專利名稱：：一種仙茅提取物、制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種提取物及其制備方法和應用，具體地涉及一種仙茅提取物、制備方法及其在制備治療或預防心腦血管疾病的藥物中的應用。
背景技術：
：仙茅是仙茅科仙茅屬植物仙茅(CurculigoorchioidesGaertn)的干燥根莖，具有補腎陽、強筋骨、祛寒濕等功效?，F(xiàn)代植物化學研究揭示仙茅中含有仙茅苷(curculigoside)、仙茅苷B-C(curculigosideB-C)、仙茅皂苷A-M(curculigosaponinsA-M)、苔黑酚葡萄糖苷(orcinolglusocide)等成分。目前還沒有文獻報道仙茅苷單體的制備方法，仙茅苷對心腦血管疾病的作用也未見報道，基于此，本發(fā)明人通過大量的實驗研究，提供了一種仙茅提取物及其制備方法和在預防或治療心腦血管疾病的藥物中的應用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種仙茅提取物，其中100%>仙茅苷》90%，優(yōu)選100%>仙茅本發(fā)明提供了一種仙茅提取物的制備方法。本發(fā)明提供了以仙茅提取物為活性成分的藥物組合物。本發(fā)明提供了以仙茅提取物為活性成分的藥物組合物在制備治療或預防心腦血管疾病的藥物中的應用。本發(fā)明提供了以仙茅提取物為活性成分的藥物組合物在制備治療或預防冠心病、心絞痛的藥物中的應用。本發(fā)明提供了以仙茅提取物為活性成分的藥物組合物在制備治療或預防缺血性腦中風的藥物中的應用。本發(fā)明提供了以仙茅提取物為活性成分的藥物組合物在制備治療或預防腦缺血/再灌注損傷的藥物中的應用。本發(fā)明提供了以仙茅提取物為活性成分的藥物組合物在制備治療或預防腦外傷的藥物中的應用。本發(fā)明所述的仙茅提取物中的仙茅苷，其結(jié)構(gòu)如下<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage4</formula>仙茅苷本發(fā)明提供的仙茅提取物由下述方法制備(l)仙茅藥材水提醇沉后，濾液濃縮至無乙醇；(2)濾液依次上非極性中極性的大孔樹脂和聚酰胺樹脂柱，洗脫，洗脫液濃縮至無乙醇；(3)洗脫液用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮至干；(4)萃取干燥品溶解于無水乙醇中，濃縮，冷卻，靜置，析出針狀白色晶體仙茅苷，過濾，低溫減壓干燥，重結(jié)晶，即得。本發(fā)明提供的仙茅提取物具體由以下方法制備仙茅藥材粉碎，加612倍水，浸泡2小時，煎煮34次，每次煎煮12小時，過濾，合并提取過濾液，減壓濃縮至相對密度為1.051.2，加入乙醇，攪拌，至乙醇濃度為60%90%，靜置，過濾乙醇溶液，少量乙醇洗滌濾渣，棄掉濾渣，濾液濃縮至無乙醇，選用一種非極性中極性的大孔樹脂和聚酰胺樹脂的組合，上樣，可先用水洗脫36倍柱體積或/和10%20%的乙醇溶液洗脫26倍柱體積，棄掉洗脫液，再用30%70%的乙醇溶液洗脫26倍柱體積，收集洗脫液濃縮至無乙醇，上聚酰胺樹脂柱，水洗26倍柱體積，棄掉洗脫液，再用5%20%乙醇洗脫26倍柱體積，接收洗脫液濃縮至無乙醇，再用乙酸乙酯萃取，1:1(V/V)萃取35次，合并萃取液，濃縮至干，萃取干燥品溶解于無水乙醇中，濃縮，冷卻，靜置，析出針狀白色晶體仙茅苷，過濾，低溫減壓干燥，重結(jié)晶，即得。本發(fā)明提供的藥物組合物可以是注射劑、粉針劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、微粒劑，優(yōu)選凍干粉針劑，所用輔料為各種制劑的常規(guī)輔料。本發(fā)明提供的藥物組合物在用于心腦血管疾病時，其注射使用劑量范圍是75mg3000mg，優(yōu)選為75mg1500mg。其口服使用劑量范圍是200mg4000mg，優(yōu)選為200mg2000mg。本發(fā)明人進行了下列試驗來證實仙茅提取物在制備治療或預防心腦血管疾病的藥物中的應用，但不僅限于此。具體實施例方式制備例l:仙茅提取物的制備仙茅藥材50Kg，加水600L，浸泡2小時，加熱煎煮3次，每次2小時，過濾，合并提取過濾液，減壓濃縮，至相對密度1.20(4(TC測定)，加入95%乙醇，攪拌，至乙醇濃度為70%，靜置1小時，過濾乙醇溶液，少量乙醇洗滌濾渣，棄掉濾渣，濾液濃縮至無乙醇。