專利名稱：一種廣譜降解有機(jī)磷殺蟲劑的細(xì)菌復(fù)合菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用微生物降解農(nóng)藥殘留的技術(shù)，特別是一種廣譜降解土壤有機(jī)磷殺蟲劑殘留的細(xì)菌復(fù)合菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，有機(jī)磷殺蟲劑在國(guó)內(nèi)外農(nóng)業(yè)中作為主要的農(nóng)藥，得到了廣泛使用。有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides, Ops)由于具有高效和使用成本低等特點(diǎn)，使其在世界農(nóng)業(yè)中起著極其重要的作用。我國(guó)農(nóng)藥產(chǎn)品結(jié)構(gòu)仍以殺蟲劑為主，殺蟲劑的生產(chǎn)量占農(nóng)藥總產(chǎn)量70%左右，其中有機(jī)磷殺蟲劑占?xì)⑾x劑總產(chǎn)量的70%，在年產(chǎn)量萬噸以上的6個(gè)殺蟲劑品種中，有5個(gè)是有機(jī)磷殺蟲劑。有機(jī)磷殺蟲劑從分子結(jié)構(gòu)上主要分磷酸酯類(P = 0鍵)和硫代磷酸酯類(P = S鍵)兩大類，按毒性劃分，有機(jī)磷殺蟲劑又分為劇毒類(甲拌磷、對(duì)硫磷、內(nèi)吸磷等)、高毒類(甲基對(duì)硫磷、甲胺磷、氧化樂果、敵敵畏等)、中毒類(乙硫磷、敵百蟲等)和低毒類(辛硫磷、馬拉硫磷等)。由于其大多屬于中高毒性農(nóng)藥，且多具有內(nèi)吸毒性，在環(huán)境中殘留量大，一般情況下有機(jī)磷農(nóng)藥的有效利用率僅為20 30%，大部分都?xì)埩粼谕寥阑蛩w之中，水田中施用的有機(jī)磷農(nóng)藥幾乎有90%左右都?xì)埩粼谵r(nóng)田。在保護(hù)農(nóng)作物的同時(shí)，也造成環(huán)境的嚴(yán)重污染，并且已經(jīng)危及到人體健康。減少農(nóng)藥的使用是解決農(nóng)藥危害的根本出路，農(nóng)藥殘留的去除也是減少農(nóng)藥危害的有效途徑。有機(jī)磷農(nóng)藥消除方法有許多，包括物理的、化學(xué)的和生物的。傳統(tǒng)的物理方法 (包裹、焚燒和掩埋)和化學(xué)方法(包括氧化、還原和水解)成本高，可能產(chǎn)生新的污染物， 且作用相對(duì)較慢。利用生物或生物產(chǎn)品來降解污染物的生物修復(fù)方法具有無毒、無殘留、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是消除和降解高濃度農(nóng)藥殘留的一種安全、有效、廉價(jià)的方法。目前，國(guó)外許多專家學(xué)者致力于研究有機(jī)磷農(nóng)藥的生物降解技術(shù)，國(guó)內(nèi)也有許多有機(jī)磷農(nóng)藥降解技術(shù)以及降解微生物篩選方面的研究報(bào)道，例如在敵敵畏、敵百蟲、以及甲基對(duì)硫磷等常用有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物降解技術(shù)方面有較詳細(xì)的報(bào)道。對(duì)降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物研究已有幾十年的歷史，已報(bào)道的能降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物有細(xì)菌、真菌、放線菌和藻類等。例如，王善銀等分離到一株黃桿菌(Flavobacterium sp. P3-2)，該菌具有廣泛的底物適應(yīng)能力可降解對(duì)硫磷、水胺硫磷、甲基對(duì)硫磷等；王永杰等從污泥中分離篩選到1株以共代謝方式可廣譜降解有機(jī)磷農(nóng)藥的芽孢桿菌，初步鑒定為地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)。該菌對(duì)農(nóng)藥甲胺磷、敵敵畏、對(duì)硫磷的最高耐受濃度分別為3500，500，300mg/L。在30°C，100r/min 培養(yǎng)條件下，72h內(nèi)對(duì)500mg/L甲胺磷、200mg/L敵敵畏、100mg/L對(duì)硫磷的降解率分別為 75. 8%,50. 3%和 25. 4%。國(guó)內(nèi)外研究比較多的降解有機(jī)磷殺蟲劑的微生物大部分是專一性裂解P = 0鍵或 P = S鍵，僅起到降解某一類有機(jī)磷殺蟲劑的作用，降解范圍具有局限性，并且降解率較低。 除了單菌株應(yīng)用的報(bào)道外，曾有以細(xì)菌多菌株礦化對(duì)硫磷的報(bào)道，許多研究、實(shí)驗(yàn)還僅處于實(shí)驗(yàn)室階段。