一種沉香屬植物結(jié)香的誘導劑及沉香生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種安全和高效的沉香生產(chǎn)方法，該方法先在沉香屬植物的樹干上鉆孔，然后利用植物蒸騰拉力同時將真菌激發(fā)子——葡聚六糖和植物營養(yǎng)液輸入沉香樹體，處理3個月后割取樹干中棕褐色油狀物以及黃棕色變色木質(zhì)部，曬干后即為沉香。真菌激發(fā)子和植物營養(yǎng)液構(gòu)成的結(jié)香液為天然成分，不添加任何激素、化學藥物、人工香料等成分，安全可靠；結(jié)香3個月可以達到國家藥典2015年版的沉香中藥材標準，快速高效。該方法實現(xiàn)了安全和高效生產(chǎn)沉香，將產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)沉香變?yōu)楝F(xiàn)實。
【專利說明】
一種沉香屬植物結(jié)香的誘導劑及沉香生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種沉香屬植物結(jié)香的誘導劑及沉香生產(chǎn)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 沉香為瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilaria植物含有黑色樹脂的木質(zhì)部。沉香 是我國、日本、印度以及其他東南亞國家的傳統(tǒng)名貴藥材和名貴的天然香料，其味辛、苦，性 微溫，能行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘。目前沉香仍然是世界上最昂貴的香料之一，僅新加 坡每年出口沉香的價值就超過12億美元。國際市場需求極大，長期以來沉香屬所有物種均 遭到掠奪式砍伐，其原始林已經(jīng)基本破壞殆盡，被列入了《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公 約》(CITES)附錄Π 。白木香A. sinensis為我國特有的熱帶及亞熱帶常綠喬木，是我國生產(chǎn) 名貴芳香類藥材沉香的唯一植物來源，現(xiàn)已被列為國家二級瀕危保護植物。
[0003] 國內(nèi)外的研究認為，沉香的形成可能是樹干受到傷害后被真菌侵染，真菌的代謝 產(chǎn)物使木材薄壁細胞的淀粉粒發(fā)生生物化學變化，形成脂類，經(jīng)多年沉積而形成沉香。國外 學者從沉香屬植物樹體的結(jié)香部位分離到的真菌種類很多，包括磚紅鐮孢Fusarium laseritum、青霉Penicillium spp·、曲霉Aspergillus spp·、毛霉Mucor spp·、色二抱菌 Diplodia spp·、可球二抱菌Botryodiplodia theobromae、木霉Trichoderma spp·、裂裙菌 Schizophyllum spp·、鐮刀菌Fusarium spp.等。在國內(nèi)，也有學者分離出黃綠墨耳菌 Menanotus flavolives，并認為它與沉香形成有關(guān)，做了大量的實驗支持其觀點。但是這些 傳統(tǒng)的接菌結(jié)香有諸多缺陷，如1)菌種生長繁殖受環(huán)境影響大且極易死亡，造成結(jié)香效率 和產(chǎn)量低;2)接菌結(jié)香操作復(fù)雜，費時費力；3)菌種生長緩慢造成沉香形成時間長，時間成 本高。近年來，利用特定的真菌菌株作為激發(fā)子以提高植物細胞次生代謝產(chǎn)物的積累，在植 物細胞懸浮培養(yǎng)中已取得了成功的應(yīng)用并具有了商品化潛力。尤其對源于大豆大雄疫霉 (Phytophthora megasperma f.sp.glycinea Kuan&Erwin)的寡聚半乳糖酸酸激發(fā)子的研 究較為深入。