專利名稱：營養(yǎng)缺陷型重組體巴斯德bcg菌株及其在抗寄生蟲導致的人體感染中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種表達曼氏血吸蟲Sml4抗原的卡介苗(BCG)牛結核桿菌的重組體疫苗菌株。本發(fā)明的疫苗菌株是用來控制由寄生蟲，特別是曼氏血吸蟲所引起的感染。該疫苗的疫苗菌株是一種由巴斯德BCG亞-菌株的遺傳修飾獲得的亮氨酸補體致活的營養(yǎng)缺陷型菌株。
背景技術：
估計至少200百萬人受到影響人類五類血吸蟲之一的感染。此外，有另外600 百萬處于受到這種寄生蟲影響的危險之中。采用抗-驅蟲藥吡喹酮的化學治療是主要的防治方法，然而，這種再-感染率很高 [Al-Sherbiny M, Osman A, Barakat R, El Morshedy H, Bergquist R & Olds R (2003). 在體外試驗中對曼氏血吸蟲疫苗試驗抗原的細胞和體液反應，Acta Trop. 88: 117-130; 和 Capron A, Riveau GJ, Bartley PB & McManus DP (2002).血吸蟲疫苗的前景。Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord. 2: 281—290]。因此，開發(fā)與適當?shù)幕瘜W治療聯(lián)合使用的有效疫苗能夠代表一種有效的長期控制策略[Pearce EJ (2003) 用于血吸蟲病的疫苗方面的進展，Acta Trop. 86: 309-313;和Bergquist NR (2002)血吸蟲病從危險性評估到控制，寄生蟲學趨勢.18: 309-314.]。世界衛(wèi)生組織(WHO)從S.血吸蟲(Sh 28-GST)選擇出曼氏血吸蟲脂肪酸-結合蛋白14 (Sm 14)和觀-kDa谷胱甘肽S-轉移酶，作為用于人體臨床試驗即用于抗-血吸蟲疫苗應試者的主要靶分子[Bergquist, 2004, 2，http://who. int/tdr/publication/ tdrnews/news71/schisto. html) ；BergquistR, Al-Sherbiny M, Barakat R & Olds R. (2002)用于血吸蟲病疫苗開發(fā)的藍圖，Acta Trop. 82: 183-192;和Bergquist NR (1998) 血吸蟲病疫苗開發(fā)進展和前景，Mem Inst Oswaldo Cruz. 93 Suppl 1: 95-101.]。所述Sml4抗原的選擇基于大腸桿菌中的觀察，誘導針對曼氏血吸蟲(35到 60%)和肝片吸蟲保護性免疫的重組體Sml4蛋白的試驗，通過在嚙齒類模型刺激的蠕蟲 UlW^y^M'^. [Vilar, Μ. M. ； Barrientos, F; Almeida, Μ; Garrat, R; Tendler, M，一種與r-Sml4肽對抗血吸蟲病和肝片吸蟲病的試驗性二價肽疫苗，Vaccine，v. 22， p. 137-144， 2003 和 Tendler Μ, Brito CA, Vilar MM, Serra-Freire N, Diogo CM, Almeida MS,等(1996)曼氏血吸蟲脂肪酸-結合蛋白Sml4，是一種雙重目標抗-寄生蟲疫苗的潛在基礎，Proc Natl Acad Sci USA. 93: 269-273.]以及在羊身上使用曼氏血吸蟲定義的重組體抗原Sm 14接種對抗肝片吸蟲傳染[Almeida MS, Torloni H, Lee-Ho P, Vilar MM, Thaumaturgo N, Simpson AJ & Tendler M 0003)，寄生蟲免疫.25: 135-137]。此外，所述Sml4的保護性致免疫效力已經(jīng)在一種DNA疫苗的上下文指引下對這種蛋白進行編碼基因時 Nascimento E, Le&o IC, Pereira VR, Gomes YM, ChikhlikarP, August T等Q002)單和多-抗原DNA疫苗對抗血吸蟲病的保護性免疫。