專利名稱：一種肺腫瘤實驗動物模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病的實驗動物模型構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種肺腫瘤實驗動物模型的 構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著動脈化療栓塞、經(jīng)皮消融(射頻、微波、激光、冷凍)和經(jīng)皮放射性粒 子植入等介入微創(chuàng)技術(shù)在肺部腫瘤的廣泛應(yīng)用，給大多數(shù)中晚期患者帶來了控制病灶甚至 治愈的希望。但相關(guān)介入技術(shù)的基礎(chǔ)實驗研究卻相對滯后，其主要原因之一是目前國內(nèi)外 常見的肺腫瘤動物模型，多應(yīng)用于病因及發(fā)病機制的研究，例如化學誘導模型、轉(zhuǎn)基因鼠 模型和腫瘤異種移植模型等。不同的實驗?zāi)Ｐ瓦m用于不同的研究目的，其中可移植性的腫瘤實驗?zāi)Ｐ腿鏥X2瘤 在鼠和兔子上已經(jīng)取得了成功，然而由于這些動物體型較小，造成應(yīng)用相當局限。比較成熟 的、適合于介入治療研究的大動物肺腫瘤模型卻相對罕見。犬傳染性性病腫瘤(Canine transmissible venereal tumor, CTVT)是一種犬類 動物生殖系統(tǒng)自然發(fā)生的圓細胞類腫瘤，傳播主要以性接觸為主，也可經(jīng)舔咬傳播。CTVS腫瘤具有以下幾個特點第一，可靠的穩(wěn)定性既往研究表明體外培養(yǎng)的 CTVT腫瘤細胞與移植性腫瘤的生物學特性均與原發(fā)腫瘤相似，沒有顯著的差異；第二，原 位移植的多樣性=CTVT沒有明顯的組織特異性，可以在多種組織內(nèi)進行生長，能夠模擬多 種器官腫瘤的特性；第三，異種移植性CTVT的接種需要新鮮腫瘤組織，可以先移植至鼠建 立轉(zhuǎn)移性的腫瘤，移植鼠的腫瘤組織又可以成功的接種到犬體內(nèi)而致瘤，并且通過細胞學、 組織學及分子生物學研究均證實細胞的特性沒有發(fā)生改變；第四，良好的模擬性，Ahrar等 研究表明將新鮮的CTVT組織漿液經(jīng)皮注入或經(jīng)動脈注入肺內(nèi)可以很好的模擬人類腫瘤生 長及轉(zhuǎn)移的模式。正是由于CTVT的上述特點，使其具備了成為移植瘤的必要條件。同時，CTVT —方 面解決了原位移植的問題，另一方面使移植腫瘤的各項指標接近人類疾病。動物犬的生活 習性與人類近似，體型較大，是非常適合行介入等研究的實驗動物。肺移植瘤種植方式主要有以下幾種第一種，移植瘤細胞懸液或組織漿液經(jīng)皮穿刺植入。如國外Ahrar的實驗中即采 用組織漿液，組織漿液或細胞懸液可經(jīng)皮穿刺由較細穿刺針(20-22G)植入，其優(yōu)點是創(chuàng)傷 小，操作容易，缺點是容易出現(xiàn)反流、彌散及胸膜種植等。第二種，組織塊開胸植入，該種方法操作復(fù)雜，創(chuàng)傷較大，極易出現(xiàn)氣胸、血胸等并 發(fā)癥，輕者影響成瘤率，重者危及性命，導致動物實驗成功率不高。第三種，組織塊經(jīng)皮穿刺植入，此方法理論上可有效避免細胞反流所致的胸膜種 植，但所需穿刺針較粗，其成功率及并發(fā)癥在國內(nèi)外未見相關(guān)報道。因此，利用肺移植瘤種植方式建立一個行之有效、成功率高的大動物肺腫瘤模型， 成為目前實驗研究的迫切要求。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種肺腫瘤實驗動物模型的構(gòu)建方法，利用 CTVT腫瘤經(jīng)皮穿刺建立一個成功率高的大動物肺腫瘤模型，滿足目前實驗研究的迫切要 求。