該β連接的葡聚七糖激發(fā)子是能在DNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)特殊代謝、基因表達的 分子，IOng(UT 8g)應(yīng)用于Ig植物組織即能產(chǎn)生足夠的植保素，相當于Ig寡糖激活劑可使 1000 t作物的組織產(chǎn)生足夠量的植保素，迄今為止它是已發(fā)現(xiàn)植保素激發(fā)子中效率最高的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于傳統(tǒng)接菌結(jié)香效果差、效率低、成本高等諸多缺點，本發(fā)明的目的在于提供 一種安全、快速、高效和穩(wěn)定的沉香生產(chǎn)方法，使得該方法生產(chǎn)的沉香能夠達到國家藥典 2015年版的標準，實現(xiàn)了安全和高效生產(chǎn)沉香，將產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)沉香變?yōu)楝F(xiàn)實。
[0005] 首先，本發(fā)明提供一種用于沉香屬植物結(jié)香的誘導劑，其含有葡聚六糖、大量元 素、微量元素和有機物。
[0006] 其中，所述的葡聚六糖的濃度為10~l〇〇〇pg/L。
[0007] 其中，所述大量元素為100~200π^/1的磷酸二氫鉀，100~200π^/1的氯化鎂，300 ~600mg/L的硝酸鈣，300~600mg/L的硝酸銨和800~1200mg/L的硫酸鉀。
[0008] 其中，所述微量元素為0 · 1~1 · Omg/L的硫酸銅，0 · 1~1 · Omg/L的鉬酸鈉，5~15mg/ L的硼酸，5~15mg/L的硫酸鋅，20~60mg/L的硫酸猛和20~60mg/L的乙二胺四乙酸鐵（ΙΠ ) 鈉。
[0009] 其中，所述有機物為5~20mg/L的甘氨酸，50~150mg/L的肌醇、1000~3000mg/L的 葡萄糖。本發(fā)明還提供一種沉香生產(chǎn)方法，在沉香屬植物的樹干上鉆孔，然后利用植物蒸騰 拉力將所述的用于沉香屬植物結(jié)香的誘導劑注入所述沉香屬植物樹體中，然后封住孔洞， 處理3~24個月后割取樹干中棕褐色油狀物以及黃棕色變色木質(zhì)部，曬干后即為沉香。 [0010] 其中，所述沉香屬植物的樹齡為3~30年、胸徑至少5cm。
[0011] 其中，鉆孔深度至少2cm，至多為樹木胸徑的2/3。
[0012] 本發(fā)明對鉆孔數(shù)量不加限制，可以為一個，也可以為多個。
[0013] 本發(fā)明調(diào)整現(xiàn)有沉香誘導劑的組分，用天然的真菌激發(fā)子(葡聚六糖)替代人工合 成的植物激素(茉莉酸甲酯和乙烯利等)誘導沉香屬植物啟動防御反應(yīng)，產(chǎn)生與植物防御有 關(guān)的藥用次生代謝產(chǎn)物，如倍半萜類和2-(2-苯乙基)色酮類具有抑菌活性的防御物質(zhì)（藥 材沉香的主要化學成分）。首次將樹木營養(yǎng)液(大量元素、微量元素和有機物)添加到沉香誘 導劑中，這是因為其能夠迅速補充樹木所需的各種營養(yǎng)成分，改善樹勢，為沉香形成提供足 夠的營養(yǎng)成分。本發(fā)明所生產(chǎn)的沉香完全滿足市場需求和要求，可用于大規(guī)模、標準化、商 品化的生產(chǎn)，既可提高香農(nóng)收入，又可保護野生沉香和白木香資源，具有重要的經(jīng)濟效益、 社會效益和生態(tài)效益。
【具體實施方式】
[0014] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0015] 實施例1