Mem Inst Oswaldo Cruz. 97 Suppl 1: 105-109]或者經(jīng)由活的-減毒的重組細菌(如沙門氏菌) 變種時被證實[鼠傷寒(Pacheco LG, Zucconi E, Mati VL, Garcia RM, Miyoshi A, Oliveira SC,等，Q005) 口服表達14_kDa曼氏血吸蟲脂肪酸-結合蛋白的活Aro減毒沙門氏菌疫苗株誘導部分對抗試驗性血吸蟲病的保護，Acta Trop. 95: 132-142.]或者如從全世界使用的一種對抗肺結核疫苗-牛結核桿菌(Bacille Calmette Guerin)的BCG 菌株轉化獲得的BCG重組體[Varaldo PB, Leite LC, Dias WO, Miyaji EN, Torres FI, Gebara VC,等Q004)重組體牛結核桿菌BCG表達曼氏血吸蟲的Sml4抗原保護小鼠來自搖尾幼蟲的刺激。Infect Immun. 72: 3336-3343 禾口 Varaldo，P. B. , Leite, L. c. c., Dias, W. 0. , Miyaj, Ε. N. , Armoa, G. R. G. , Campos, Α. S. , Vilar, Μ. Μ. , McFadden, J.，Almeida, Μ. S.，Tendler, M 和 Mcintosh, D. (2006)的結核分枝桿菌密碼子優(yōu)化在牛結核桿菌Bacille Calmette _Gu6rin中曼氏血吸蟲重組體的Sml4基因的基因編碼來增強蛋白表達而不是保護小鼠對抗搖尾幼蟲的刺激，F(xiàn)EMS醫(yī)學微生物學和免疫學，48， 132-139.]。很多優(yōu)點與利用rBCG作為異源性抗原呈遞系統(tǒng)相關[Ohara N和Yamada T (2001)重組BCG疫苗.疫苗.19: 4089-4098.]。在這篇文章中，Varaldo等(2004)已經(jīng)在先報道了用單劑量的arBCG菌株表達Sml4在與偶發(fā)分枝桿菌(rBCG/PL73-Sml4)的 β-內(nèi)酰胺酶融合的免疫與對抗曼氏血吸蟲尾蚴的刺激保護比較相當于獲得使用三個劑量的rSml4 (Varaldo等，2004)。與使用同樣的或相似的表達載體的其它抗原的記錄相比， 從這種結構獲得的全部Sml4表達水平是比較低的(Mederle I，Bourguin I，Ensergueix D, Badell E, Moniz-Pereira J, Gicquel B & Winter N ( 2002) Plasmidic 對抗牛結核桿菌BCG中異源基因的插入克隆影響在體內(nèi)抗原的持久性和免疫反應。Infect Immun. 70: 303-314.]。然而，應該指出的是，還沒有關于rBCG菌株引起保護性免疫所需要的抗原生產(chǎn)的最低水平達到共識，但是低水平抗原表達一直被認為是代表一種潛在的限制因素 (Kanekiyo Mj Matsuo K，Hamatake Mj Hamano Tj Ohsu Tj Matsumoto S，等，(2005) 結核分枝桿菌密碼子優(yōu)化增強了重組體牛結核桿菌卡介苗表達類型IGag人類免疫缺陷性病毒中的抗原表達和病毒-特異性免疫應答。J Virol. 79: 8716-8723;和Kawahara M， Matsuo K, Nakasone T, Hiroi T, Kiyono H, Matsumoto S,等(2002) ^^MMlP^l /M 皮內(nèi)接種重組體牛結核桿菌卡介苗(BCG)誘導對抗插入HIV -1V3抗原免疫的反應增強， Vaccine. 21: 158-16 。為了解決這個問題，有人提出兩個新的能提高所述目標抗原表達水平的rBCG結構[碩士論文題為構建M.?？