到目前為止，未見到有利用兩種或兩種以上細(xì)菌聯(lián)合降解土壤有機(jī)磷殺蟲劑殘留的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的是提供一種廣譜降解土壤有機(jī)磷殺蟲劑殘留的細(xì)菌復(fù)合菌劑及其制備方法，可有效解決土壤中多種有機(jī)磷殺蟲劑殘留的降解，減輕對(duì)環(huán)境的污染 ，及對(duì)人體健康危害的問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是該復(fù)合菌劑是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液以體積比0.1 3 1復(fù)合配制而成，其制備方法是將有機(jī)磷殺蟲劑污染的土壤與滅菌水以重量比1 9制成混懸液，然后再用滅菌水ICT1 10_6倍比稀釋后(即將混懸液用滅菌水稀釋10 1000000倍)，涂布于甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基平板上，25 37°C，培養(yǎng)1 3 天，其中甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基為NaC10. lg、KH2PO4O. 05g、K2HPO4O. 15g、NH3NO3O. lg、 MgSO4 · 7H20 0. Olg，瓊脂1. 5g，加蒸餾水至IOOmL, pH 5. 5 7. 5，高壓滅菌后冷卻至50°C 左右，加入甲拌磷使其終濃度為100mg/L制成；所說的滅菌水是蒸餾水經(jīng)滅菌后的水；在上述平板上挑取單菌落，通過平板劃線分離純化出兩株細(xì)菌菌株J5P2和J2,經(jīng)生理生化和16S rDNA測(cè)序鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis J5P2 (以下簡(jiǎn)稱枯草芽孢桿菌J5P2，其基因序列在GenBank上的登錄號(hào)為HM347450)和假單胞菌Pseudomonas sp. J2 (以下簡(jiǎn)稱假單胞菌J2)；再經(jīng)甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基傳代馴化，方法是，取上述J5P2和J2菌接種入甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基中，25 37°C培養(yǎng)1 3天后，再接種入質(zhì)量濃度為200mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基上，25 37°C培養(yǎng)1 3天，再接種入質(zhì)量濃度為300mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)上，25 37°C，培養(yǎng)1 3天，以此連續(xù)傳代培養(yǎng)，每次使甲拌磷質(zhì)量濃度增加100mg/L，至甲拌磷最終濃度達(dá)500mg/L為止，完成傳代馴化，傳代馴化后，將馴化后的菌株J5P2和J2分別接種于LB液體培養(yǎng)基斜面，制成斜面菌種，_4°C保存，所說的LB液體培養(yǎng)基為胰蛋白胨(Tryptone)Ig,酵母提取物(YeastExtract)O. 5g，氯化鈉(NaCl) lg，瓊脂 (Agar) 1. 5g，加蒸餾水至IOOmL制成，pH 5. 5 7. 5。取上述J5P2和J2斜面菌種在甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上活化24h 72h后，分別挑取J5P2和J2單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5000r/min離心lOmin，收集菌體，經(jīng)0. 05M PH7. 4的Tris-HCl洗滌3次，再用0. 05mol/L,pH7. 4的Tris-HCl調(diào)整菌液濃度，使其濃度為IXlOici個(gè)/mL，成種子液，將上述J5P2*J2兩種種子液以體積比0.1 3 1組配成具有廣譜降解有機(jī)磷殺蟲劑的細(xì)菌菌劑。不同含甲拌磷質(zhì)量濃度的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)鹽只是甲拌磷量的多少不同，其他組分量均是相同的。本發(fā)明的細(xì)菌菌劑用于土壤有機(jī)磷殺蟲劑殘留的降解，其優(yōu)點(diǎn)在于1.該細(xì)菌菌劑抗逆性強(qiáng)、且降解酶系豐富，降解底物范圍廣，它不僅能降解以甲拌磷、辛硫磷為代表的硫代磷酸酯類(P = S鍵)有機(jī)磷殺蟲劑，還能降解以氧化樂果為代表的磷酸酯類(P = O鍵)有機(jī)磷殺蟲劑。2.該菌劑應(yīng)用兩種細(xì)菌配比實(shí)現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，有效地提高了對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑的降解率，縮短了降解時(shí)間。對(duì)甲拌磷的降解率最高達(dá)85 %，對(duì)辛硫磷降解率最高達(dá)70 %，對(duì)氧化樂果降解率最高達(dá)83%，比單菌菌劑的降解率高出10 40%。3.該菌劑對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑污染的土壤修復(fù)效果良好，能把有毒有害的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化成能被農(nóng)作物直接吸收利用的無機(jī)磷，轉(zhuǎn)化效率高，環(huán)保效果明顯。