一種防治青枯病的微生物有機肥、制備方法及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種防治青枯病的微生物有機肥、制備方法及其應用，以黑根霉和解淀粉芽孢桿菌有機發(fā)酵液為主要原料，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的防治青枯病的微生物有機肥，可以抑制病原微生物的生長，有效防治青枯病，對青枯病病原菌的抑制率較高，調節(jié)土壤理化生及生化性狀，提供農作物生長所必需的營養(yǎng)物質，提高作物產量和品質，增強作物的抗逆性，并且不會對環(huán)境產生污染，是一種綠色高效的復合型生物肥料。CGMCC NO.843620131105
【專利說明】
一種防治青枯病的微生物有機肥、制備方法及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物防治領域，具體涉及一種防治青枯病的微生物有機肥、制備方法 及其應用。
【背景技術】
[0002] 作物細菌性青枯病素有植物"癌癥"之稱，是由茄科勞爾氏菌（BAlstonia solanacearum)引發(fā)的一種世界性的重要植物土傳病害。其發(fā)病主要集中在溫暖、潮濕、雨 水充沛的熱帶和亞熱帶地區(qū)的50多個國家和地區(qū)，一旦發(fā)生則難以控制，往往造成作物大 面積死亡甚至絕收，危害嚴重。
[0003] R. solanacearum的寄主非常廣泛，包括農作物、果樹、蔬菜、林木、花丼、藥材、牧草 和雜草等50多科300多種植物；由該病菌引起的癥狀是，發(fā)病初期，病株主莖頂梢第一、二片 葉白天呈現(xiàn)失水性凋萎，早晚尚可恢復，之后隨著病情的發(fā)展則不再恢復，病株葉片自上而 下逐漸萎蔫，葉色暗淡，呈青綠色，最后病株枯死。
[0004] 根據(jù)對不同寄主植物的致病性，可將茄科勞爾氏菌分為5個小種：1號小種寄主范 圍較廣，侵染番茄、煙草等茄科作物及姜、甘薯等其他植物;2號小種侵染香蕉、赫蕉、大蕉、 海里康;3號小種侵染馬鈴薯、番茄，對其他植物致病力弱;4號小種侵染生姜，對其他植物侵 染力弱或不侵染;5號小種侵染桑樹，不侵染其他植物。
[0005] 植物青枯病的防治一直是個世界性的難題。目前防治青枯病的主要方法包括化學 防治，農業(yè)防治和生物防治三種方法。
[0006] 化學防治因其生產簡便、價格便宜、特別是見效快等優(yōu)點，在青枯病的防治中一直 占有主要地位，而被廣泛應用。早期對已經(jīng)大面積發(fā)病的植物，化學防治幾乎是唯一的選 擇。化學防治目前還沒有研制出高效、低毒和無環(huán)境污染的化學藥劑用于防治番茄青枯病 的發(fā)生，現(xiàn)常見的化學藥劑主要是百菌清、鏈霉素、施寶靈、強氯精、多菌靈、雙效靈、DT粉刺 和可殺得等，主要是一些廣譜殺菌劑，防治效果均不理想，加之青枯菌對化學農藥易產生抗 藥性，而且大量使用化學農藥會造成環(huán)境污染和生產成本的上升，后期防效差而不能最終 控制青枯病的發(fā)生。
[0007] 化學防治的現(xiàn)狀令人擔憂，農產品的農藥殘留和劇毒農藥直接對人類生存環(huán)境造 成嚴重污染，危及人類和其他生物的生命。隨著可持續(xù)農業(yè)和可持續(xù)植保觀念的不斷深入 與發(fā)展，生物防治越來越受到人們的重視。而且，早期國內外專家們在抗病品種選育、化學 防治、農業(yè)防治等方面進行了大量的研究，但由于抗病品種抗性低且抗性容易喪失，化學藥 劑的后期防效差且病菌易產生抗藥性而不能最終控制青枯病的發(fā)生，農業(yè)措施如水旱輪作 受地域條件限制而難于大面積推廣，迄今尚未研究出十分理想、有效的防治技術。
[0008] 農業(yè)防治在減少青枯病的發(fā)生上也起到一定的作用，在農業(yè)防治方面，以輪作、改 良土壤(撤石灰）、培育壯苗、拔除病株、合理施肥等措施為主。農業(yè)措施如水旱輪作受地域 條件限制而難子大面積推廣，嫁接由于青枯菌的變異，砧木很快喪失抗病性，該方法難以在 田間使用。迄今為止尚未研究出十分理想、有效的防治技術。
[0009] 生物防治是近年來才發(fā)展起來的新興學科，它具有無污染、不殺傷天敵、不會產生 抗藥性、有利于人畜安全及環(huán)境保護、兼防兼治，且符合發(fā)展有機農業(yè)的要求的優(yōu)點，生物 防治作為防治青枯病較為理想的途徑，目前已初見成效。
[0010] 隨著環(huán)境保護問題的提出，生物防治成為取代化學農藥的新一代殺菌制利，將有 十分廣闊的發(fā)展和應用前景。
[0011] 但是目前，現(xiàn)有的生物防治技術存在著防效不穩(wěn)定，使用起來不如化學農藥簡捷 方便，見效慢，不容易大批量生產等不利因素。

【發(fā)明內容】

[0012] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種防治青枯病的微生物有機肥，以黑根霉 和解淀粉芽孢桿菌為中心，并且將兩種菌進行混合發(fā)酵，發(fā)酵液接種于有機肥，所得發(fā)酵料 與黃腐酸鉀、甲殼素、常量元素、微量元素等混合制得。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種防治青枯病的微生物有機肥的制備方法，通過發(fā)酵制備得到 的防治青枯病的微生物有機肥能有效防治青枯病，調節(jié)土壤理化生及生化性狀，提供農作 物生長所必需的營養(yǎng)物質。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種防治青枯病的微生物有機肥的應用，用于防治植物青枯病。