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案一種肺腫瘤實驗動物模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟步驟一，在接種前4天開始予待接種犬口飼環(huán)孢霉素10mg/kg ；步驟二，制備CTVT組織塊；步驟三，接種以16G導引穿刺針穿刺至預(yù)定靶部位，將CTVT組織塊2-3枚置入穿 刺針內(nèi)，并在CTVT組織塊后放置無菌明膠海綿條，針芯將其推入肺組織后拔針。依照本發(fā)明較佳實施例所述的構(gòu)建方法，所述CTVT組織塊是無菌條件下以圓刀 片配合眼科剪將接種傳代的CTVT腫瘤組織切制成，并且浸在Hank's液中冰存的1.5-2. Omm 的組織塊。依照本發(fā)明較佳實施例所述的構(gòu)建方法，在步驟一中，所述待接種犬在接種前4 天口飼環(huán)孢霉素，每日2次，兩周后每日1次。依照本發(fā)明較佳實施例所述的構(gòu)建方法，在步驟三中，在接種前晚對接種犬禁食、 禁水。依照本發(fā)明較佳實施例所述的構(gòu)建方法，在步驟三進一步包括選擇預(yù)接種點以 及理想穿刺點，并在消毒鋪巾后，標記進針點。依照本發(fā)明較佳實施例所述的構(gòu)建方法，所述腫瘤組織通過以下方式制備CTVT新鮮瘤株在Beagle犬皮下傳代，6_8周后取CTVT荷瘤犬1只，消毒，鋪巾，在 全麻條件下取出腫瘤組織，剔除周圍包膜、肌肉、腱膜及血管，并置入Hank’ s液中。依照本發(fā)明較佳實施例所述的構(gòu)建方法，所述接種是在全麻條件下取出腫瘤組織 后2小時內(nèi)進行的。依照本發(fā)明較佳實施例所述的構(gòu)建方法，所述待接種犬的平均體重為 10. 56 士 1. 86kg。由于采用了以上的技術(shù)方案，使得本發(fā)明相比于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點和積 極效果第一，本發(fā)明以CTVT細胞為瘤株，利用該細胞的可移植性及遺傳穩(wěn)定的特性，通 過腫瘤皮下細胞傳代，制作腫瘤組織塊，并以微創(chuàng)介入的方法進行肺內(nèi)種植，在國內(nèi)首次建 立了犬移植性肺癌模型，同時優(yōu)化了國外報道的該模型的制作方法，可以廣泛應(yīng)用于大型 動物肺部腫瘤的生長、侵犯和轉(zhuǎn)移等相關(guān)實驗研究，也對于介入等治療方法的療效及監(jiān)測 提供了合適的動物模型。第二，本發(fā)明采用的CTVT組織塊接種方式，操作更加簡單，成功率更高，成瘤周期 縮短，易于復(fù)制，成瘤后的胸腔積液及轉(zhuǎn)移情況較少見，成瘤犬一般狀態(tài)好，利于后續(xù)實驗 的進行。第三，本發(fā)明采用了定向穿刺的方法，種植的目的性強，可以得到期望的肺葉成 瘤，有利于制作適合不同研究目的的腫瘤模型。
當然，實施本發(fā)明內(nèi)容的任何一個具體實施例，并不一定同時達到以上全部的技 術(shù)效果。


圖1是本發(fā)明一種肺腫瘤實驗動物模型的構(gòu)建方法的流程圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的核心思想在于，以CTVT細胞為瘤株，利用其可移植性及遺傳穩(wěn)定的特 性，通過腫瘤皮下細胞傳代，制作腫瘤組織塊，并以微創(chuàng)介入的方法進行肺內(nèi)種植，建立了 犬移植性肺癌模型，可以應(yīng)用于大型動物肺部腫瘤的生長、侵犯和轉(zhuǎn)移等相關(guān)實驗研究。為便于理解以下結(jié)合附圖，對本發(fā)明所提供方法的較佳實施例做進一步詳細敘 述。本發(fā)明提供一種肺腫瘤實驗動物模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟SlOl 在接種前4天開始予待接種犬口飼環(huán)孢霉素10mg/kg ；S102 制備 CTVT 組織塊；S103 接種以16G導引穿刺針穿刺至預(yù)定靶部位，將CTVT組織塊2-3枚置入穿刺 針內(nèi)，并在CTVT組織塊后放置無菌明膠海綿條，針芯將其推入肺組織后拔針。實施例為了便于對比實驗效果，在本實施例中以CTVT細胞懸浮液穿刺接種與CTVT細胞 組織塊穿刺置入接種兩種方式分組對比來說明。