[0016] 選取5年樹齡，胸徑大于IOcm的白木香樹，在距離地面5cm處，垂直樹干使用普通電 鉆，鉆頭直徑為0.6cm，鉆2個深5cm的孔。配置質(zhì)量百分濃度為10pg/L真菌激發(fā)子一一葡聚 六糖和植物營養(yǎng)液(0 . lmg/L五水合硫酸銅、20mg/L乙二胺四乙酸鐵（ΙΠ )鈉、硼酸5.Omg/L、 20mg/L一水合硫酸猛、0. lmg/L二水合鉬酸鈉、5. Omg/L七水合硫酸鋅、300mg/L四水合硝酸 鈣、100mg/L磷酸二氫鉀、800mg/L硫酸鉀、100mg/L氯化鎂、300mg/L硝酸銨、5mg/L甘氨酸、 50mg/L肌醇、1000mg/L葡萄糖)溶液500ml，從鉆孔通過植物蒸騰拉力輸入白木香樹體，輸液 完畢后用橡膠塞封住輸液孔，防止沉香誘導劑流出和雨水沖刷。輸液結(jié)束后數(shù)天內(nèi)未觀察 到樹葉掉落。輸液結(jié)香處理3、6個月后，割取創(chuàng)傷周圍形成的棕褐色油狀物及黃褐色的變色 木質(zhì)部，經(jīng)曬干后得到沉香。
[0017] 對本實施例誘導生產(chǎn)的沉香隨機挑選三份樣品的醇浸出物進行了含量測定，同一 批樣品平行試驗5次，得實驗產(chǎn)出的沉香樣品浸出物含量均高于10%，而且沉香四醇 (CnHi 8O6)含量也均高于0.1 %，達到藥典要求水平。沉香油含量和沉香油中倍半萜含量檢測 結(jié)果顯示得到提高。檢測方法如下：
[0018] 1)醇溶性浸出物含量檢測：
[0019] 割取的沉香參照2015年《中華人民共和國藥典》所載醇溶性浸出物測定法項下的 熱浸法制取沉香油，并對所得沉香樣品的醇溶性浸出物含量進行了測定。精密稱取沉香藥 材粉末2. Og，置250ml的錐形瓶中，精密加入無水乙醇50ml，塞緊，稱定重量，靜置1小時后， 連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1小時。放冷，取下圓底燒瓶，塞緊，稱定重量，用 水補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，即得沉香油。精密量取濾液25ml，置已干燥至恒 重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于l〇5°C干燥3小時，移至干燥器中，冷卻30分鐘，迅速精密 稱定重量，以干燥品計算藥材中醇溶性浸出物的含量（％ )。
[0020] 2)沉香油含量和沉香油中倍半萜含量檢測：
[0021] 沉香樣品粉碎過26目篩，精密稱取100g置于5000ml圓底燒瓶中，加入2500ml蒸餾 水浸泡過夜。安裝水蒸氣蒸餾裝置Clevenger，微沸提取12h。收集揮發(fā)油，加入適量無水硫 酸鈉，使用〇. 45μπι的有機相微孔膜過濾器后即得揮發(fā)油。
[0022] 將樣品的揮發(fā)油進行GC-MS分析。儀器為美國瓦里安公司的Varian 450GC-300MS 聯(lián)用儀。色譜柱為石英毛細管柱VF-5MS，30m X 0.25mm，膜厚0.25μπι。
[0023] 升溫程序：從50°C開始以10°C/min升到155°C，保留15min;再以8°C/min升到280 °C，保留IOmin.載氣為He，柱流量lml/min，進樣量ΙμL。進樣口溫度為250°C，不分流。質(zhì)譜條 件:EI源；電離電壓:70eV;離子源溫度:250°C ;全掃描范圍：50~500amu。ΙμL的C8-C4Q正構(gòu)烷 烴混標以同樣的方法進行檢測。用峰面積歸一化法計算出各峰化合物的相對百分含量，每 個峰對應(yīng)的RI指數(shù)根據(jù)AMDIS軟件直接計算。各峰所得質(zhì)譜通過檢索NIST 08標準質(zhì)譜圖 庫、參考文獻報道。再在NIST Chemistry WebBook(http://webbook.nist.gov/ chemistry/)上比對相似度較高化合物的RI值，鑒定出倍半萜類化合物，計算總的倍半萜百 分比含量。