濃縮液上樣到AB-8大孔樹脂柱，吸附，10%乙醇溶液洗脫3倍柱體積，棄掉洗脫液，30%乙醇溶液洗脫3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮至無乙醇。此濃縮液上樣到聚酰胺樹脂柱，吸附，水洗5倍柱體積，棄掉洗脫液，15%乙醇溶液洗3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮至無乙醇。此濃縮液用乙酸乙酯按l:1(V/V)萃取4次，合并萃取液，濃縮至干。萃取干燥品溶解于無水乙醇中，濃縮，冷卻，靜置，析出針狀白色晶體仙茅苷，過濾，低溫減壓干燥。稱重，制得仙茅苷160g，檢測，含量94%。重結(jié)晶，制得仙茅苷140g，檢測，含量97%。制備例2:仙茅提取物的制備仙茅藥材50Kg，加水500L，浸泡2小時，加熱煎煮3次，每次2小時，過濾，合并提取過濾液，減壓濃縮，至相對密度l.15(40。C測定)，加入95%乙醇，攪拌，至醇濃度為60%，靜置6小時，過濾乙醇溶液，少量乙醇洗滌濾渣，棄掉濾渣，濾液濃縮至無乙醇。濃縮液上樣到HZ—818大孔樹脂柱，吸附，分別用水和20%乙醇各洗脫3倍柱體積，棄掉洗脫液，用40%乙醇洗脫3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮至無乙醇。此濃縮液上樣到聚酰胺樹脂柱，吸附，水洗4倍柱體積，棄掉洗脫液，10%乙醇洗3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮至無乙醇。此濃縮液用乙酸乙酯按l:1(V/V)萃取5次，合并萃取液，濃縮至干。萃取干燥品溶解于無水乙醇中，濃縮，冷卻，靜置，析出針狀白色晶體仙茅苷，過濾，低溫減壓干燥。稱重，制得仙茅苷180g，檢測，含量95%。重結(jié)晶，制得仙茅苷160g，檢領!J，含量98%。制備例3:仙茅苷注射液的制備處方仙茅苷25g氯化鈉89g注射用水10000ml制成10000ml制法按處方量取仙茅苷25g，氯化鈉89g，用注射用水10000ml溶解，攪拌；加入活性炭50g，攪拌20分鐘，溶液經(jīng)過微孔濾膜過濾澄明，分裝于125ml輸液瓶中，每瓶100mL，滅菌，檢査合格后包裝即可。其它檢查項應該符合中華人民共和國藥典2005年版注射液項目要求。制備例4:仙茅苷凍干粉針的制備處方-仙茅苷25g甘露醇50g注射用水500(kl制成2500支制法:取仙茅苷25g，溶解于5000ml含l^甘露醇的注射用水溶液中，加入活性炭50g，攪拌30分鐘，溶液經(jīng)過微孔濾膜過濾，得到無熱原的澄清溶液，分裝于10ml西林瓶中，2ml/只，按凍干粉針工藝凍干，制成每支含10mg的凍干粉針。制備例5:仙茅苷固體片劑制備處方仙茅苷200g淀粉150g羧甲基淀粉鈉50g微晶纖維素100g硬脂酸鎂5g50%乙醇制成1000粒制法:按處方量取仙茅苷200g，淀粉150g，羧甲基淀粉鈉50g，微晶纖維素100g，硬脂酸鎂5g，混和，加入50%乙醇適量制粒，千燥，整粒，壓片，檢查合格后，包裝。試驗例l:仙茅提取物對大鼠心肌缺血損傷的影響(l)材料仙茅提取物，按制備例1方法制備。氯化硝基四氮唑藍(N-BT)，由軍事醫(yī)學科學院藥材供應站提供。實驗動物普通級SD大鼠，雄性，體重280g—350g，雌雄各半，山東綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020。(2)方法與結(jié)果動物隨機分為模型對照組(生理鹽水)、硝苯地平組(6mg/kg)、仙茅苷靜脈注射小劑量組(2.5mg/kg)、仙茅苷靜脈注射中劑量組(7.5mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組l(20mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組2(50mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組3(150mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組4(300mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組1(20mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組2(50mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組3(200mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組4(400mg/kg)。