[0015] 本發(fā)明提供的一種防治青枯病的微生物有機肥，含有以下重量份的原料： 解淀粉芽孢桿菌和黑根霉的有機肥發(fā)酵料 100
[0016] 「P 売素 0.02 ~0.05 尿素 7. 0~8, 0 硫酸鈣 0.5~1.5 三水合磷酸氫二鉀 5. 0~12. 0 甲基纖維素 1~5
[0017] 羧甲基纖維素鈉 1~5 乙基纖維素 1~5 酵母粉 5 凹凸棒土 5。
[0018] 所述解淀粉芽孢桿菌和黑根霉的有機肥發(fā)酵料的制備方法為：
[0019] a、將解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA_2進行培養(yǎng)，制得淀粉芽 孢桿菌液體培養(yǎng)液；
[0020] b、將黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9進行培養(yǎng)，制得黑根霉液體培養(yǎng)液；
[0021] c、將淀粉芽孢桿菌液體培養(yǎng)液和黑根霉液體培養(yǎng)液混合后接種于麩皮葡萄糖培 養(yǎng)基中，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，制得菌種發(fā)酵液；
[0022] d、將農家肥原料的干料粉碎后，加水，混合均勻，接種步驟c制得的菌種發(fā)酵液，混 合均勻，堆料發(fā)酵，得發(fā)酵料。
[0023] 步驟a中所述黑根霉(Rhizopus nigricans)RN_9于2013年11月5日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號CGMCC N0.8436，保藏地址:北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；
[0024] 步驟a中所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA_2購自山東君德 生物科技有限公司。
[0025] 步驟a具體為：將解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA_2接種于LB 平板培養(yǎng)基上進行平板培養(yǎng)，然后，轉接至LB液體培養(yǎng)基中，進行搖瓶培養(yǎng)，制得淀粉芽孢 桿菌液體培養(yǎng)液；
[0026] 步驟b具體為:將黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9接種于PDA平板培養(yǎng)基上進行 平板培養(yǎng)，然后將黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9菌絲塊轉接至培養(yǎng)基中，進行搖瓶 培養(yǎng)，制得黑根霉液體培養(yǎng)液;所述菌絲塊用內徑為5mm的打孔器在菌落邊緣打孔后，用接 種環(huán)挑取獲得。
[0027]步驟a中所述平板培養(yǎng)的條件為35°C~37°C培養(yǎng)24h~36h。
[0028] 步驟a中搖瓶培養(yǎng)條件為:35°C~37°C、120~140rpm條件下，培養(yǎng)4~8天。
[0029] 步驟b中所述平板培養(yǎng)的條件為25°C~30°C培養(yǎng)36h~50h。
[0030] 步驟b中搖瓶培養(yǎng)條件為:25°C~30°C、120~140rpm條件下，培養(yǎng)8~15天。
[0031]所述LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基為本領域常用培養(yǎng)基；
[0032]所述PDA培養(yǎng)基的制備方法可以為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，蒸餾水定容至 1000mL〇
[0033] 所述roB培養(yǎng)基的制備方法可以為:馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水定容至1000mL。
[0034] 步驟c中黑根霉液體培養(yǎng)液和淀粉芽孢桿菌液體培養(yǎng)液按體積比為1:1~3接種于 麩皮葡萄糖培養(yǎng)基中。
[0035]步驟c中所述麩皮葡萄糖培養(yǎng)基制備方法為:麩皮60~80克，葡萄糖20克，水定容 至1L。
[0036]步驟c所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:在25°C~30°C、120~140rpm條件下，培養(yǎng)3~5天;優(yōu) 選的，發(fā)酵培養(yǎng)條件為在28°C、120rpm條件下，培養(yǎng)4天。
[0037]步驟d具體為:將農家肥原料的干料粉碎后，按干重的40~50wt %加水，混合均勻， 然后按農家肥原料干料的干重的2~5wt%接種步驟c制得的菌種發(fā)酵液，混合均勻，堆料發(fā) 酵，制得解淀粉芽孢桿菌BA-2和黑根霉RN-9的孢子數(shù)之和不小于0.5億/克的發(fā)酵料；
[0038]所述農家肥原料選自作物秸桿、樹葉、雜草;粉碎至長度1~3cm。