[0024] 3)沉香四醇(CnH18O6)含量測定
[0025]供試品溶液的制備取本品粉末(過三號篩)約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精 密加入乙醇IOml，稱定重量，浸泡0.5小時，超聲處理(功率250W，頻率40kHZ) 1小時，放冷，再 稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。參照2015年 《中華人民共和國藥典》所載高效液相色譜法(通則0512)測定。測定法分別精密吸取對照品 溶液與供試品溶液各l〇yL，注入Waters高效液相色譜儀，采用Agilent-C18柱(柱長為25cm， 內(nèi)徑為4.6mm，粒徑為5μπ〇;以乙腈為流動相A，以0.1%甲酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī) 定進行梯度洗脫;流速為每分鐘〇. 7ml;柱溫為檢測波長為252nm。理論板數(shù)按沉香四醇峰計 算應(yīng)不低于6000。
[0026] 表1梯度洗脫稈序
[0029]對上述方法制備的沉香進行醇溶性浸出物含量、沉香四醇含量、揮發(fā)油含量、揮發(fā) 油中倍半萜含量、沉香產(chǎn)量、醇溶性浸出物產(chǎn)量、沉香四醇產(chǎn)量、揮發(fā)油產(chǎn)量、總倍半萜產(chǎn)量 進行測定，見下表。
[0030] 表2沉香質(zhì)量檢測
[0032]上表數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明結(jié)香3個月的沉香達到國家藥典2015年版的標準(醇溶性浸 出物含量不低于10%和沉香四醇含量不低于0.1%)，醇溶性浸出物含量為14.7%和沉香四 醇含量為0.16%，均遠高于藥典標準的47%和60%。與結(jié)香3個月相比較，結(jié)香6個月能夠顯 著提高沉香的醇溶性浸出物含量、沉香四醇含量、揮發(fā)油含量、揮發(fā)油中倍半萜含量，可提 高 28.71 ~56.25%。
[0033] 實施例2
[0034] 選取10年樹齡，胸徑大于15cm的白木香樹，在距離地面IOcm處，垂直樹干使用普通 電鉆，鉆頭直徑為0.6cm，鉆2個深6cm的孔。配置質(zhì)量百分濃度為100pg/L真菌激發(fā)子一葡聚 六糖和植物營養(yǎng)液(0 · 5mg/L五水合硫酸銅、40mg/L乙二胺四乙酸鐵(ΙΠ )鈉、硼酸10 · Omg/L、 40mg/L一水合硫酸猛、0.5mg/L二水合鉬酸鈉、10 .Omg/L七水合硫酸鋅、450mg/L四水合硝酸 鈣、150mg/L磷酸二氫鉀、1000mg/L硫酸鉀、150mg/L氯化鎂、40mg/L硝酸銨、15mg/L甘氨酸、 100mg/L肌醇、1500mg/L葡萄糖)溶液500ml，從鉆孔通過植物蒸騰拉力輸入白木香樹體，輸 液完畢后用橡膠塞封住輸液孔，防止沉香誘導劑流出和雨水沖刷。輸液結(jié)束后數(shù)天內(nèi)未觀 察到樹葉掉落。輸液結(jié)香處理3和6個月后，割取創(chuàng)傷周圍形成的棕褐色油狀物及黃褐色的 變色木質(zhì)部，經(jīng)曬干后得到沉香。
[0035] 醇溶性浸出物、沉香油、沉香油中倍半萜及沉香四醇(Cl7Hl8〇6 )含量測定方法同實 施例1。
[0036] 表3沉香質(zhì)量檢測
[0038]上表數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明結(jié)香3個月的沉香達到國家藥典2015年版的標準(醇溶性浸 出物含量不低于10 %和沉香四醇含量不低于0.1%)，醇溶性浸出物含量為15.96%和沉香 四醇含量為ο. 23%，均遠高于藥典標準的64.4%和130.OO%。與結(jié)香3個月相比較，結(jié)香6個 月能夠顯著提高沉香的醇溶性浸出物含量、沉香四醇含量、揮發(fā)油含量、揮發(fā)油中倍半萜含 量，可提高15.38~39.13%。