ń槊缰亟MSml4r及其在小鼠模型中評估對抗血吸蟲病能力， A. P. C. Argondizzo in 2005, in Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brasil)。 這些結構提供了二個質粒載體，PUS 977和pAU 5。所述pAU 5媒介物是在一篇碩士論文中提出的，該論文題為牛分枝桿菌卡介苗中的結構和功能的重組雙功能質粒載體(大腸桿菌-分枝桿菌)的穩(wěn)定性評價，J. p. S Santos in 2002， Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, oriented by Dr. Douglas Mcintosh, visiting researcher of FIOCRUZ 禾口 Prof. Walter Martim R. Oelemannj teacher at Universidade Federal de Rio de Janeiro。所述pAU 5媒介物是一禾中在所述
4質粒 pUS 973 上的變異[Medeiros, M.，Dellagostin, 0. A. , Armoa, G. R. G, Degrave, W. M.，Mendonpa-Lima, L.，Lopes, Μ. Q.，Costa, J. F.，McFadden, J. G. Μ. B.，禾口 Mcintosh, D. (2002)牝牛分枝桿菌作為用于結核分枝桿菌因子研究中克隆宿主的代用品的對比評估。Microbiology 148，1999-2009]。其中首創(chuàng)這種質粒(pAU5)與pUS973相比表現(xiàn)出增強的穩(wěn)定性。所述增強的穩(wěn)定性歸功于啟動子區(qū)域的上游在與失去第一個堿基對的hsp60啟動子序列結合四個堿基對的一種立刻缺失。兩個獨立的實驗中證實了這些rBCG結構給予Swiss小鼠對抗曼氏血吸蟲的搖尾幼蟲的刺激保護的能力[碩士學位論文A.P.C. Argondizzo in 2005]。在這項研究中，有人觀察到Sml4表達水平的提高(與由PL73-Sml4在rBCG結構轉化伴隨著pAU5媒介物的情況下得到的相比約大于32倍)，當與rBCG/PL73-Sml4結構的那些記錄相比沒有導致保護水平的提高。此外，重要的是要注意到按照重組體Sml4蛋白的亞-細胞的位置， rBCG/pAU5-Sml4 和 rBCGr/pUS977_Sml4 菌株也與 rBCG/PL73_Sml4 菌株不同。具體地，對于 rBCG-/pAU5-Sml4的情況中蛋白是在所述細菌的細胞質內(nèi)產(chǎn)生而不是像rBCG-/PL73_Sml4 的情況那樣是以膜相關融合附加物的形式。總的來看，這些數(shù)據(jù)支持這一假設rBCGr細胞質中產(chǎn)生的重組體Sml4，其表達由存在于pAU5-Sml4結構中被修飾的hsp60啟動子驅動，具有作為預防對抗血吸蟲病手段的潛力(rBCG/pAU5-Sml4)。
所有質粒結構發(fā)展至此是基于核外染色體，環(huán)狀質粒DNA分子所包含對氨基糖苷抗菌素卡那霉素的基因編碼抗性。存在于這些結構內(nèi)的卡那霉素基因提供了一種積極的手段 在質粒進入BCG的引入之后選擇轉化的細菌(轉化體)。該基因的一個次要功能是細菌在包含卡那霉素的液體培養(yǎng)生長過程中保證質粒的穩(wěn)定性，用于生產(chǎn)試驗性的疫苗。然而，在體內(nèi)抗生素的抗藥性編碼基因的存在并不提供對于質粒穩(wěn)定性的選擇。 此外，將重組體BCG攜帶含有對菌素抵抗的編碼序列的質粒用于人類接種疫苗帶來了安全問題關注(Burlein JE, Stover CK, Offcut S & Hanson, Μ. S. (1994)分枝桿菌中外源基因的表達，Washington DC: ASM Press.].