[0039]步驟d中所述堆料發(fā)酵為：將堆料堆成截面為寬1.5~2.5m、高0.8~1.2m的條形 堆，每天翻堆3~4次;發(fā)酵時間為5~8天，發(fā)酵溫度30~40°C，發(fā)酵濕度保持在55-65%。 [0040]本發(fā)明提供的一種防治青枯病的微生物有機肥的制備方法，包括以下步驟：
[0041 ] (1)將100重量份發(fā)酵料質量、0.02~0.05重量份甲殼素、7.0~8.0重量份尿素、 0.5~1.5重量份硫酸鈣、5.0~12.0重量份三水合磷酸氫二鉀和凹凸棒土5份，混合均勻；
[0042] (2)然后加入1~5重量份的甲基纖維素、1~5重量份羧甲基纖維素鈉、1~5重量份 乙基纖維素，5重量份酵母粉，攪拌混合均勻；
[0043] (3)烘干，即得。
[0044] 步驟(3)中烘干為:遠紅外烘干65~75°C，20~25min，即得。
[0045]進一步的，將烘干后產品壓縮成型，可為棒狀，尺寸直徑為60-80mm，長度為180- 250mm，單棒重0.5-0.8Kg。
[0046] 進一步的，制備方法還包括，將壓制成型后產品熱縮膜包裝、裝箱。
[0047] 生產工藝流程按上述原料配比，并測定每樣原料的固有含量，混合攪拌、遠紅外烘 干使含水量達到標準、液壓機壓制成型、熱縮膜密封包裝即為成品。
[0048] 本發(fā)明提供的一種防治青枯病的微生物有機肥的應用，對茄科勞爾氏菌的抑制作 用?？捎糜诜乐沃参锴嗫莶。绕涫欠亚嗫莶〔?，馬鈴薯青枯病的防治。
[0049] 具體使用方法為:根據(jù)土傳病害的發(fā)病嚴重程度及易發(fā)病的時間施用該有機肥， 施用量為100-200公斤/畝、每月施肥1-2次。
[0050] 解淀粉芽抱桿菌BA-2解淀粉芽抱桿菌(Bacillus &11171〇119116€&(^6118)1^-2購自 山東君德生物科技有限公司。
[00511黑根霉RN-9的獲取方法：
[0052]從山東濰坊、壽光、煙臺等作物土傳病害發(fā)病嚴重的地區(qū)采集發(fā)病植株根際土壤 樣品，土壤采集方法為三點取樣法，即每個取樣點取三個子樣，每個子樣間距離10m，取樣深 度為5-lOcm，采樣完畢后，去除雜草，放入無菌自封袋中，低溫保存。
[0053]制備土壤稀釋液:稱取土壤10g，放入90mL無菌水的三角瓶中，振蕩，并用玻璃珠打 碎，靜置30min，配成土壤懸液。在超凈工作臺上用移液管從三角瓶中吸取lml，加入另一盛 有9ml無菌水的離心管中，混合均勻，以此類推分別制成10'10'10'10'1(^不同稀釋 倍數(shù)的土壤溶液。移取0.2ml稀釋液至平板培養(yǎng)基上，并充分混勻鋪平。其中，LB培養(yǎng)基所接 梯度為〇、1(T 2、1(T5; PDA培養(yǎng)基所接梯度為0、1(T3。每種各接3板，進行標記。LB培養(yǎng)基倒置于 37°C下恒溫培養(yǎng)36~50h;PDA培養(yǎng)基置于28°C培養(yǎng)72h。
[0054]分離純化:從平板中挑取顏色形態(tài)等不同的單個菌落用四區(qū)劃線法分離純化，用 同種培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，獲取單菌落。
[0055] 體外初篩：
[0056] 平板對峙法：
[0057]對于獲得的真菌采用平板對峙的方法進行篩選，以猝倒病病原菌瓜果腐霉菌、黃 萎病病原菌大麗輪枝菌和枯萎病病原菌尖鐮孢菌為指示菌。
[0058]在超凈工作臺上將病原微生物用滅菌后的接種器5mm)接種到PDA培養(yǎng)基的一 偵I同時將生防微生物接種到PDA培養(yǎng)基的另一側，28°C恒溫培養(yǎng)，每個處理設三個平行，觀 察記錄抑制效果，用十字交叉法測量病原微生物的菌落半徑，以只接種病原微生物的平板 作對照。第5天時，計算五株生防微生物對病原微生物的抑菌率，計算方法如下：
[0059] 抑菌率（％ )=【(對照組菌落半徑-實驗組菌落半徑)/對照組菌落半徑】X 100
[0060] 得到具有顯著抑菌效果的菌種從形態(tài)學特征和分子生物學（同源性分析)方面對 篩選的生防菌進行分類鑒定。
[0061 ]所購BA-2在LB平板上生長，白色，半透明，光滑濕潤菌落，稍隆起，圓形齊整菌落； 革蘭氏染色菌體紫色，為革蘭氏陽性菌，桿狀;根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》確定BA-2與解淀 粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)形態(tài)學特征一致。
[0062] 分子方面采用16s rDNA鑒定，對其序列進行DNA測序，通過將測序得到的16s rDNA 序列與已知細菌16s rDNA序列比較，從而獲得未知真菌種屬信息。通過16s rDNA鑒定，該菌 種與解淀粉芽孢桿菌的16s rDNA序列的相似度達到99%。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》，結 合形態(tài)學特征和分子生物學兩方面可以確定BA-2為解淀粉芽孢桿菌。
[0063] 解淀粉芽孢桿菌測序結果