每組10只。禁食12小時后，ip.烏拉坦(1.2g/kg)麻醉，測肢體II導聯(lián)心電圖。剪去左胸前皮毛，碘酒及酒精消毒，沿胸骨左緣lcm處，剪開胸壁肌肉及二條肋骨，迅速打開胸腔，暴露心臟，在動脈圓錐與左心耳之間結(jié)扎左冠狀動脈，立即將心臟放回，排擠出胸腔空氣，用止血鉗閉合胸腔，造成大鼠急性心肌缺血模型。硝苯地平組在麻醉前灌胃給藥，灌胃給藥組連續(xù)給藥3天，于第2天給藥后禁食16小時后，第3天給藥30分鐘后手術，其余各組術后隨既靜脈注射相應藥物。記錄給藥前及給藥后1.5h、3h心電圖，測量心電圖J點的升高值，6h后取出心臟，以冷生理鹽水洗凈后，-20°。冰箱冷凍過夜。次日，將冷凍的心臟由結(jié)扎處至心尖部等厚切成5片，浸入新鮮配制的0.25%N-BT磷酸緩沖液(pH7.4)中。37'C水浴振搖1015min。用濾紙吸干切片表面的染色液，分離染色部分和未染色部分，稱重，記算梗死面積。梗死面積(％)=梗死部分重量/(非梗死部分重量+梗死部分重量>100%。數(shù)據(jù)用Iis表示，以組間r檢驗進行統(tǒng)計學處理。結(jié)果如表l所示，心肌缺血6小時后，模型組大鼠心肌出現(xiàn)明顯的灶狀缺血區(qū)，達到26%左右。仙茅苷靜脈注射中劑量組(7.5mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組l(20mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組2(50mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組3(150mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組4G00mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組1(20mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組2(50mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組3(200mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組4(400mg/kg)降低肢體導聯(lián)心電圖J點的升高、減少缺血面積(與模型組比較，p〈0.01);仙茅苷靜脈注射高劑量組3(150mg/kg)與仙茅苷靜脈注射高劑量組4(300mg/kg)比較，對肢體導聯(lián)心電圖J點的升高及缺血面積無明顯差異(p〉0.05);仙茅苷靜脈灌胃組3(200mg/kg)與仙茅苷灌胃組4(400mg/kg)比較，對肢體導聯(lián)心電圖J點的升高及缺血面積無明顯差異(p>0.05)。表l仙茅苷對大鼠心肌缺血損傷的影響(『10)<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>試驗例2:仙茅提取物對大鼠局部腦缺血損傷的影響(1)材料仙茅提取物，按制備例l方法制備。紅四氮唑美國Sigma公司產(chǎn)品，臨用前用生理鹽水配成4%溶液。實驗動物普通級SD大鼠，雄性，體重280g—350g，雌雄各半，山東綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020。(2)方法與結(jié)果動物隨機分為模型對照組(生理鹽水)、尼莫地平組(1.0mg/kg)、仙茅苷靜脈注射小劑量組(2.5mg^g)、仙茅苷靜脈注射中劑量組(7.5mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組l(20mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組2(50mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組3(150mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組4(300mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組l(20mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組2(50mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組3(200mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組4(400mg/kg)。