顯然，開發(fā)更穩(wěn)定的用于在不攜帶抗生素抗性標志的BCG中異源性抗原表達的質粒載體是所期望的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種表達曼氏血吸蟲Sml4抗原的BCG牛結核桿菌的重組體疫苗菌株。 本發(fā)明的疫苗菌株是用來控制由寄生蟲，特別是曼氏血吸蟲所引起的感染。該疫苗的疫苗菌株是一種由巴斯德BCG亞-菌株的遺傳修飾獲得的亮氨酸補體致活的營養(yǎng)缺陷型菌株。


圖1是一個互補載體pUP410的發(fā)展的示意圖2顯示了利用pAU5-Sml4結構作為DNA模板擴增的表達盒hsp60*-Sml4的PCR結果。
具體實施例方式本發(fā)明涉及使用BCGA IeuD菌株和互補的媒介物pUP410獲得一種用于控制曼氏血吸蟲和相關寄生蟲引起的感染的疫苗菌株，其基于曼氏血吸蟲的Sml4在體內(nèi)的表達。本發(fā)明的主要的目的可以通過這種Sml4抗原在BCG利用營養(yǎng)缺陷型互補作為選擇性標記的表達系統(tǒng)的結構完成。本發(fā)明中使用的表達系統(tǒng)是由Johnjoe Mcfadden博士， 生物科學學院，Surrey大學，UK和Odir Dellagostin博士，生物科技中心，Pelotas聯(lián)合大學，巴西構成的群體，對題為用于拉丁美洲反芻動物的主要寄生和流行性病的重組體BCG 多疫苗和互補診斷的發(fā)展的研究項目中開發(fā)的。該使用營養(yǎng)缺陷型互補的BCG體系的組成和特點是一種營養(yǎng)缺陷型巴斯德BCG 菌株，所述營養(yǎng)缺陷型是有關氨基酸亮氨酸(BCG(IeuD)和一種質粒載體家族編碼的IeuD 序列的產(chǎn)物，這些IeuD序列同樣地能夠補充所述BCG的營養(yǎng)缺陷型到亮氨酸。這種營養(yǎng)缺陷型BCG菌株不能生長在缺乏亮氨酸的媒介中，其通過所述LeuD序列的基因置換獲得，存在于巴斯德BCG基因組內(nèi)，使用這種方法的報道者是Parish，Τ. & and Stoker, N. G. (2000)[使用一種柔性盒的方法經(jīng)過基因置換產(chǎn)生一種雙無標記結核分枝桿菌 tlyA ρIcABC突變株，微生物學.146: 1969-1975]。所述互補媒介物源自于媒介物pUS77 [Medeiros, Μ. , Dellagostin, 0. Α. , Armoa, G. R. G. , Degrave, W. Μ, Mendonpa-Lima, L.， Lopes, Μ. Q.， Costa, J. F.，McFadden, J. G. Μ. B.，禾口 Mcintosh, D. (2002)牛匕牛分枝桿菌作為用于結核分枝桿菌因子研究中克隆宿主的代用品的對比評估，微生物學 148，1999-2009]并且包含作為營養(yǎng)缺乏(營養(yǎng)缺陷型)和作為選擇性標記的互補的LeuD 基因，由PAN啟動子驅動其表達。此外，這些媒介物具有獨特的限制性核酸內(nèi)切酶中心，允許抗原表達盒進入媒介物的克隆以及具有一種卡那霉素抗性基因，這是在大腸桿菌選定區(qū)域必需的，其可以通過限制性內(nèi)切酶消化在BCG轉化前的重新-連接后更進一步地除去。 亮氨酸的缺少無論在體外生長培養(yǎng)基(Middlebrooke生長培養(yǎng)基7H9液體培養(yǎng)基或7H10 瓊脂)還是在體內(nèi)都提供了恒定的選擇壓力，這種壓力迫使rBCG保持這種互補質粒。用于生產(chǎn)這種BCGAleuD菌株和一系列互補媒介物的具體方法描述于Borsuk，S.，等，營養(yǎng)缺陷型互補作為選擇性標記用于牛結核桿菌BCG，結核病中外原抗原的穩(wěn)定的表達，Vol. 87， 期刊6，pp 474-480，在線發(fā)表于2007年九月M日。這種源自互補媒介物家族的互補媒介物PUP410形成過程中的步驟顯示于圖1。如圖1所示，獲得所述pUP410媒介物的步驟如下