[0066]分離得到RN-9在PDA培養(yǎng)基上生長快速，3天即長滿整個培養(yǎng)皿，起先白色，后變灰 白色，成熟后呈黑褐色。匍匐莖起先白色，后變褐色。假根分枝多，發(fā)育良好。孢子囊柄直立， 不分枝，起初白色，后變褐色，1-5枝叢生成一簇，長在假根對側，900 - 2700微米(mi)長，直 徑22 - 32微米，無分隔，細胞壁平滑。孢子囊圓形，直徑173-235微米，未成熟時白色，成熟后 黑色，孢子囊壁平滑，成熟時溶解。中軸圓形，直徑153-163微米，當孢子散出后，中軸多數(shù)下 陷成半圓形。孢子多數(shù)橄欖型或有棱角，表面有溝紋，灰色，7.5-9.6 X 4.3-7.5微米。ITS DNA測序分析發(fā)現(xiàn)，該菌種與黑根霉的ITS序列的相似度達到99%。根據(jù)《真菌鑒定手冊》，結 合形態(tài)學特征和分子生物學兩方面可以確定該真菌為黑根霉(Rhizopus nigrican)。
[0067]黑根霉測序結果
[0070] 解淀粉芽孢桿菌用以預防植物病害，活化土壤養(yǎng)分，降解農藥、化肥殘留，可以解 決農業(yè)種植中的重茬問題，作為混合發(fā)酵的主菌，是該生物有機肥有效殺菌成分的主要來 源；黑根霉作為挑戰(zhàn)菌進行接種，其生長速度較快，一方面刺激解淀粉芽孢桿菌，使其產生 更多有效的次級代謝產物，另一方面競爭營養(yǎng)物質抑制病原菌生長。
[0071] 發(fā)明提供的防治青枯病的微生物有機肥，在種子培養(yǎng)階段，通過控制發(fā)酵時間、溫 度、轉速等措施，將兩種生防菌按照一定的比例進行混合發(fā)酵，使發(fā)酵液中的孢子含量達到 最高，且孢子活力較高。在混合發(fā)酵過程中，兩種生防菌相互作用，使發(fā)酵液中的次生代謝 物質的種類及含量增加。在防治青枯病方面，這種生產方式可以達到協(xié)同的效果。
[0072]在有機肥料中發(fā)酵一方面可以提供兩種菌必須的營養(yǎng)物質，另一方面通過兩種微 生物分解活化有機質，為作物的生長提供更多更易被吸收利用的養(yǎng)料，使作物獲得更多養(yǎng) 料，抗逆性增強。
[0073] 甲殼素是一類天然的土壤結構改良劑，也是國外研究應用較廣闊的一種改良劑。 甲殼素中幾丁質和殼聚糖屬于氨基多糖，含有豐富的C、N元素，能被微生物降解利用，作為 植物生長的養(yǎng)分。幾丁質和殼聚糖具有膠結土粒，促進形成團聚體的能力。它們的分子上含 有大量羥基，羥基與粘粒礦物晶體表面上的氫原子形成氫鍵，能將分散的土粒膠結在一起 形成團聚體，疏水基覆蓋在粘粒表面，改變了粘粒的水合性，使形成的團聚體具有水穩(wěn)性。 另外，幾丁質和殼聚糖能改變土壤、根際和植物根組織微生物區(qū)系，促進有益微生物的生 長，抑制植物病原菌。甲殼素與可溶性蛋白合成的液體土壤改良劑，具有較好的穩(wěn)定性和可 降解性，能改善土壤的團粒結構，降解后還能成為優(yōu)良的有機肥料。在復合肥料中，添加脫 乙酰基殼聚糖溶液，可以成倍提高顆粒率，改善復合肥質量。
[0074] 尿素是目前含氮量最高的氮肥。作為一種中性肥料，尿素適用于各種土壤和植物。 它易保存，使用方便，對土壤的破壞作用小，是目前使用量較大的一種化學氮肥。
[0075] 硫酸鈣(石膏)是優(yōu)良的肥料和土壤改良劑.簡述硫酸鈣作為鈣肥、硫肥的效用.硫 酸鈣可保存其他肥料中的氮，并清除脫氮細菌.。
[0076] 磷酸二氫鉀在農業(yè)上用作高效磷鉀復合肥;磷酸二氫鉀產品廣泛適用于各類型經(jīng) 濟作物、糧食、瓜果、蔬菜等幾乎全部類型的作物，磷酸二氫鉀具有顯著增產增收、改量優(yōu)化 品質、抗倒伏、抗病蟲害、防治早衰等許多優(yōu)良作用，并且具有克服作物生長后期根系老化 吸收能力下降而導致的營養(yǎng)不足的作用。
[0077] 甲殼素、尿素、硫酸鈣、三水合磷酸氫二鉀作為速效肥料，可以在短時間內為作物 提供養(yǎng)分，而生物肥可作為長效肥，為作物長期提供養(yǎng)分。
[0078] 將其充分混勻后加入甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素，酵母粉作粘合 劑，保證各成分在產品中的比例一致，多種組分的粘合劑可適應不同理化性狀的土壤，可形 成高粘度的膠體、溶液、有粘著、增稠、流動、乳化分散、賦形、保水、保護膠體、薄膜成型、耐 酸、耐鹽、懸濁等特性，且生理無害。
[0079]凹凸棒土施入土壤后能提高土壤肥力，增加作物產量，減少農田灌溉用水量。主要 是由于凹凸棒土具有較好的陽離子代換性、吸附性、保水性、黏結性等特點，可以改良土壤 的物化性狀，，改善土壤的水熱條件。陽離子交換量是土壤保肥供肥的一個重要指標。凹凸 棒土有較高的吸水率和較好的黏結性，這些性能對協(xié)調土壤的水肥氣熱，，提高土壤肥力具 有良好的效果。同時，凹凸棒土含有較高的礦質營養(yǎng)元素，可以增加土壤的肥力，提供微量 元素。凹凸棒土還可以吸附土壤中的有害元素，減輕土壤的污染。在肥料生產中，加入適量 的凹凸棒土，不僅可以提高肥料成粒率，提高造粒速度，而且顆粒強度高，不結塊，不返潮， 顆粒均勻，表面光滑，色澤度好，可提高復混肥產量，降低成本，減少環(huán)境污染;還可提供植 物生長必須的微量元素。硝酸鈉、硝酸銨、尿素等化肥都可以用凹凸棒土作為調節(jié)劑改善肥 料的物理性狀。
[0080] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的防治青枯病的微生物有機肥集速效、長效、增效為 一體，可以抑制病原微生物的生長，有效防治青枯病，對青枯病病原菌的抑制率較高，調節(jié) 土壤理化生及生化性狀，提供農作物生長所必需的營養(yǎng)物質，提高作物產量和品質，增強作 物的抗逆性，并且不會對環(huán)境產生污染，是一種綠色高效的復合型生物肥料。