一、實驗前準備1、將實驗動物及分組純種Beagle犬18只，平均體重10. 56士 1. 86kg，隨機分為兩組CTVT組織塊組6 只、CTVT細胞懸液組12只，每組雌雄均等。2、傳代取瘤將CTVT新鮮瘤株先在Beagle犬皮下傳代，6-8周后取CTVT荷瘤犬1只，消毒、鋪 巾，全麻下取出腫瘤組織，剔除周圍包膜、肌肉、腱膜及血管，置入Hank’ s液中。二、實驗接種物制備1、CTVT細胞懸液的制備無菌條件下以圓刀片配合眼科剪將腫瘤組織切制成細碎組織塊，細胞過濾篩分離 細胞和組織，離心去上清，沉淀物經(jīng)Hank’ s液處理，苔盤藍法細胞染色，行細胞活力測定后 調(diào)整活細胞濃度達到108/ml，抽取1. Oml腫瘤細胞懸液，置于冰上。2、CTVT組織塊的制備無菌條件下以圓刀片配合眼科剪將腫瘤組織切制成1.5-2. Omm小組織塊，浸入 Hank’ s液的試管中，置于冰上。三、肺內(nèi)接種1、所有待接種犬接種前4天開始口飼環(huán)孢霉素10mg/kg，2次/日，兩周后每日1 次，接種前晚犬禁食、禁水。接種時犬全麻后取仰臥位固定，CT胸部平掃，選擇預(yù)接種點及 理想穿刺位點，消毒鋪巾后，以標記物標記進針點，重復(fù)掃描確認。
2、CTVT細胞懸液組以22G Chiba針穿刺預(yù)定靶部位，1. Oml腫瘤細胞懸液經(jīng)針尾 緩慢、勻速注入，后以0. 2ml空氣將針內(nèi)液體推空，拔針后行CT掃描。3、CTVT組織塊組以16G導引穿刺針穿刺至預(yù)定靶部位，取腫瘤組織塊2_3枚置 入穿刺針內(nèi)，瘤塊后放置無菌明膠海綿條2塊，用針芯推入肺組織后拔針。拔針后重復(fù)CT 掃描，觀察肺內(nèi)情況，兩組接種時間控制在取瘤后2小時內(nèi)。三、接種的成功率及并發(fā)癥1、CTVT細胞懸液接種組 所有犬均按原計劃接種成功，技術(shù)成功率達100%。少量皮下氣腫1例，少量氣胸 3例，肺內(nèi)出血2例，患犬均無氣急、氣促、呼吸困難等不適癥狀，無大量血、氣胸等致死性并 發(fā)癥發(fā)生。2、CTVT組織塊接種組所有犬均按原計劃接種成功，技術(shù)成功率達100%。穿刺過程中未見皮下氣腫，少 量氣胸4例，實驗犬均無氣急、氣促、呼吸困難等不適癥狀，無其它致死性并發(fā)癥發(fā)生。四、觀察接種犬的成瘤率行胸部CT平掃監(jiān)測。
1、CTVT細胞懸液接種組12只犬中9只犬最終肺內(nèi)成瘤，接種成瘤率為75%。15個接種點至第10周觀察 最終10個成瘤，成瘤率為66. 67%。腫瘤至第10周最大可達3. 5cm。6只犬可見胸壁及皮 下種植，其中5只發(fā)生于肺內(nèi)成瘤犬，1只犬僅見胸壁種植，肺內(nèi)未成瘤，但該犬有大量胸腔 積液。2、CTVT組織塊接種組6只犬12個接種點最終全部肺內(nèi)成瘤，接種成瘤率為100%。腫瘤最大可達 3. 85cm。2只犬于第10周時發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移灶，大小約0. 3cm，位于其它肺葉內(nèi)。五、觀察肺部腫瘤的生長情況行胸部CT平掃監(jiān)測。1、CTVT細胞懸液接種組接種后第2-4周內(nèi)各犬均未見腫瘤生長。第5周僅2只犬可見肺內(nèi)成瘤，直徑約0. 3cm,圓形，邊緣光滑。第6周9只犬肺內(nèi)成瘤，腫瘤呈圓形，邊緣光滑，密度均勻，腫瘤直徑0. 3-1. 4cm, 腫瘤最大層面均徑約1.059士0. 113cm，縱隔淋巴結(jié)無腫大，未見胸腔積液。第7周腫瘤呈圓形，邊緣光滑，但部分相鄰病灶可見融合，形狀變得不規(guī)則，腫瘤 大小不等，主病灶直徑0. 6-2. 9cm ；2只接種犬可見少量胸腔積液及縱隔淋巴結(jié)腫大。第10周肺內(nèi)接種腫瘤平均直徑約為2. 189士0. 153cm，最大達3. 5cm，所有接種犬 均出現(xiàn)中_大量胸腔積液，心包積液，前縱隔淋巴結(jié)明顯腫大，部分病犬胸膜呈“飄絮”樣增 厚。2、CTVT組織塊接種組接種后第2-4周內(nèi)各犬肺內(nèi)均未見腫瘤生長。第5周所有犬肺接種區(qū)內(nèi)見腫瘤生長，直徑0. 2-0. 6cm，呈圓形，邊緣光滑，密度 均勻。