-利用引物IeuDI通過PCR獲得IeuD基因編碼序列(5'_AAT CTA GAA CAG CTA GGG GAT C-3' - SEQ ID N0:1)、IeuDII (5'TCC TGCA GTT CTA CGC CTC A_3' - SEQ ID NO:2) 和牛結核桿菌BCG P3 (Isogen) DNA作為模板；
-采用酶XbaI和PstI消化擴增片段(617bp)；以及 -隨后克隆源自稱為pUP400的載體的pUS977質粒(Medeiros等，2002)。通過用KpnI酶消化從PG0AL19媒介物中獲得hyg R基因(1575bp) [Parish, T & Stoker，N. G (2000)，使用柔性盒經(jīng)過基因置換產(chǎn)生一種雙無標記結核分枝桿菌tlyA PlcABC突變株的方法，微生物學，146: 1969-1975]并且與用同樣的酶消化pU400媒介物相連。這個過程在PU401媒介物中產(chǎn)生結果。通過用HindIII消化移去卡那霉素抗性基因后重新-連接，一個攜帶HindIII位點的適配器結束同時合成I^acI。1微克的Adap F (5'GAT ATC AAG CTT AAG ACG CGT TAA3')和 Adap R (5'TAA CGC GTC TTA AGC TTG ATA TCT A 3')序列通過Imin的煮沸使其雜交并在室溫下孵化3h。然后，500毫微克(ng)的寡核苷酸用于I^acI消化200ngpUP401媒介物的連接反應。連接的產(chǎn)物在70°C加熱lOmin，立刻提交1%瓊脂糖凝膠電泳并從凝膠中切除和洗脫。加入一種雜交緩沖液(IOmM Tris-HCl pH 8. 5 ； IOOmM NaCl ；ImM EDTA)來洗脫DNA，并在80°C加熱5min。然后讓所述DNA冷卻到室溫3小時，并且5微升用于所述大腸桿菌TOP 10菌株的轉化。通過HindIII消化和通過 DNA序列測定確定重組克隆。得到的結構命名為pUP402。hygR基因隨后采用Kpnl消除在媒介物PUP410中產(chǎn)生結果。本發(fā)明將通過參照實施例的方式來進行描述，不應將這些例子認為是用于限制本發(fā)明。補體致活的營養(yǎng)缺陷型巴斯德rBCG到亮氨酸的結構(巴斯德BCGr Δ IeuD/ pAKan-hsp60*-Sml4)
設計所述引物 PSml4F (TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGA CGC GC-SEQ ID NO :3) e PSml4R (CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT TAT A-SEQ ID NO :4)用于使得修飾后的hsp60*啟動子和使用載體pAU5-Sml4作為模板的Sml4表達盒的PCR擴增。采用Narl 酶消化通過PCR獲得的816bp擴增結果(圖2)，然后進入用同樣酶消化的媒介物pUP410中克隆。脫氧核糖核酸順序分析證實所述表達盒插入了預定位置。圖2中泳道1 =標記 fX174RF/HaeIII,以及泳道 2 = hsp60*_Sml4 擴增。在代替克隆宿主(牝牛分枝桿菌)中對所述結構的pUP410-hsp60*-Sml4到所述Sml4抗原的驅動表達能力進行評估。因而，在包含卡那霉素的板上被選定的五個獨立轉化體用于生產(chǎn)液體培養(yǎng)物，那些液體培養(yǎng)物被處理過用來通過免疫印跡法表達分析如同 Medeiros等描述的，(2002)。所述抗原表達是利用一種小鼠多克隆抗_Sml4抗血清與共軛到堿性磷酸酶的抗-小鼠IgG作為二級抗體進行檢測。發(fā)現(xiàn)所有五個克隆都表達Sml4，相當于用pAU5-Sml4轉化母牛分枝桿菌(表達陽性對照)中見到的水平。