【附圖說明】
[0081] 圖1為本發(fā)明制備流程示意圖。
【具體實施方式】
[0082] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。
[0083] 培養(yǎng)基：
[0084]平板PDA培養(yǎng)基組分如下：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂18g，蒸餾水定容至1000mL。 [0085] PDB培養(yǎng)基組分如下：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水定容至1000mL。
[0086] LB固體培養(yǎng)基組分如下:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂18g，蒸餾水 定容至1000mL。
[0087] LB液體培養(yǎng)基組分如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸餾水定容至 1000mL〇
[0088] 實施例1
[0089] -種防治青枯病的微生物有機肥的制備方法，包括以下步驟：
[0090] (1)將解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA_2接種于LB平板培養(yǎng)基 上，在37°C進行平板培養(yǎng)36h;黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9接種于PDA平板培養(yǎng)基上， 在28°C進行平板培養(yǎng)48h;
[OO91 ] (2)將步驟（1)平板培養(yǎng)后的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA- 2用接種環(huán)轉接至LB液體培養(yǎng)基中，在37 °C、120rpm條件下，進行PDB液體培養(yǎng)8天；黑根霉 (Rhizopus nigricans)RN-9用內徑為5mm的打孔器在菌落邊緣打孔后，用接種環(huán)挑取菌絲 塊轉接至培養(yǎng)基中，在28 °C、120rpm條件下，進行液體培養(yǎng)10天，制得液體培養(yǎng)液；
[0092] (3)將步驟(2)制得的液體培養(yǎng)液是將淀粉芽孢桿菌液體培養(yǎng)液和黑根霉液體培 養(yǎng)液按體積比1:1混合后，接種于麩皮葡萄糖培養(yǎng)基中，在25°C、100rpm條件下，發(fā)酵培養(yǎng)5 天，制得發(fā)酵液；
[0093] 上述麩皮葡萄糖培養(yǎng)基每升組分如下：
[0094]麩皮70克，葡萄糖20克，水定容至1L;
[0095] (4)將小麥秸桿干料粉碎至長度1~3cm后，按干重的40wt %加水，混合均勻，然后 按小麥秸桿干重的2wt%接種步驟(3)制得的發(fā)酵液，混合均勻，將堆料堆成截面為寬2m、高 lm的條形堆，每天翻堆3~4次，經(jīng)堆料發(fā)酵5天，發(fā)酵溫度30~40°C，發(fā)酵濕度保持在60%左 右，制得發(fā)酵料;經(jīng)檢測，淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA_2和黑根霉 (Rhizopus nigricans)RN_9的抱子數(shù)之和>0? 65億/克；
[0096] (5)按步驟(4)制得的發(fā)酵料質量的0.05%加入甲殼素、7.0%加入尿素、1.5%加 入硫酸鈣(CaS〇4)、5.0 %加入三水合磷酸氫二鉀(K2HP〇4 ? 3H20)、5.0 %加入凹凸棒土，混合 均勻，然后按步驟(4)制得的發(fā)酵料質量的5%加入甲基纖維素、1%加入羧甲基纖維素鈉、 5 %加入乙基纖維素，加入5 %酵母粉作粘合劑，攪拌混合均勾、遠紅外烘干75 °C，25min、壓 制成型、熱縮膜包裝、裝箱，該棒肥尺寸直徑為60-80mm，長度為180-250mm，單棒重0.5- 0.8Kg。生產工藝流程按上述原料配比，并測定每樣原料的固有含量，混合攪拌、遠紅外烘干 使含水量達到標準、液壓機壓制成型、熱縮膜密封包裝即為成品。
[0097] 實施例2
[0098] -種防治青枯病的微生物有機肥的制備方法，包括以下步驟：
[0099] (1)將解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA_2接種于LB平板培養(yǎng)基 上，在37°C進行平板培養(yǎng)36h;黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9接種于PDA平板培養(yǎng)基上， 在25°C進行平板培養(yǎng)50h;
[0100] (2)將步驟（1)平板培養(yǎng)后的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA- 2用接種環(huán)轉接至LB液體培養(yǎng)基中，在37 °C、120rpm條件下，進行PDB液體培養(yǎng)8天；黑根霉 (Rhizopus nigricans)RN-9用內徑為5mm的打孔器在菌落邊緣打孔后，用接種環(huán)挑取菌絲 塊轉接至培養(yǎng)基中，在25°C、140rpm條件下，進行液體培養(yǎng)15天，制得液體培養(yǎng)液；
