專利名稱：藍(lán)萼甲素在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藍(lán)萼甲素的應(yīng)用，特別涉及藍(lán)萼甲素在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血栓可發(fā)生于循環(huán)系統(tǒng)的各個部位，如靜脈、動脈、心腔和微循環(huán)，其是由纖維蛋白和血細(xì)胞組成的。在血栓形成過程中，血小板活化與凝血系統(tǒng)激活具有重要作用，兩者在體內(nèi)緊密聯(lián)系，凝血系統(tǒng)激活后產(chǎn)生的凝血酶，是一個強(qiáng)有力的血小板活化因子，血小板活化后又將促進(jìn)凝血過程。抗栓治療主要針對凝血系統(tǒng)和血小板兩個環(huán)節(jié)，分別稱為抗凝治療和抗血小板治療。目前臨床上最常使用的抗凝藥物主要包括肝素類、香豆素類等，這些藥物的臨床價(jià)值已得到許多大型臨床試驗(yàn)的證實(shí)而廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。藍(lán)萼甲素(glaucocalyxin A)是從唇科香茶菜屬植物香茶菜〔Isodonjaponica (Burrm F) Hara var glaucocalyx (Maxim) Hara〕中提取分離出的一個二職化合物。現(xiàn)代藥理研究表明，藍(lán)萼甲素可以通過抗血小板作用起到保護(hù)心肌作用，如可抑制卡西霉素刺激的兔血小板生成血小板活化因子，能抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的兔血小板血栓素A2生成，并同時(shí)升高前列腺素E2，能顯著抑制ADP、AA和PAF等誘導(dǎo)的兔血小板聚集，顯著升高血小板內(nèi)cAMP水平，能增加機(jī)體對86Rb的吸收，而且有改善微循環(huán)作用。但藍(lán)萼甲素是否具有抗凝血作用，未見報(bào)道，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該藥具有抗凝血活性。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明提供藍(lán)萼甲素的新的應(yīng)用，即藍(lán)萼甲素在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用技術(shù)方案藍(lán)萼甲素在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用有益效果I、人體內(nèi)凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，過度凝血會導(dǎo)致心肌梗死、腦血栓等嚴(yán)重疾病。血液凝固需要有內(nèi)源性和外源性兩條凝血途徑同時(shí)參與。APTT和PT是臨床凝血功能檢測中最常用的兩個參數(shù)。其中APTT主要用于檢測機(jī)體的內(nèi)源性凝血系統(tǒng)，其延長或縮短分別反映凝血因子II、V、VIII、X、XI和VII的血漿活性降低或增加。PT則檢測機(jī)體的外源性凝血系統(tǒng)，其延長或縮短分別反映凝血因子I、II、V、VII和X的血漿活性降低或增加。本發(fā)明的研究結(jié)果顯示，藍(lán)萼甲素能顯著延長小鼠毛細(xì)管凝血時(shí)間和尾尖出血時(shí)間，并顯著延長小鼠TT、PT、APTT和PRT。藍(lán)萼甲素在體外顯著延長家兔TT、APTT和PRT。體內(nèi)給藥抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)萼甲素能顯著延長小鼠APTT和PRT，提示其能通過干擾內(nèi)源性凝血因子活性，使纖維蛋白的生成受到抑制，TT的顯著延長，顯示纖維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)變受到了抑制。體內(nèi)給藥抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，藍(lán)萼甲素也能顯著延長PT時(shí)間，說明其對外源性凝血途徑也有一定的抑制作用。藍(lán)萼甲素的家兔體外抗凝血作用結(jié)果顯示，藍(lán)萼甲素能延長APTT、TT和PRT，但對PT無顯著作用，表明藍(lán)萼甲素在體外主要是通過抑制內(nèi)源性凝血途徑產(chǎn)生抗凝血作用的。
具體實(shí)施例方式I材料與儀器I. I藥品與試劑藍(lán)萼甲素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)彡98%,HPLC)蘇州利元醫(yī)藥科技有限公司提供，動物給藥用