然后，通過采用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII消化從pUP410-hsp60*-Sml4中除去卡那霉素抗性基因，并且所述媒介物通過T4聯(lián)接酶進行再-循環(huán)引起結構pAK410-hsp60*-Sml4， 其用于轉變BCG (BCG AleuD)的營養(yǎng)缺陷型巴斯德菌株。在Middlebrook 7H10瓊脂的板上挑選獲得的轉化體并檢測其在卡那霉素存在下的生長能力。其后，具有表達三個(tree) 獨立的對卡那霉素敏感的轉化體Sml4蛋白的能力方面的體外穩(wěn)定性，其評價是在米德爾布魯克7H9液體培養(yǎng)基(不含亮氨酸)中60代以上并10天之內(nèi)利用早先的報道的方法 (Varaldo等，200 感染人和鼠科動物單核細胞。為了達到這個目的，在體外采用所述結構pAK410-hsp60*-Sml4轉化的二個穩(wěn)定的BCG克隆感染鼠科動物或人單核細胞。先在M孔板中培養(yǎng)好巨噬細胞(5x105每孔)， 用補充有HEPES IOmM ；L-谷氨酰胺2mM ；和1%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)。然后單細胞層暴露在相當于每個BCG重組體的水平下，以獲得約10細菌細胞/巨噬細胞的多重感染 (Μ0Ι “多重感染”)。制備結核分枝桿菌接種體是在對數(shù)期培養(yǎng)稀釋直到所需要的濃度，通過光學顯微鏡直接計數(shù)。收集巨噬細胞對BCG重組體暴露后4h、24h、5天和10天的樣品(六孔/培養(yǎng))。收集用0. 1%的Tween溶于蒸餾水ΟΟΟμ /孔)溶解后的單層細胞，其后連續(xù)稀釋細胞溶解，隨后接種于瓊脂7Η10板或以同樣的手段并補充卡那霉素。結核分枝桿菌生長的水平，是從曝光后的4小時收集的樣品分析觀測，用于計算相對的感染能力。從其它點的菌落單位計數(shù)而獲得的值用于計算細胞內(nèi)持續(xù)的水平。所述功能穩(wěn)定性(所述抗原Sml4的表達)是通過根據(jù)早先描述的方案(Medeiros 2002)的免疫印跡法進行分析。在所有的例子中，人們已經(jīng)注意到所述轉化體表達蛋白Sml4的水平相當于那些在采用pAU5-Sml4(表達陽性對照)轉化的牛分枝桿菌BCG中所看到的。所述表達系統(tǒng)穩(wěn)定性，因此，在非-細胞方式和鼠科動物和人細胞的培養(yǎng)中都被證實。巴斯德B. BCGr Δ leuD/p AKan_hsp60*-Sml4保護小鼠對抗曼氏血吸蟲搖尾幼蟲的刺激。在兩個獨立的實驗中評估了巴斯德rBCG Δ leuD/p Δ Kan_hsp60*-Sml4保護小鼠對抗活曼氏血吸蟲尾蚴的能力。每個實驗有6個實驗組(表1)，每個組包含10只4周齡的成年雌性Swiss小鼠。所述疫苗接種的效果用只有一個劑量的rBCG-(pAK21-Sml4)滴鼻給藥(lxl06Cfu =標準劑量；或lxl02cfu =小劑量)與通過在爪給予相似單一劑量的 rBCG-(pAU5-Sml4)或3倍劑量的rSml4蛋白(l(^g在氫氧化鋁中)完成的相比，如同早先 Varaldo等，Q004)描述的。在同樣的日子給予最后的重組蛋白質部分作為基于BCGr的單劑量疫苗。對于保護試驗，首次免疫后的30天(實驗1)或在60天(實驗2)，所述小鼠皮下(sc)用100曼氏血吸蟲尾蚴肌注進行刺激，并在刺激45天后灌注。計算不同的刺激組中的寄生負擔和保護水平根據(jù)的是Tendler等1996年早先所描述。通過Mudent t檢驗評估其統(tǒng)計學的重要性。 表1-評價巴斯德rBCG Δ leuD/p Δ K410-hsp60*-Sml4保護對抗曼氏血吸蟲尾蚴刺激的能力使用的免疫方案