[0101 ] (3)將步驟(2)制得的液體培養(yǎng)液是將淀粉芽孢桿菌液體培養(yǎng)液和黑根霉液體培 養(yǎng)液體積比1:2混合，接種于麩皮葡萄糖培養(yǎng)基中，在30°C、150rpm條件下，發(fā)酵培養(yǎng)3天，制 得發(fā)酵液；
[0102]上述麩皮葡萄糖培養(yǎng)基每升組分如下：
[0103]麩皮50克，葡萄糖20克，水定容至1L;
[0104] (4)將雜草干料粉碎至長度1~3cm后，按干重的30wt%加水，混合均勻，然后按小 麥秸桿干重的5wt%接種步驟(3)制得的發(fā)酵液，混合均勻，將堆料堆成截面為寬2m、高lm的 條形堆，每天翻堆3~4次，經(jīng)堆料發(fā)酵3天，發(fā)酵溫度30~40°C，發(fā)酵濕度保持在60%左右， 制得發(fā)酵料；經(jīng)檢測，淀粉芽孢桿菌（Baci llus amylol iquefaciens )BA_2和黑根霉 (Rhizopus nigricans)RN_9的抱子數(shù)之和>0? 55億/克；
[0105] (5)按步驟(4)制得的發(fā)酵料質量的0.02 %加入甲殼素、8.0 %加入尿素、0.5 %加 入硫酸鈣(CaS〇4)、12.0%加入三水合磷酸氫二鉀(K2HP〇4 ? 3H20)、5%加入凹凸棒土，混合 均勻，然后按步驟(4)制得的發(fā)酵料質量的1%加入甲基纖維素、5%加入羧甲基纖維素鈉、 1 %加入乙基纖維素，加入5 %酵母粉作粘合劑，攪拌混合均勾、遠紅外烘干、75°C，25min壓 制成型、熱縮膜包裝、裝箱，該棒肥尺寸直徑為60-80mm，長度為180-250mm，單棒重0.5- 0.8Kg。生產工藝流程按上述原料配比，并測定每樣原料的固有含量，混合攪拌、遠紅外烘干 使含水量達到標準、液壓機壓制成型、熱縮膜密封包裝即為成品。
[0106] 實施例3
[0107] -種防治青枯病的微生物有機肥的制備方法，包括以下步驟：
[0108] (1)將解淀粉芽抱桿菌(Baci llus amylol iquefaciens )BA_2接種于LB平板培養(yǎng)基 上，在37°C進行平板培養(yǎng)36h;黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9接種于PDA平板培養(yǎng)基上， 在30°C進行平板培養(yǎng)36h;
[0109] (2)將步驟（1)平板培養(yǎng)后的解淀粉芽孢桿菌(Baci llus amylol iquefaciens )BA-2用接種環(huán)轉接至LB液體培養(yǎng)基中，在37 °C、120rpm條件下，進行PDB液體培養(yǎng)8天；黑根霉 (Rhizopus nigricans)RN-9用內徑為5mm的打孔器在菌落邊緣打孔后，用接種環(huán)挑取菌絲 塊轉接至培養(yǎng)基中，在30 °C、lOOrprn條件下，進行液體培養(yǎng)8天，制得液體培養(yǎng)液；
[011 0] (3)將步驟(2)制得的液體培養(yǎng)液是將淀粉芽孢桿菌液體培養(yǎng)液和黑根霉液體培 養(yǎng)液按體積比1:3混合，混合后接種于麩皮葡萄糖培養(yǎng)基中，在28°C、120rpm條件下，發(fā)酵培 養(yǎng)4天，制得發(fā)酵液； 上述麩皮葡萄糖培養(yǎng)基每升組分如下：
[0112] 麩皮50克，葡萄糖20克，水定容至1L;
[0113] (4)將玉米秸桿干料粉碎至長度1~3cm后，按干重的50wt %加水，混合均勻，然后 按小麥秸桿干重的2.5wt%接種步驟(3)制得的發(fā)酵液，混合均勻，將堆料堆成截面為寬2m、 高lm的條形堆，每天翻堆3~4次，經(jīng)堆料發(fā)酵5天，發(fā)酵溫度30~40°C，發(fā)酵濕度保持在60% 左右，制得發(fā)酵料;經(jīng)檢測，淀粉芽孢桿菌(Baci llus amylol iquefaciens )BA_2和黑根霉 (Rhizopus nigricans)RN_9的抱子數(shù)之和>0? 6億/克；
[0114] (5)按步驟(4)制得的發(fā)酵料質量的0.04%加入甲殼素、7.5%加入尿素、1.0%加 入硫酸鈣(CaS〇4)、10.0%加入三水合磷酸氫二鉀(K2HP〇4 ? 3H20)、5%加入凹凸棒土，混合 均勻，然后按步驟(4)制得的發(fā)酵料質量的3%加入甲基纖維素、3%加入羧甲基纖維素鈉、 3 %加入乙基纖維素，加入5 %酵母粉作粘合劑，攪拌混合均勾、遠紅外烘干75 °C，25min、壓 制成型、熱縮膜包裝、裝箱，該棒肥尺寸直徑為60-80mm，長度為180-250mm，單棒重0.5- 0.8Kg。生產工藝流程按上述原料配比，并測定每樣原料的固有含量，混合攪拌、遠紅外烘干 使含水量達到標準、液壓機壓制成型、熱縮膜密封包裝即為成品。
[0115] 試驗例1
[0116] 對峙培養(yǎng)測定生防菌和病原菌之間的拮抗活性
[0117] 黑根霉(Rhizopus nigricans)RN-9,以下簡稱RN;保藏編號CGMCC N0.8436;
[0118] 解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA_2以下簡稱BA，菌種保藏編號 CGMCC 1.936〇