[0039] 實施例3
[0040] 選取8年樹齡，胸徑大于13cm的白木香樹，在距離地面IOcm處，垂直樹干使用普通 電鉆，鉆頭直徑為0.6cm，鉆2個深5cm的孔。配置質(zhì)量百分濃度為1000pg/L真菌激發(fā)子一葡 聚六糖和植物營養(yǎng)液（I. 〇mg/L五水合硫酸銅、60mg/L乙二胺四乙酸鐵（ΙΠ )鈉、硼酸15. Omg/ L、60mg/L-水合硫酸猛、I .Omg/L二水合鉬酸鈉、15 .Omg/L七水合硫酸鋅、600mg/L四水合硝 酸鈣、200mg/L磷酸二氫鉀、1200mg/L硫酸鉀、200mg/L氯化鎂、600mg/L硝酸銨、20mg/L甘氨 酸、150mg/L肌醇、2000mg/L葡萄糖)溶液500ml，從鉆孔通過植物蒸騰拉力輸入白木香樹體， 輸液完畢后用橡膠塞封住輸液孔，防止沉香誘導劑流出和雨水沖刷。輸液結(jié)束后數(shù)天內(nèi)未 觀察到樹葉掉落。輸液結(jié)香處理3、6個月后，割取創(chuàng)傷周圍形成的棕褐色油狀物及黃褐色的 變色木質(zhì)部，經(jīng)曬干后得到沉香。
[0041 ]醇溶性浸出物、沉香油、沉香油中倍半萜及沉香四醇(Ci7HisO6)含量測定方法同實 施例1。
[0042] 表4沉香質(zhì)量檢測
[0044]上表數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明結(jié)香3個月的沉香達到國家藥典2015年版的標準(醇溶性浸 出物含量不低于10 %和沉香四醇含量不低于0.1%)，醇溶性浸出物含量為16.44 %和沉香 四醇含量為0.21%，均遠高于藥典標準的64.4%和110.00%。與結(jié)香3個月相比較，結(jié)香6個 月能夠顯著提高沉香的醇溶性浸出物含量、沉香四醇含量、揮發(fā)油含量、揮發(fā)油中倍半萜含 量，可提高23.84~38.10%。
[0045] 對比例1
[0046] 選取6年樹齡，胸徑大于IOcm的白木香樹，在距離地面5cm處，垂直樹干使用普通電 鉆，鉆頭直徑為0.6cm，鉆2個深5cm的孔。配置質(zhì)量百分濃度為植物營養(yǎng)液(0.5mg/L五水合 硫酸銅、50mg/L乙二胺四乙酸鐵（ΙΠ )鈉、硼酸5.0mg/L、30mg/L-水合硫酸猛、0 · 5mg/L二水 合鉬酸鈉、10.0 mg/!七水合硫酸鋅、600mg/L四水合硝酸鈣、200mg/L磷酸二氫鉀、1200mg/L 硫酸鉀、300mg/L氯化鎂、500mg/L硝酸銨、20mg/L甘氨酸、150mg/L肌醇、1000mg/L葡萄糖）溶 液500ml，從鉆孔通過植物蒸騰拉力輸入白木香樹體，輸液完畢后用橡膠塞封住輸液孔，防 止沉香誘導劑流出和雨水沖刷。輸液結(jié)束后數(shù)天內(nèi)未觀察到樹葉掉落。輸液結(jié)香處理3和6 個月后，割取創(chuàng)傷周圍形成的棕褐色油狀物及黃褐色的變色木質(zhì)部，經(jīng)曬干后得到沉香。
[0047] 醇溶性浸出物、沉香油、沉香油中倍半萜及沉香四醇(Ci7HisO6)含量測定方法同實 施例1。
[0048] 表5沉香質(zhì)量檢測
[0050]上表數(shù)據(jù)顯示，未添加激發(fā)子的結(jié)香方法生產(chǎn)的3個月沉香未能達到國家藥典 2015年版的標準(醇溶性浸出物含量不低于10%和沉香四醇含量不低于0.1%)，醇溶性浸 出物含量僅為9.48%和沉香四醇含量為0.07 %，均低于國家藥典沉香藥材標準。與結(jié)香3個 月相比較，結(jié)香6個月僅僅達到但未顯著高于國家藥典2015年版的標準。