生產(chǎn)采用通用發(fā)酵設(shè)備，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)原料易得，成本低，應(yīng)用操作方便，無污染產(chǎn)生，易于推廣應(yīng)用。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體情況對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做詳細(xì)說明。本發(fā)明在具體實(shí)施時(shí)，可由所述的枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的種子液以體 積比0.5 1或1 1或2.5 1或3 1復(fù)合配制而成，其制備方法是由以下步驟實(shí)現(xiàn)的1、將有機(jī)磷殺蟲劑污染的土壤與滅菌水以重量比為1 9混配在一起，配制成混懸液，再用滅菌水將混懸液以 ο—1 10_6倍比稀釋后，涂布于含甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L 的基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基平板上，溫度25 37°C，培養(yǎng)1 3天；2、在上述平板上挑取單菌落經(jīng)平板劃線分離純化后得到兩株細(xì)菌，經(jīng)生理生化和16S rDNA測(cè)序鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis J5P2，簡(jiǎn)稱為J5P2，和假單胞菌 Pseudomonas sp. J2，簡(jiǎn)禾爾為 J2 ；3、傳代馴化取上述J5P2和J2菌接種入甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中， 300C，培養(yǎng)2天后，再接種入含甲拌磷質(zhì)量濃度為200mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 2天后，再接種入含甲拌磷質(zhì)量濃度為300mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2天，以此， 連續(xù)傳代培養(yǎng)，每次使甲拌磷質(zhì)量濃度增加100mg/L，直至甲拌磷終濃度達(dá)500mg/L為止， 完成傳代馴化，將傳代馴化后的J5P2和J2分別接種于LB液體培養(yǎng)基平板斜面上，成斜面菌種，-4°C保存；4、種子液的制備取上述斜面菌種J5P2和J2在含甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基上活化24h 72h后，分別挑取J5P2和J2單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5000r/min離心IOmin,收集菌體，經(jīng)0. 05M ρΗ7· 4的Tris-HCL洗滌3次，再用 0. 05mol/L、pH7. 4的Tris-HCl調(diào)整菌液濃度，使其濃度為1 X IO10個(gè)/mL，成種子液；5、細(xì)菌菌劑的配制取上述J5P2和J2種子液以體積比0. 1 3 1配制成細(xì)菌菌劑。細(xì)菌菌劑的配制方法是①按4-6%接種量將不同組合接種于IOOmL以唯一碳源，含甲拌磷濃度為300mg/ L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中，同時(shí)不接菌的甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基為對(duì)照。25 370C，最好30°C，培養(yǎng)3 5天后，最好5°C，用氣相色譜測(cè)定其對(duì)甲拌磷的降解率為75%， 所說的甲拌磷基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基為NaCl 0. lg、KH2PO4O. 05g、K2HPO4O. 15g、NH3NO3O. lg、 MgSO4 ·7Η20 0. 01g，加蒸餾水至lOOmL，pH 5. 5 7. 5，再加入甲拌磷，使其甲拌磷濃度 300mg/L 制成；②按4-6%接種量將不同組合接種于IOOmL以辛硫磷質(zhì)量濃度為300mg/L為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，同時(shí)不接菌的甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基為對(duì)照。25 37°C，培養(yǎng) 3 5天后，用液相色譜測(cè)定其對(duì)辛硫磷的降解效果；③按4-6%接種量將不同組合接種于IOOmL以氧化樂果最終質(zhì)量濃度為IOOOmg/ L為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，同時(shí)不接菌的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)3 5天后，用氣相色譜測(cè)定其對(duì)氧化樂果的降解效果；