第6周所有犬肺接種區(qū)均成瘤，腫瘤最大徑線為0. 8-2. 3cm ；腫瘤呈類卵圓形，部 分形態(tài)欠規(guī)則，腫瘤最大層面均徑1. 716士0. 102cm，腫瘤邊界清楚，密度均勻；縱隔淋巴結(jié) 無腫大，無胸腔積液。第10周腫瘤繼續(xù)增大，腫瘤最大層面均徑2. 734士0. 138cm，邊緣清楚，4只腫瘤 內(nèi)部見少許壞死征象，未發(fā)現(xiàn)胸腔積液、縱隔淋巴結(jié)腫大及遠處器官轉(zhuǎn)移。六、尸檢病理造模犬第10周處死，行尸檢和病理學檢查。1、CTVT細胞懸液接種組尸檢發(fā)現(xiàn)雙側(cè)大量淡紅色胸腔積液，局部呈包裹性積 液，壁、臟層胸膜見數(shù)量不等之小結(jié)節(jié)，胸膜腔內(nèi)見大餅狀網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，表面密布大小不等之 紅色顆粒，切面呈白色魚肉狀，與肺內(nèi)腫瘤切面相同；肺內(nèi)見最大直徑約3. 5X3. 0X2. 8cm 腫瘤，腫瘤周圍見1-3個0. 5cm左右結(jié)節(jié)。縱隔淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移，且相互融合，以前縱隔明顯，并伴有心包積液。2、CTVT組織塊接種組肺內(nèi)腫瘤大小和形態(tài)與細胞懸液接種組差別不大，但未見 到明顯胸腔積液、胸膜結(jié)節(jié)及淋巴結(jié)增大。兩組病理學檢查基本相同CTVT腫瘤邊界清楚，質(zhì)韌均勻，呈膨脹性生長，腫瘤切 面呈魚肉狀，外緣為質(zhì)韌、厚度均勻的白色包膜，腫瘤中心無明顯壞死，臨近支氣管及血管 呈受壓改變，但無明顯侵犯征象。組織學上CTVS瘤巢由大片多形性的腫瘤細胞構(gòu)成，腫瘤 細胞核濃染，內(nèi)有粗大成群的染色質(zhì)和明顯增大的核仁。并可觀察到大量的有絲分裂現(xiàn)象。通過具體實施例表明，CTVT組織塊的接種并未因使用較粗的穿刺針(16G)而使血 胸、氣胸的情況有所增加，而且成瘤率高，胸壁種植及胸腔積液等的發(fā)生率低，植入過程中 因無推注過程中的腫瘤細胞返流、彌散，使細胞懸液組常見的胸腔及胸壁種植情況大大降 低，從而提高了實驗犬的生存時間，為后續(xù)實驗創(chuàng)造了有利條件。此外，CTVT組織塊制作相對簡單，操作容易，可大量節(jié)省時間，且成瘤時間縮短，腫 瘤平均直徑較大?？傊?，本發(fā)明的CTVT組織塊接種方式相比于細胞懸液的接種方式具備明 顯優(yōu)勢，是制作犬CTVT肺移植瘤模型的理想模式。綜上所述，本發(fā)明相比于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點和積極效果第一，本發(fā)明以CTVT細胞為瘤株，利用該細胞的可移植性及遺傳穩(wěn)定的特性，通 過腫瘤皮下細胞傳代，制作腫瘤組織塊，并以微創(chuàng)介入的方法進行肺內(nèi)種植，在國內(nèi)首次建 立了犬移植性肺癌模型，同時優(yōu)化了國外報道的該模型的制作方法，可以廣泛應(yīng)用于大型 動物肺部腫瘤的生長、侵犯和轉(zhuǎn)移等相關(guān)實驗研究，也對于介入等治療方法的療效及監(jiān)測 提供了合適的動物模型。第二，本發(fā)明采用的CTVT組織塊接種方式，操作更加簡單，成功率更高，且成瘤時 間縮短，腫瘤平均直徑較大，易于復(fù)制，成瘤后的胸腔積液及轉(zhuǎn)移情況較少見，成瘤犬一般 狀態(tài)好，利于后續(xù)實驗的進行。第三，本發(fā)明采用了定向穿刺的方法，種植的目的性強，可以得到期望的肺葉成 瘤，有利于制作適合不同研究目的的腫瘤模型。本發(fā)明較佳實施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。較佳實施例并沒有完全詳盡敘述所 有的細節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實施方式