[0051 ] 對比例2
[0052]參照申請?zhí)?01310150138.5"一種生產(chǎn)沉香的方法"專利實施例1方法實施。選取5 年樹齡，胸徑大于IOcm的白木香樹，在距離地面5cm處，垂直樹干使用普通電鉆，鉆頭直徑為 0.6cm，鉆2個深5cm的孔。配制含0.1 %的茉莉酸甲酯、0.5 %的NaCl和0.3 %的苯乙醇溶液 500ml，將其緩慢輸入鉆孔，輸完后用橡膠塞封住孔洞，防止沉香藥劑流出和雨水沖刷。3天 后白木香樹部分葉子掉落。每1個月滴加一次，3個月后割取創(chuàng)傷周圍形成的棕褐色油狀物 及黃褐色的變色木質(zhì)部，經(jīng)曬干后得到沉香。
[0053]醇溶性浸出物、沉香油、沉香油中倍半萜及沉香四醇(CnHisO6)含量測定方法同上。 [0054] 表6沉香質(zhì)量檢測
[0056]上表數(shù)據(jù)顯示，對照方法結(jié)香3個月的沉香未能達到國家藥典2015年版的標準(醇 溶性浸出物含量不低于10%和沉香四醇含量不低于0.1%)，其沉香四醇含量僅為0.09%， 低于國家藥典沉香藥材標準。與結(jié)香3個月相比較，結(jié)香6個月僅僅達到但未顯著高于國家 藥典2015年版的標準。
[0057]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于沉香屬植物結(jié)香的誘導劑，其含有葡聚六糖、大量元素、微量元素和有機 物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于沉香屬植物結(jié)香的誘導劑，其特征在于，所述的葡聚六糖 的濃度為10~l〇〇〇pg/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于沉香屬植物結(jié)香的誘導劑，其特征在于，所述大量元素為 100~200mg/L的磷酸二氫鉀，100~200mg/L的氯化鎂，300~600mg/L的硝酸鈣，300~ 600mg/L的硝酸銨和800~1200mg/L的硫酸鉀。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于沉香屬植物結(jié)香的誘導劑，其特征在于，所述微量元素為 0.1~1. Omg/L的硫酸銅，0.1~1 .Omg/L的鉬酸鈉，5~15mg/L的硼酸，5~15mg/L的硫酸鋅， 20~60mg/L的硫酸錳和20~60mg/L的乙二胺四乙酸鐵（ΙΠ )鈉。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于沉香屬植物結(jié)香的誘導劑，其特征在于，所述有機物為5 ~20mg/L的甘氨酸，50~150mg/L的肌醇、1000~3000mg/L的葡萄糖。6. -種沉香生產(chǎn)方法，其特征在于，在沉香屬植物的樹干上鉆孔，然后利用植物蒸騰拉 力將權(quán)利要求1-5任一項所述的用于沉香屬植物結(jié)香的誘導劑注入所述沉香屬植物樹體 中，然后封住孔洞，處理3-24個月后割取樹干中棕褐色油狀物以及黃棕色變色木質(zhì)部，曬干 后即為沉香。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述沉香屬植物的樹齡為3-30年、胸徑至少 5cm〇8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，鉆孔深度至少2cm，至多為樹木胸徑的2/3。
【文檔編號】A01P21/00GK106007980SQ201610353895
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】唐靜, 劉瑤瑤
【申請人】國森天香（北京）生物科技有限公司