[0119]試驗方法:在盛有混合培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿兩側，分別接種直徑為5mm的生防真菌菌絲 塊和病原菌菌絲塊，28°C培養(yǎng)108h，并且每12h記錄菌絲生長長度?；旌吓囵B(yǎng)基配方如下： [0120]馬鈴薯200g，胰蛋白胨5g，酵母提取物2g，蔗糖15g，NaCl 2g，瓊脂18g，蒸餾水定容 至1000mL。
[0121] 實驗結果如表1-1、1-2所示：
[0122] 表1-1生防菌對茄科勞爾氏菌1號小種的抑制效果
[0124] 表1-2生防菌對茄科勞爾氏菌3號小種的抑制效果 L0126J 試驗例2
[0127] 抑制真菌菌絲生長速率法測定生防菌發(fā)酵液對病原菌菌絲的抑制活性
[0128] 試驗方法:將具有遺傳穩(wěn)定性狀的RN接種于平板TOA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h ;BA接 種于平板LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)48h，然后用內徑為5mm的打孔器在菌落邊緣打孔，再用接種 環(huán)挑取菌塊(按照 RN: B A = 1:0，0:1，1:1，1: 2，1:3，1:4，1: 5，分別標記為:RN、B A、I、II、m、 IV、V )于盛有500ml液體混合培養(yǎng)基中，28 °C，120rpm，時間為10天，然后用4層紗布過濾出 去菌絲，得發(fā)酵液。然后將發(fā)酵液濃縮10倍，將發(fā)酵液和TOA培養(yǎng)基按照體積比為1:1的比例 倒入培養(yǎng)皿中，然后將內徑為5mm的茄科勞爾氏菌1號小種和茄科勞爾氏菌3號小種接種到 以上培養(yǎng)皿中，分別標記為RN、BA、I、II、m、IV、V，28°C培養(yǎng)5天，并且每天記錄菌絲長度。
[0129] 液體混合培養(yǎng)基配方如下：
[0130]馬鈴薯200g，胰蛋白胨5g，酵母提取物2g，鹿糖15g，NaCl 2g，蒸餾水定容至 1000mL〇
[0131] 如表2-1、2-2所示:RN、BA單獨發(fā)酵比混合發(fā)酵的發(fā)酵液對病原菌的抑制作用較 弱；其中，RN發(fā)酵液的抑制作用最弱，II號發(fā)酵液對病原菌的抑制作用最強，I號發(fā)酵液次 之。但是這兩種發(fā)酵液相對于BA發(fā)酵液的抑制作用較強。
[0132] 表2-1生防菌發(fā)酵液對茄科勞爾氏菌1號小種的抑制效果
[0134]表2-2生防菌發(fā)酵液對茄科勞爾氏菌3號小種的抑制效果
[0136] 試驗例3
[0137] 盆栽試驗測定生防菌對病原菌的防治效果
[0138] 試驗方法:本實驗使用"粉紅壽豐一號"番茄種子，以滅菌沙壤土為基質，番茄種子 用體積百分比75%的酒精消毒，置30°C恒溫箱催芽移栽入盆，每盆3株，每處理4盆，一片真 葉期灌根接種，首先每棵番茄植株接種5ml發(fā)酵液，12h后接種茄科勞爾氏菌，接種時用一硬 板片插入植株四周的土中數(shù)次，以達到傷根的目的，然后每株灌2ml培養(yǎng)一周的濃度為1 X 107cf u/ml的孢子懸浮液，試驗設4個處理：
[0139] (1)只接種茄科勞爾氏菌；（2)接種RN發(fā)酵液和茄科勞爾氏菌孢子懸浮液；（3)接種 BA發(fā)酵液和茄科勞爾氏菌孢子懸浮液；（4)接種RN和BA混合發(fā)酵液(混合比例為1:1)和茄科 勞爾氏菌孢子懸浮液;溫室保持25~28°C，接種9d后調查病情，計算病情指數(shù)和相對防效。 以F0C(10 7cfU/ml)按上述方法處理，接種后每隔3d調查一次各處理的發(fā)病情況，計算病情 指數(shù)和相對防效。
[0140]實驗結果如表3-1所示:單獨用RN發(fā)酵液和BA發(fā)酵液防治的病情指數(shù)均低于混合 菌株發(fā)酵液的病情指數(shù)，且達到顯著性差異;BA防治效果好于RN，而兩種菌等比例混合發(fā)酵 液處理的病情指數(shù)在同等病原菌壓力下均低于用單一菌防治的病情指數(shù)。說明接種混合菌 對防治青枯病具有疊加效應。
[0141]表3-1生防菌對番茄青枯病病指的防治效果(15d)
[0142]
[0143] 試驗例4
[0144] 混合微生物生防有機肥對鈴薯青枯病的防治效果
[0145] 試驗方法:試驗組和對照組為15m2馬鈴薯試驗田，在播種前，對試驗田的土壤進行 處理，分別施用實施例1-3制備的混合微生物生防有機肥，即為實驗組I、實驗組n、實驗組 m，施用混合微生物生防有機肥施用量均為15〇公斤/畝，然后翻土;對照組不做處理，做三 個平行組，分別在6月、7月、8月，調查馬鈴薯病指。
[0146] 病情指數(shù)={E (各級病株數(shù)X各級嚴重度)/(調查總數(shù)X最高級別嚴重度）}X 100%
[0147] 相對防效={(對照組病情指數(shù)-實驗組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)} X 100%
[0148] 實驗結果如表4-1、4_2所示，混合微生物生防有機肥對馬鈴薯青枯病的相對防效 達到了65.2%，有效的改善土壤的理、化、生性狀，馬鈴薯產量增加約36.93%。
[0149] 表4-1混合微生物生防有機肥對馬鈴薯青枯病的田間防治效果
[0152]表4-2混合微生物生防有機肥對馬鈴薯青枯病的田間防治效果
[0154] 注:R〇, 25表示大于0.25mm水穩(wěn)性團聚體總量。
[0155] 試驗例5混合微生物生防有機肥對番茄青枯病的防治效果
