly Tyr Ser Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro305 310 315 320Met Ile Arg Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Arg Asn Cys Gly Arg Asp Ala325 330 335Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe Val Arg Glu Ala His Lys Arg Gly Ile340 345 350Glu Val Ile Met Asp Val Val Phe Asn His Thr Ala Glu Gly Asn Glu355 360 365Lys Gly Pro Ile Leu Ser Phe Arg Gly Ile Asp Asn Ser Thr Tyr Tyr370 375 380Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu Phe Tyr Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn385 390 395 400Thr Phe Asn Cys Asn His Pro Val Val Arg Glu Phe Ile Val Asp Cys405 410 415Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp420 425 430Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg Gly Cys Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn435 440 445Val Tyr Gly Ser Pro Val Glu Gly Asp Met Thr Thr Thr Gly Thr Pro450 455 460Leu Ala Thr Pro Pro Leu Ile Asp Met Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu465 470 475 480Gly Asp Val Lys Leu Ile Ala Glu Ala Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr485 490 495
Gln Val Gly Gln Phe Pro His Trp Lys Ile Trp Ser Glu Trp Asn Gly500 505 510Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg Gln Phe Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe515 520 525Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys Leu Cys Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln530 535 540Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp His Ser Ile Asn Phe Val Cys Ala His545 550 555 560Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp Leu Val Thr Tyr Asn Lys Lys Tyr Asn565 570 575Ser Ser Asn Gly Glu Asp Asn Arg Asp Gly Glu Asn His Asn Leu Ser580 585 590Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly Glu Phe Ala Gly Leu Ser Val Lys Arg595 600 605Leu Arg Lys Arg Gln Met Arg Asn Phe Phe Val Ser Leu Met Val Ser610 615 620Gln Gly Val Pro Met Phe Tyr Met Gly Asp Glu Tyr Gly His Thr Lys625 630 635 640Gly Gly Asn Asn Asn Thr Tyr Cys His Asp His Tyr Val Asn Tyr Phe645 650 655Arg Trp Asp Lys Lys Glu Glu Ser Ser Asp Leu Gln Arg Phe Cys Ser660 665 670Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys Gln Cys Glu Ser Leu Gly Leu Ala Asp675 680 685Phe Pro Thr Ala Gln Arg Leu His Trp His Gly His Gln Pro Gly Lys690 695 700Pro Asp Trp Ser Glu Thr Ser Arg Phe Val Ala Phe Ser Met Lys Asp705 710 715 720Glu Thr Lys Gly Glu Ile Tyr Val Ala Phe Asn Ala Ser His Leu Pro725 730 735Ala Val Val Gly Leu Pro Glu Arg Pro Gly Tyr Arg Trp Glu Pro Leu740 745 750Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala Pro Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Asp Leu755 760 765Pro Asp Arg Ala Thr Pro Ser Thr Cys Ser Leu Ile Ser Ser Thr Pro770 775 780Ile Ser Thr Pro Cys Ser Ala Thr Pro Pro Ser Ser Leu Asn Cys Ser785 790 795 800Leu Met Ile Glu Arg Thr Lys Tyr Ser Ile Val805 810
權(quán)利要求
1.一種控制水稻稻米甜質(zhì)胚乳的基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制植物器官甜度和水稻稻米甜質(zhì)胚乳的功能的核苷酸序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的基因，它具有SEQ ID NO1所示的DNA序列。
3.一種由權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
5.一種含有權(quán)利要求1或2所述的控制水稻稻米甜質(zhì)胚乳的基因的植物表達(dá)載體。
6.按照權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，該表達(dá)載體是pCAMSU1。
7.一種培育植物方法，該方法可使植物淀粉的主要儲(chǔ)藏器官的淀粉構(gòu)成發(fā)生變化，包括用權(quán)利要求4或5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株的步驟。
全文摘要
本發(fā)明是從水稻秈稻品種93－11中克隆并鑒定了控制水稻甜質(zhì)胚乳的基因SU1，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時(shí)編碼具有控制植物器官甜度和水稻稻米甜質(zhì)胚乳功能的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種控制水稻稻米甜質(zhì)胚乳的蛋白質(zhì)、含有本發(fā)明的基因的植物表達(dá)載體、和一種培育植物的方法，該方法可使植物淀粉的主要儲(chǔ)藏器官的淀粉構(gòu)成發(fā)生變化，包括用含有本發(fā)明的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株的步驟。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1814758SQ200510006770
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月4日
發(fā)明者李家洋, 錢前, 曾大力, 周奕華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所