權利要求
1.一種補充到亮氨酸并表達曼氏血吸蟲Sml4蛋白(巴斯德rBCG Δ IeuD/ pAK410-hsp60*-Sml4)的重組體營養(yǎng)缺陷型巴斯德BCG菌株，其根據(jù)以下步驟獲得(a)通過PCR擴增的包含Sml4表達盒的片段，所述Sml4表達盒包含修飾后的hsp60* 啟動子，使用pAU5-Sml4媒介物作為模板以及引物PSml4F (TAT ATA TAT ATA TAG GCG CCA CCA CAA CGA CGC GC - SEQ ID NO:3) e PSml4R (CGC GGG CGC CTT AGG ATG ATC GTT TAT A - SEQ ID NO :4)；(b)消化通過PCR和Narl酶所獲得的816bp的hsp60*_Sml4擴增子；(c)Hsp60*-Sml4擴增子的克隆在pUP410媒介物中使用Narl酶消化并產(chǎn)生構造 pUP410-hsp60*-Sml4 ；(d)評價構造pUP410-hsp60*-Sml4在牝牛分枝桿菌中表達Sml4蛋白的能力；(e)通過限制性核酸內(nèi)切酶HindIII的消化從pUP410-hsp60*-Sml4移除耐卡那霉素基因；(f)再-環(huán)化沒有卡那霉素編纂基因的pUP410-hsp60*-Sml4構造以產(chǎn)生一種 pUP410-hsp60*-Sml4構造，用于轉變巴斯德BCG營養(yǎng)缺陷型菌株(BCG Δ IeuD)，以及產(chǎn)生一種重組體營養(yǎng)缺陷型巴斯德BCG菌株補充到表達曼氏血吸蟲Sml4蛋白(巴斯德BCG Δ leuD/p Δ K410_hsp60*-Sml4)的亮氨酸中。
2.如權利要求1中所定義的巴斯德BCGΔ leuD/p Δ K410-hsp60*-Sml4菌株在控制由寄生蟲，尤其是曼氏血吸蟲所引起的人感染中的應用。
3.如權利要求1中所定義的巴斯德BCGΔ leuD/p Δ K410-hsp60*-Sml4菌株在控制由肝片吸蟲所引起的動物感染的應用。
4.如權利要求1中所定義的巴斯德BCGΔ leuD/p Δ K410-hsp60*-Sml4菌株在控制由結核分枝桿菌的感染中的應用。
5.如權利要求1中定義的巴斯德BCGΔ leuD/p Δ K410-hsp60*-Sml4菌株在控制腫瘤形成中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組體BCG牛結核桿菌的疫苗菌株，該菌株表達曼氏血吸蟲Sm14蛋白(巴斯德BCGΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14)。本發(fā)明的疫苗菌株是用來控制由寄生蟲，特別是曼氏血吸蟲所引起的感染。所述疫苗菌株是一種來源于巴斯德BCG亞-菌株在遺傳轉化后補充到亮氨酸的營養(yǎng)缺陷型菌株到亮氨酸的氨基酸其構造為pΔK410-hsp60*-Sm14。本發(fā)明顯示了巴斯德BCGΔleuD/pΔK410-hsp60*-Sm14菌株在體內(nèi)重組體Sm14抗原的基礎上控制曼氏血吸蟲感染的效果。
文檔編號A61P35/00GK102439155SQ201080020417
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月10日 優(yōu)先權日2009年3月11日
發(fā)明者安德魯·J·G·辛普森, 熱拉爾多·羅得里格斯·加西亞·阿爾馬, 米里亞姆·滕德勒, 莫妮卡·馬格諾·比拉爾, 道格拉斯·麥斯恩圖施 申請人:奧斯瓦道·克魯茲基金會