每組10只。每組10只。禁食12小時后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分離右側(cè)頸總動脈，夾閉頸內(nèi)、頸總動脈，頸外動脈近心端及遠心端結(jié)扎，中間剪斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內(nèi)動脈成一條直線，將栓線(選用直徑0.24111111尼龍線，長度5.0cm)由頸外動脈插入至顱內(nèi)，遇輕微阻力時停止，插入深度約為2cm。結(jié)扎頸外動脈開口，并打開頸總動脈動脈夾，消毒縫合傷口，造成右側(cè)大腦中動脈缺血模型；假手術組僅進行右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈的分離(以上實驗均在23'C25t:進行)。灌胃給藥組連續(xù)給藥3天，于第2天給藥后禁食16小時后，第3天給藥30分鐘后手術，其余各組術后靜脈注射相應藥物。24小時后按文獻劉小光，徐理納，一種能評價溶栓和抗溶栓的大鼠腦中動脈模型，藥學學報，1995，30:662所述方法及標準觀察并記錄大鼠的行為障礙(A)提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面，計為0分，如手術對側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲計為1分，肘屈曲計為2分，肩內(nèi)旋計為3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩內(nèi)旋者，計為4分。(B)將動物置于平地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，檢査阻力。如雙側(cè)阻力對等且有力，計為O分，如向手術對側(cè)推動時阻力下降者，根據(jù)下降程度不同分為輕、中、重三度，分別計為1,2禾n3分。(C)將動物雙前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對等且有力者計為O分。同樣根據(jù)手術對側(cè)肌張力下降程度不同計為1，2和3分。(D)動物有不停地向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者，計為1分。根據(jù)標準評分，滿分為11分，分數(shù)越高，表示動物行為障礙越嚴重。行為評分后處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切成5片，腦片用紅四氮唑(TTC)染色，正常組織經(jīng)染色后呈紅色，梗塞組織呈白色，染色后照相，用中國航空航天大學病理圖像分析軟件求梗塞面積比。數(shù)據(jù)用I土s表示，以組間/檢驗進行統(tǒng)計學處理。結(jié)果如表2所示，缺血24小時后，模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的行為障礙，大鼠腦組織也出現(xiàn)明顯的灶狀缺血區(qū)，達到全腦24%左右。仙茅苷靜脈注射中劑量組(7.5mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組l(20mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組2(50mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組3(150mg/kg)、仙茅苷靜脈注射高劑量組4(300mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組l(20mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組2(50mg^g)、仙茅苷灌胃劑量組3(200mg/kg)、仙茅苷灌胃劑量組4(400mg/kg)顯著改善大鼠行為障礙、減少缺血面積(與模型組比較，p〈0.05或p〈0.01)，仙茅苷靜脈注射高劑量組3(150mg/kg)與仙茅苷靜脈注射高劑量組4(300mg/kg)比較，對改善大鼠行為障礙、減少缺血面積無明顯差異(p〉0.05);仙茅苷灌胃組3(200mg/kg)與仙茅苷灌胃組4(400mg/kg)比較，對改善大鼠行為障礙、減少缺血面積無明顯差異(p>0.05)。