0.5% CMC-Na配制，體外實(shí)驗(yàn)用DMSO助溶，反應(yīng)體系中DMSO終濃度為0. I %。阿司匹林腸溶片(批號H32026500)，南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司，動物給藥用0.5% CMC-Na配制。肝素(150U/mg，批號091123)，南京圖賽生物科技有限公司，用蒸餾水配制。凝血酶原時(shí)間(PT)試劑盒(編號YZB/滬0556-40-2009)、活化部分凝血激酶時(shí)間(APTT)試劑盒(編號YZB/滬0555-40-2009)和凝血酶時(shí)間(TT)試劑盒(編號YZB/滬0558-40-2009)，上海太 陽生物制品有限公司。I. 2 動物家兔，體重2. 5kg，南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證SCXK (蘇)2007-0008 ； ICR小鼠，體重18 22g，揚(yáng)州大學(xué)動物繁殖中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證SCXK (蘇)2007-0001。2 方法2. I對小鼠凝血時(shí)間(CT)的影響取雄性ICR小鼠，選基礎(chǔ)生理凝血時(shí)間在40 160s者用于實(shí)驗(yàn)，根據(jù)基礎(chǔ)凝血時(shí)間隨機(jī)分為5組，每組10只，正常對照組按0. lml/10g灌胃生理鹽水，其余各組均按等體積灌胃相應(yīng)的藥液，分別給藍(lán)萼甲素低劑量4mg/kg、中劑量8mg/kg、高劑量16mg/kg和阿司匹林50mg/kg,每天給藥I次,連續(xù)給藥7d。小鼠于末次給藥前禁食不禁水12h,于末次給藥后Ih按毛細(xì)管法測小鼠凝血時(shí)間(末次給藥后Ih,用長10cm、內(nèi)徑Imm的玻璃毛細(xì)管插入小鼠眼內(nèi)眥后靜脈叢中，深約4 5mm，輕輕轉(zhuǎn)動，自血液注滿開始計(jì)時(shí)，取出毛細(xì)管平放于桌上，每隔約15s折斷一端約0. 5cm，并緩慢向左右拉開，觀察折斷處出現(xiàn)凝血絲所需時(shí)間)。2. 2對小鼠尾出血時(shí)間的影響雄性ICR小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，給藥方法和劑量同2. I。各組動物禁食12h，然后分別給藥I次。于灌胃后57 59min，將小鼠置于固定器中，使其尾部垂直，至灌胃后第60min，在尾尖處剪斷鼠尾，每隔30s用濾紙輕吸尾尖血液，直至吸不出血液，記錄斷尾至出血停止時(shí)間間隔，即為出血時(shí)間。2. 3對小鼠凝血功能的影響2. 3. I對小鼠凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血激酶時(shí)間(APTT)的影響雄性ICR小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，給藥方法和劑量同2. I。動物每天給藥I次，連續(xù)給藥7d。小鼠末次給藥前禁食不禁水12h，于末次給藥Ih后摘眼球取血，取血約0. 9ml，加入裝有0. ImL 3. 8%枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中，混勻，3000r/m離心15min，得貧血小板血衆(zhòng)(platelet poor plasma, PPP),置冰浴中備用。用凝固比池法測定TT、PT和APTT。2. 3. 2對血漿復(fù)鈣時(shí)間(PRT)的影響
雄性ICR小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，給藥方法、劑量、周期及取血方法同2. 3. I,血液與抗凝劑混勻后1000r/min離心IOmin,得富血小板血衆(zhòng)(platelet richplasma，PRP)，置冰浴中備用。酶標(biāo)板置37°C水面上，每孔加入混合血漿IOOy L，溫育lmin，迅速加入37°C預(yù)溫0. 025mol/L氯化鈣溶液100 y L立即混勻，加氯化鈣時(shí)開動秒表，每隔IOs以鋼絲輕輕向上挑動，至生成固體細(xì)絲即纖維蛋白終止計(jì)時(shí)，重復(fù)以上操作2次，自加鈣至纖維蛋白形成的時(shí)間即為PRT[9]。2. 4藍(lán)萼甲素對家兔體外凝血的影響2. 4. I藍(lán)萼甲素對家兔體外凝血酶時(shí)間(TT)影響雄性家兔耳正中動脈取血3. 