。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很 多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實際應(yīng)用，從而使所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能很好地利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書 及其全部范圍和等效物的限制。
權(quán)利要求
1.一種肺腫瘤實驗動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一，在接種前4天開始予待接種犬口飼環(huán)孢霉素10mg/kg ；步驟二，制備CTVT組織塊；步驟三，接種以16G導引穿刺針穿刺至預(yù)定靶部位，將CTVT組織塊2-3枚置入穿刺針 內(nèi)，并在CTVT組織塊后放置無菌明膠海綿條，針芯將其推入肺組織后拔針。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述CTVT組織塊是無菌條件下以圓刀 片配合眼科剪將接種傳代的CTVT腫瘤組織切制成，并且浸在Hank's液中冰存的1.5-2. Omm 的組織塊。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟一中，所述待接種犬在接種前4 天開始口飼環(huán)孢霉素，每日2次，兩周后每日1次。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟三中，在接種前晚對接種犬禁 食、禁水。
5.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟三進一步包括選擇預(yù)接種點以 及理想穿刺點，并在消毒鋪巾后，標記進針點。
6.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述腫瘤組織通過以下方式制備 CTVT新鮮瘤株在Beagle犬皮下傳代，6_8周后取CTVT荷瘤犬1只，消毒，鋪巾，在全麻條件下取出腫瘤組織，剔除周圍包膜、肌肉、腱膜及血管，并置入Hank’ s液中。
7.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述接種是在全麻條件下取出腫瘤組 織后2小時內(nèi)進行的。
8.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述待接種犬的平均體重為 10. 56 士 1. 86kg。
全文摘要
本發(fā)明提供一種肺腫瘤實驗動物模型的構(gòu)建方法，包括步驟一，在接種前4天開始予待接種犬口飼環(huán)孢霉素10mg/kg；步驟二，制備CTVT組織塊；步驟三，以16G導引穿刺針穿刺至預(yù)定靶部位，將CTVT組織塊2-3枚置入穿刺針內(nèi)，并在CTVT組織塊后放置無菌明膠海綿條，針芯將其推入肺組織后拔針。本發(fā)明以CTVT細胞為瘤株，利用其可移植性及遺傳穩(wěn)定的特性，通過腫瘤皮下細胞傳代，制作腫瘤組織塊，并以微創(chuàng)介入的方法進行肺內(nèi)種植，建立了犬移植性肺癌模型，可以應(yīng)用在大型動物肺部腫瘤的生長、侵犯和轉(zhuǎn)移等相關(guān)實驗研究。
文檔編號A61B17/34GK102048757SQ20101059352
公開日2011年5月11日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者劉士遠, 劉洪超, 孫志超, 安瀟, 王智, 肖湘生, 董偉華, 高守紅 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學