最終篩選出兩種種子液的最佳配比范圍為枯草芽孢桿菌J5P2 假單胞菌J2 = 0. 1 3 1在以有機(jī)磷農(nóng)藥為唯一碳源的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，25°C，培養(yǎng)5天，所得細(xì)菌菌劑對(duì)甲拌磷降解率為55 75%，耐受甲拌磷最高濃度為500mg/L ；對(duì)辛硫磷降解率為 60 73%，耐受辛硫磷最高濃度為500mg/L ；對(duì)氧化樂果的降解率為50 70%，耐受氧化樂果最高濃度為5000mg/L?？莶菅挎邨U菌J5P2單菌菌劑對(duì)甲拌磷、辛硫磷和氧化樂果的降解率分別為30 55%、35 55%、40 65%，假單胞菌J2單菌菌劑對(duì)甲拌磷、辛硫磷和氧化樂果的降解率分別為40 5 5%、35 60%、40 65%。實(shí)施例1本發(fā)明在具體實(shí)施時(shí)，還可采用以下步驟1、將含有有機(jī)磷殺蟲劑污染的土壤與滅菌水以重量比為1 9混配在一起，配制成混懸液，再用滅菌水將混懸液稀釋100倍后，涂布于含甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基平板上，在30°C，培養(yǎng)時(shí)間2天；2、在上述平板上挑取單菌落經(jīng)平板劃線分離純化后得到兩株細(xì)菌，經(jīng)生理生化和16S rDNA測(cè)序鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis J5P2和假單胞菌Pseudomonas sp. J2 ；3、傳代馴化取上述J5P2和J2菌接種入含甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)2天后，再接種入含甲拌磷質(zhì)量濃度為200mg/L的基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基上， 在30°C培養(yǎng)2天，再接種入含甲拌磷質(zhì)量濃度為300mg/L的基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)2天，以此，連續(xù)傳代培養(yǎng)，每次使甲拌磷質(zhì)量濃度增加100mg/L，直至甲拌磷終濃度達(dá) 500mg/L為止，完成傳代馴化，將傳代馴化后的J5P2和J2分別接種于LB液體培養(yǎng)基平板斜面上，成斜面菌種，-4°C保存；4、取上述斜面菌種J5P2和J2在含甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上活化24h 72h后，分別挑取J5P2和J2單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5000r/min離心IOmin,收集菌體，經(jīng)0. 05M ρΗ7· 4的Tris-HCL洗滌3次，再用0. 05Μ ΡΗ7. 4的Tris-HCl重新懸浮，調(diào)整菌液濃度，使其濃度為1 X IO10個(gè)/mL，成種子液，將種子液以J5P2 J2 = 3 1的體積配比配制成細(xì)菌菌劑，按4 6%接種量接種于IOOmL以甲拌磷為唯一碳源(含甲拌磷300mg/L)的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，同時(shí)不接菌的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為對(duì)照，·培養(yǎng)5天后，用氣相色譜法測(cè)得對(duì)甲拌磷的降解率為75%。實(shí)施例2以上述實(shí)例1的方法制得J5P2和J2種子液，按J5P2 J2 = 0.5 1的體積比制得細(xì)菌菌劑，將300mg/L辛硫磷水溶液均勻噴灑在200g滅菌試驗(yàn)土壤上，取20mL細(xì)菌菌劑接種于該試驗(yàn)土壤中混勻，加滅菌水調(diào)節(jié)含水量至60%的土壤濕度，將試驗(yàn)土壤置于30°C條件下培養(yǎng)，同時(shí)以不接菌的為空白對(duì)照，5天后取樣用液相色譜法測(cè)定辛硫磷殘留量，培養(yǎng)過程中加入無菌水保持60%的土壤濕度。培養(yǎng)5天，用液相色譜測(cè)得對(duì)辛硫磷的降解率為 73%。實(shí)施例3以上述方法，還可按種子液J5P2 J2=I 1或2 1的體積比制得本發(fā)明細(xì)菌菌劑。本發(fā) 明細(xì)菌菌劑經(jīng)田間多次反復(fù)試驗(yàn)，取得了非常好的技術(shù)效果，有關(guān)實(shí)驗(yàn)情況如下田間試驗(yàn)選取交通便利、易于觀察及管理、有代表性的田塊，要求田塊方正、田面平整、肥力均勻、排灌方便、種植水平與當(dāng)?shù)厣a(chǎn)水平相當(dāng)?shù)暮幽鲜∮袡C(jī)磷農(nóng)藥應(yīng)用較多的濟(jì)源市郊區(qū)小麥田。