6mL，迅速加入裝有0. 4mL 3. 8%枸櫞酸鈉的離心管中，混勻，3000r/min離心lOmin，得貧血小板血漿，置冰浴中備用。依試劑盒方法，酶標(biāo)板置37°C水面上，每孔先加入待測血漿50 y L，再分別加入藍(lán)萼甲素低、中、高濃度溶液(終濃度分別為0. 2、0. 4和0. 8mmol/L,用DMSO助溶)及肝素溶液(終濃度為50U/mL)各50 y L，混勻，溫育lmin，迅速加入37°C預(yù)溫的凝血酶溶液100 y L，立即混勻，加酶時(shí)開動秒表，4s后，每隔2s向上挑動，至生成固體細(xì)絲終止計(jì)時(shí)。重復(fù)以上操作3次，取平均值，即為凝血酶時(shí)間，另以等量終濃度為0. 1% DMSO代替待測樣品為對照。2. 4. 2凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血激酶時(shí)間(APTT)的測定血漿制備及加藥處理同2. 4. 1，依試劑盒說明書的方法，測定凝血酶原時(shí)間和活化部分凝血激酶時(shí)間。2. 4. 3血漿復(fù)鈣時(shí)間(PRT)的測定取血及加抗凝劑方法同2. 4. I,血液與抗凝劑混勻后1000r/min離心IOmin,得富血小板血漿，置冰浴中備用。酶標(biāo)板置37°C水面上，每孔加入混合血漿50 u L,分組及加藥方法同2. 4. I，加藥后混勻，溫育lmin，迅速加入37°C預(yù)溫0. 025mol/L氯化鈣溶液100 y L立即混勻，加氯化鈣時(shí)開動秒表，Imin后每隔IOs以鋼絲輕輕向上挑動，至生成固體細(xì)絲即纖維蛋白終止計(jì)時(shí)，重復(fù)以上操作2次，自加鈣至纖維蛋白形成的時(shí)間即為血漿復(fù)鈣時(shí)間。2. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(Mean土SD)表示，采用單向方差分析法(ANOVA)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P < 0. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果3. I對小鼠凝血時(shí)間(CT)的影響結(jié)果見表1，與空白組比較，藍(lán)萼甲素劑量依賴性延長小鼠凝血時(shí)間，在劑量為4、8和16mg/kg時(shí)均有顯著性差異。與空白組比較,阿司匹林50mg/kg顯著延長小鼠凝血時(shí)間。表I藍(lán)萼甲素對小鼠凝血時(shí)間(CT)的影響(Mean土SD，n = 10)
權(quán)利要求
1.藍(lán)萼甲素在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及藍(lán)萼甲素的應(yīng)用，特別涉及藍(lán)萼甲素在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用。藍(lán)萼甲素能顯著延長小鼠毛細(xì)管凝血時(shí)間和尾尖出血時(shí)間，并顯著延長小鼠凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血激酶時(shí)間(APTT)和血漿復(fù)鈣時(shí)間(PRT)。藍(lán)萼甲素在體外顯著延長家兔TT、APTT和PRT。體內(nèi)給藥抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)萼甲素能顯著延長小鼠APTT和PRT，提示其能通過干擾內(nèi)源性凝血因子活性，使纖維蛋白的生成受到抑制，TT的顯著延長，顯示纖維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)變受到了抑制。體內(nèi)給藥抗凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，藍(lán)萼甲素也能顯著延長PT時(shí)間，說明其對外源性凝血途徑也有一定的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藍(lán)萼甲素能延長APTT、TT和PRT，但對PT無顯著作用，表明藍(lán)萼甲素在體外主要是通過抑制內(nèi)源性凝血途徑產(chǎn)生抗凝血作用的。
文檔編號A61P7/02GK102641259SQ20111004140
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月21日
發(fā)明者傅強(qiáng), 張陸勇, 李偉光, 王曉虎, 王蕾, 馬世平, 馬占強(qiáng) 申請人:中國藥科大學(xué)