表2仙茅苷對大鼠腦缺血損傷的影響(11=10)<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種仙茅提取物，其特征為100％＞仙茅苷≥90％。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取物，其中100﹪＞仙茅苷≥97﹪。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取物，其制備方法為(l)仙茅藥材水提醇沉后，濾液濃縮至無乙醇；(2)濾液依次上樣非極性中極性的大孔樹脂和聚酰胺樹脂柱，洗脫，洗脫液濃縮至無乙醇；(3)洗脫液用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮至干；(4)萃取干燥品溶解于無水乙醇中，濃縮，冷卻，靜置，析出針狀白色晶體仙茅苷，過濾，低溫減壓干燥，重結(jié)晶即得。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的提取物，其制備方法為(1)仙茅藥材粉碎，加612倍水，浸泡2小時，煎煮34次，每次煎煮12小時，過濾，合并提取過濾液，減壓濃縮至相對密度為1.051.2，加入乙醇，攪拌，至乙醇濃度為60﹪90％，靜置112小時，過濾乙醇溶液，少量乙醇洗滌濾渣，棄掉濾渣，濾液濃縮至無乙醇，備用；(2)選用樹脂為非極性中極性的大孔樹脂的一種或和聚酰胺樹脂的組合，上樣，水洗脫36倍柱體積，10﹪70﹪的乙醇溶液洗脫，分段接收，洗脫體積為315倍柱體積，富含仙茅苷者濃縮至無乙醇，備用；(3)樹脂分離濃縮液加乙酸乙酯萃取，1:1(V/V)萃取35次，合并萃取液，濃縮至干；(4)萃取干燥品溶解于無水乙醇中，濃縮，冷卻，靜置，析出針狀白色晶體仙茅苷，過濾，低溫減壓干燥，重結(jié)晶，即得。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的提取物，其制備方法為(l)仙茅藥材粉碎，加10倍水，浸泡2小時，加熱煎煮3次，每次2小時，過濾，合并提取過濾液，減壓濃縮，至相對密度1.15(40℃測定)，加入95﹪乙醇，攪拌，至醇濃度為60﹪，靜置6小時，過濾乙醇溶液，少量乙醇洗滌濾渣，棄掉濾渣，濾液濃縮至無乙醇；(2)濃縮液上樣到HZ—818大孔樹脂柱，吸附，分別用水和20﹪乙醇各洗脫3倍柱體積，棄掉洗脫液，用40﹪乙醇洗脫3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮至無乙醇；此濃縮液上樣到聚酰胺樹脂柱，吸附，水洗4倍柱體積，棄掉洗脫液，10﹪乙醇洗3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮至無乙醇；(3)此濃縮液用乙酸乙酯按1:1(V/V)萃取5次，合并萃取液，濃縮至干；(4)萃取干燥品溶解于無水乙醇中，濃縮，冷卻，靜置，析出針狀白色晶體仙茅苷，過濾，低溫減壓干燥，重結(jié)晶，即得。6、含有權(quán)利要求1或2所述的提取物的藥物組合物。7、權(quán)利要求6所述的藥物組合物在制備治療或預防心腦血管疾病的藥物中的應用。8、權(quán)利要求7所述的藥物組合物在制備治療或預防冠心病、心絞痛的藥物中的應用。9、權(quán)利要求7所述的藥物組合物在制備治療或預防缺血性腦中風、腦缺血/再灌注損傷的藥物中的應用。10、權(quán)利要求7所述的藥物組合物在制備治療或預防腦外傷的藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明提供了一種仙茅提取物、制備方法及其應用，具體提供了一種仙茅提取物，其中100％＞仙茅苷≥90％，以及該提取物的制備方法和以該提取物為活性成分的藥物組合物，及其該藥物組合物在制備治療或預防心腦血管疾病的藥物中的應用。文檔編號A61P9/10GK101342274SQ20071001538公開日2009年1月14日申請日期2007年7月13日優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日發(fā)明者建侯,廣劉,王春明,耿桂華,蔣王林,馬成俊申請人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司