本試驗(yàn)共分兩組(1)對(duì)照組常規(guī)施肥+多次噴施氧化樂果(其濃度為500mg/L)有機(jī)磷農(nóng)藥的田地。(2)處理組河南省科學(xué)院生物有限公司生產(chǎn)的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌劑處理組(常規(guī)施肥+生物所降解菌劑+多次噴施氧化樂果(其濃度為500mg/L)有機(jī)磷農(nóng)藥的田地) 試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，處理隨機(jī)排列，小區(qū)面積不小于60平方米。以實(shí)施例1同樣的方法，按J5P2 J2 = 1 1的體積比制得細(xì)菌菌劑，按200mL/ m2的劑量噴灑于處理組土壤表面，分別在使用菌劑0、3、5、7、10天后取樣，每小區(qū)按“S”形方法采取土樣送檢。檢測(cè)土樣有機(jī)磷農(nóng)藥氧化樂果殘留量和無機(jī)磷(有效磷)含量變化。有機(jī)磷農(nóng)藥氧化樂果殘留量結(jié)果如表1所示，在使用菌劑5天后氧化樂果基本降解完全，比對(duì)照組提前了 2 3天。由表2可知，施用菌劑的處理組比沒施用菌劑的對(duì)照組 (即自然降解組)在施用菌劑后10天內(nèi)土壤中無機(jī)磷(有效磷)含量有顯著增加，并且在 5 7天無機(jī)磷轉(zhuǎn)化效率較高。表1氧化樂果殘留量(mg/Kg)
權(quán)利要求
1.一種廣譜降解有機(jī)磷殺蟲劑的細(xì)菌復(fù)合菌劑，其特征在于，該復(fù)合菌劑是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液以體積比0.1 3 1復(fù)合配制而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣譜降解有機(jī)磷殺蟲劑的細(xì)菌復(fù)合菌劑，其特征在于，是由所述的枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液以體積比0.5 1，或1 1，或2.5 1，或 3 1復(fù)合配制而成。
3.權(quán)利要求1或2所述的廣譜降解有機(jī)磷殺蟲劑的細(xì)菌復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在于，將有機(jī)磷殺蟲劑污染的土壤與滅菌水以重量比1 9制成混懸液，然后再用滅菌水KT1 10_6倍比稀釋后，涂布于甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基平板上，25 37°C，培養(yǎng)1 3 天，其中甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基為=NaCl 0. lg、KH2PO4O. 05g、K2HPO4O. 15g、NH3NO3O. lg、 MgSO4 · 7H20 0. Olg,瓊脂1. 5g，加蒸餾水至IOOmL, pH 5. 5 7. 5，高壓滅菌后冷卻至50°C， 加入甲拌磷使其終濃度為100mg/L制成，所說的滅菌水是蒸餾水經(jīng)滅菌后的水；在上述平板上挑取單菌落，通過平板劃線分離純化出兩株細(xì)菌菌株，經(jīng)生理生化和16S rDNA測(cè)序鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis J5I32和假單胞菌I^seudomonas sp. J2;再經(jīng)甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基傳代馴化，方法是，取上述J5P2和J2菌接種入甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基中， 25 37°C培養(yǎng)1 3天后，再接種入質(zhì)量濃度為200mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基上， 25 37°C培養(yǎng)1 3天，再接種入質(zhì)量濃度為300mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)上，25 37°C，培養(yǎng)1 3天，以此連續(xù)傳代培養(yǎng)，每次使甲拌磷質(zhì)量濃度增加100mg/L，至甲拌磷最終濃度達(dá)500mg/L為止，完成傳代馴化，傳代馴化后，將馴化后的菌株J5P2和J2分別接種于LB培養(yǎng)基斜面，制成斜面菌種，-4°C保存，所說的LB培養(yǎng)基為胰蛋白胨lg，酵母提取物 0. 5g，氯化鈉lg，瓊脂1. 5g，加蒸餾水至IOOmL制成，pH 5. 5 7. 5，取上述J5P2和J2斜面菌種在甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上活化24h 7 后，分別挑取 J5P2和J2單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5000r/min離心lOmin，收集菌體，經(jīng) 0. 05mol/L、pH7. 