[0156] 試驗組和對照組為15m2番茄試驗田，在播種前，對試驗田的土壤進行處理，分別施 用實施例1-3制備的混合微生物生防有機肥，施用量均為150公斤/畝，然后翻土，即為實驗 組I、實驗組n、實驗組m。對照組不作處理，做三個平行組。
[0157] 病情指數(shù)={E (各級病株數(shù)X各級嚴重度)/(調查總數(shù)X最高級別嚴重度）}X 100%
[0158] 相對防效={(對照組病情指數(shù)-實驗組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)} X 100%
[0159] 實驗結果如表5-1和5-2所示，使用混合微生物生防有機肥后，混合微生物生防有 機肥對番茄青枯病的相對防效達到66.67%，有效的改善土壤的理、化、生性狀，番茄產量增 加約 40.78%。
[0160] 表5-1混合微生物生防有機肥對番茄青枯病的防治效果
[0163]表5-2混合微生物生防有機肥對番茄青枯病的防治效果
[0165] 注:R〇, 25表示大于0.25mm水穩(wěn)性團聚體總量。
【主權項】
1. 一種防治青枯病的微生物有機肥，其特征在于，所述防治青枯病的微生物有機肥含 有W下重量份的原料： 解淀粉芽抱桿菌和黑根霉的有機肥發(fā)酵料 100 甲殼素 0.02~化05 尿素 7. 0~8 0 硫酸縛 0.自~1.百 Η水合鱗酸氨二鐘 5. 0~12. 0 甲基纖維素 1~5 簇甲基纖維素鋼 1~5 己基纖維素 1~曰 酵母粉 5 巧曲棒出 5。2. 根據(jù)權利要求1所述的防治青枯病的微生物有機肥，其特征在于，所述解淀粉芽抱桿 菌和黑根霉的有機肥發(fā)酵料的制備方法為： a、 將解淀粉芽抱桿菌BA-2進行培養(yǎng)，制得淀粉芽抱桿菌液體培養(yǎng)液； b、 將黑根霉RN-9進行培養(yǎng)，制得黑根霉液體培養(yǎng)液； C、將淀粉芽抱桿菌液體培養(yǎng)液和黑根霉液體培養(yǎng)液混合后接種于教皮葡萄糖培養(yǎng)基 中，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，制得菌種發(fā)酵液； d、將農家肥原料的干料粉碎后，加水，混合均勻，接種步驟C制得的菌種發(fā)酵液，混合均 勻，堆料發(fā)酵，得發(fā)酵料。3. 根據(jù)權利要求2所述的防治青枯病的微生物有機肥，其特征在于，步驟a具體為:將解 淀粉芽抱桿菌BA-2接種于LB平板培養(yǎng)基上進行平板培養(yǎng)，然后，轉接至LB液體培養(yǎng)基中，進 行搖瓶培養(yǎng)，制得淀粉芽抱桿菌液體培養(yǎng)液;所述平板培養(yǎng)的條件為35 Γ~37 Γ培養(yǎng)24h~ 36h;所述搖瓶培養(yǎng)條件為:35°C~37°C、120~14化pm條件下，培養(yǎng)4~8天。4. 根據(jù)權利要求2所述的防治青枯病的微生物有機肥，其特征在于，步驟b具體為:將黑 根霉RN-9接種于PDA平板培養(yǎng)基上進行平板培養(yǎng)，然后將黑根霉RN-9菌絲塊轉接至PDB培養(yǎng) 基中，進行搖瓶培養(yǎng)，制得黑根霉液體培養(yǎng)液;所述菌絲塊用內徑為5mm的打孔器在菌落邊 緣打孔后，用接種環(huán)挑取獲得;所述平板培養(yǎng)的條件為25 °C~30°C培養(yǎng)36h~50h;所述搖瓶 培養(yǎng)條件為:25°C~30°C、120~14化pm條件下，培養(yǎng)8~15天。5. 根據(jù)權利要求2所述的防治青枯病的微生物有機肥，其特征在于，步驟C所述發(fā)酵培 養(yǎng)條件為:在25°C~30°C、120~14化pm條件下，培養(yǎng)3~5天。6. 根據(jù)權利要求2或3所述的防治青枯病的微生物有機肥，其特征在于，步驟d具體為： 將農家肥原料的干料粉碎后，按干重的40~50wt%加水，混合均勻，然后按農家肥原料干料 的干重的2~5wt%接種步驟C制得的菌種發(fā)酵液，混合均勻，堆料發(fā)酵，制得解淀粉芽抱桿 菌BA-2和黑根霉RN-9的抱子數(shù)之和不小于0.5億/克的發(fā)酵料。7. 根據(jù)權利要求2或3所述的防治青枯病的微生物有機肥，其特征在于，步驟d中所述堆 料發(fā)酵為:將堆料堆成截面為寬1.5~2.5m、高0.8~1.2m的條形堆，每天翻堆3~4次。8. -種權利要求1-7任一項所述的防治青枯病的微生物有機肥的制備方法，包括W下 步驟： (1) 將100重量份發(fā)酵料質量、0.02~0.05重量份甲殼素、7.0~8.0重量份尿素、0.5~ 1.5重量份硫酸巧、5.0~12.0重量份Ξ水合憐酸氨二鐘和凹凸棒±5份，混合均勻； (2) 然后加入1~5重量份的甲基纖維素、1~5重量份簇甲基纖維素鋼、1~5重量份乙基 纖維素，5重量份酵母粉，攬拌混合均勻； (3) 烘干，即得。9. 根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中烘干為:遠紅外烘干65~75 °C，20~25min。10. -種防治青枯病的微生物有機肥的應用，其特征在于，對茄科勞爾氏菌的抑制作 用。
【文檔編號】C05G3/00GK105967910SQ201610519576
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】陳愛山, 陳學建
【申請人】陜西蘭迪生物技術有限公司