4 的 iTris-HCl 洗滌 3 次，再用 0. 05mol/L、pH7. 4 的 iTris-HCl 調(diào)整菌液濃度，使其濃度為1 X 101°個(gè)/mL士0. 5%，成種子液，將上述J5P2和J2兩種種子液以體積比0.1 3 1組配成具有廣譜降解有機(jī)磷殺蟲劑的細(xì)菌菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述廣譜降解有機(jī)磷殺蟲劑的細(xì)菌復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)、將含有有機(jī)磷殺蟲劑污染的土壤與滅菌水以重量比為1 9混配在一起，配制成混懸液，再用滅菌水將混懸液稀釋100倍后，涂布于含甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基平板上，在30°C，培養(yǎng)時(shí)間2天；(2)、在上述平板上挑取單菌落經(jīng)平板劃線分離純化后得到兩株細(xì)菌，經(jīng)生理生化和 16S rDNA測(cè)序鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis J5P2和假單胞菌Pseudomonas sp. J2 ；(3)、傳代馴化取上述J5P2和J2菌接種入含甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)2天后，再接種入含甲拌磷質(zhì)量濃度為200mg/L 的基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基上， 在30°C培養(yǎng)2天，再接種入含甲拌磷質(zhì)量濃度為300mg/L的基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)2天，以此，連續(xù)傳代培養(yǎng)，每次使甲拌磷質(zhì)量濃度增加100mg/L，直至甲拌磷終濃度達(dá) 500mg/L為止，完成傳代馴化，將傳代馴化后的J5P2和J2分別接種于LB液體培養(yǎng)基平板斜面上，成斜面菌種，-4°C保存；(4)、取上述斜面菌種J5P2和J2在含甲拌磷質(zhì)量濃度為100mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基上活化24h 7 后，分別挑取J5P2和J2單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5000r/min離心IOmin,收集菌體，經(jīng)0. 05M ρΗ7· 4的Tris-HCL洗滌3次，再用 0. 05mol/L, pH7. 4的Tris-HCl調(diào)整菌液濃度，使其濃度為1 X 101°個(gè)/mL，成種子液，將種子液以J5P2 J2 = 3 1的體積配比配制成細(xì)菌菌劑，按4 6%接種量接種于IOOmL以唯一碳源含甲拌磷300mg/L的甲拌磷基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中，同時(shí)不接菌的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)5天后，用氣相色譜法測(cè)得對(duì)甲拌磷的降解率為75%，所說的甲拌磷基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基為 NaCl 0. lg、KH2PO4O. 05g、K2HPO4O. 15g、NH3NO3O. lg、MgSO4 · 7H20 0. Olg，加蒸餾水至 IOOmL, pH 5. 5 7. 5，再加入甲拌磷，使其甲拌磷濃度300mg/L制成。
全文摘要
本發(fā)明涉及廣譜降解土壤有機(jī)磷殺蟲劑殘留的細(xì)菌復(fù)合菌劑及其制備方法，可有效解決土壤中多種有機(jī)磷殺蟲劑殘留的降解，減輕對(duì)環(huán)境的污染，及對(duì)人體健康危害的問題，該復(fù)合菌劑是由枯草芽孢桿菌J5P2和假單胞菌J2的菌液以體積比復(fù)合而成，其制備方法是將有機(jī)磷殺蟲劑污染的土壤與滅菌水制成混懸液，經(jīng)稀釋后，涂布于平板上培養(yǎng)，挑取單菌落，通過平板劃線分離純化出兩株細(xì)菌菌株J5P2和J2，再經(jīng)甲拌磷基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基傳代馴化并制成種子液，將兩種種子液混配在一起，成廣譜降解土壤有機(jī)磷殺蟲劑殘留的細(xì)菌復(fù)合菌劑，有效用于土壤有機(jī)磷殺蟲劑殘留的降解，土壤修復(fù)效果良好，成本低，環(huán)保，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益巨大。
文檔編號(hào)A62D101/04GK102154103SQ20101060326
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者劉瑩瑩, 李冠杰, 王繼雯, 甄靜, 謝寶恩 申請(qǐng)人:河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司