專利名稱：利用肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽促進(jìn)毛發(fā)生長的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容提供了適合促進(jìn)人和其它動(dòng)物的毛發(fā)生長的方法和組合物。更具體而言，公開的內(nèi)容涉及用于治療毛發(fā)脫落的方法和組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，公開的內(nèi)容涉及外源轉(zhuǎn)移胸腺素β4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合部分以促進(jìn)毛發(fā)生長。在其他實(shí)施例中，公開的內(nèi)容涉及利用合成的或蛋白水解生成的肽片段來促進(jìn)毛發(fā)生長，這些生成的片段含有胸腺素β4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，用一種或多種含有胸腺素β4的第17-23位的七個(gè)氨基酸殘基(本發(fā)明稱作T-3)或第17-22位的六個(gè)氨基酸殘基的肽進(jìn)行治療，從而促進(jìn)受試者的毛發(fā)生長。
背景技術(shù)：
毛發(fā)脫落受到許多男人和女人的關(guān)注。在許多個(gè)體中，毛發(fā)脫落(即毛發(fā)脫落癥)會(huì)使人尷尬，和/或產(chǎn)生一些生理問題，如令人沮喪。盡管毛發(fā)脫落癥在男性中(如男性禿頭或雄性脫發(fā))要比女性(如女性禿頭)更普遍，然而卻都能引起男性和女性的顯著關(guān)注。事實(shí)上，為了解決這個(gè)問題，人們花費(fèi)了數(shù)以百萬計(jì)的金錢和無數(shù)的時(shí)間在這項(xiàng)研究上。
成熟的毛囊是一種復(fù)雜的微小器官，它的生長周期受到嚴(yán)密調(diào)控。在出生后的發(fā)育過程中，毛囊要經(jīng)歷一個(gè)連續(xù)的過程產(chǎn)生有活性的毛干(生長期)，凋亡驅(qū)動(dòng)的衰退(退行期)，以及靜止期(休止期)。Paus等人，“毛囊生物學(xué)(The biology of hair follicles)”，NEJM341491-497(1999)。在生長期，活躍的毛發(fā)生長包括近端濾泡上皮細(xì)胞的增殖，緊接著是延長的毛囊浸入皮下組織，毛囊底部上皮的分化，以及形成毛母質(zhì)細(xì)胞，所述毛母質(zhì)細(xì)胞增殖并產(chǎn)生一個(gè)新的毛干。當(dāng)毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖能力耗盡時(shí)，毛發(fā)生長的衰退期(退行期)就會(huì)接著出現(xiàn)，通過退行期，毛囊更低的部分進(jìn)行程序性細(xì)胞死亡和退化。Costsarelis等人，“毛發(fā)囊泡關(guān)注死亡(The hair follicledying forattention)”Am.J.Pathol，1511505-1509(1997)。在這個(gè)點(diǎn)上，毛囊便進(jìn)入剩余的一個(gè)時(shí)期——休止期。然后，毛發(fā)生長周期便開始重復(fù)。
頭皮毛囊生長周期是相互獨(dú)立的。平均而言，在100000根頭發(fā)中，無論哪個(gè)時(shí)間點(diǎn)，大約90％處于生長期(即在生長)，而剩余的10％卻處在休止期(即休息)。Whiting，“毛發(fā)的紊亂”，在Dale和Federman(編輯)的“美國醫(yī)學(xué)(Scientific American Medicine)”(來自Web MD ScientificAmerican Medicine)，紐約(1999)，2頁XIII1-7。生長期平均持續(xù)大約三年，在1-7年之間，而休止期平均持續(xù)大約3個(gè)月，在休止期后，休止的頭發(fā)脫落，長出新的頭發(fā)。頭發(fā)生長的平均速率大約是0.35mm/天(即約1英寸/2-3個(gè)月)。在生長期，真皮乳突周圍的細(xì)胞每隔12小時(shí)左右分裂一次，產(chǎn)生的細(xì)胞排成列，長得更長，并且開始角質(zhì)化。在生長期和休止期的過渡期(即退行期或衰退期)，不再發(fā)生有絲分裂，而且毛球遠(yuǎn)離乳突，向表面生長。在休止期，毛發(fā)被充分角質(zhì)化，并準(zhǔn)備長出。經(jīng)過3-4個(gè)月后，在毛發(fā)的發(fā)生圈開始另一輪有絲分裂，并且形成另一個(gè)發(fā)囊。
頭發(fā)平均每天脫落100根被認(rèn)為是正常的，洗頭發(fā)的時(shí)候脫落的數(shù)目更多。在診斷頭發(fā)紊亂的過程中，確定這種脫落是否異常以及脫落的頭發(fā)是否是從根上斷開或長出是很重要的。頭發(fā)正常情況下是從根上長出的。然而，損傷或頭發(fā)過于脆弱都會(huì)導(dǎo)致頭發(fā)斷裂。在對(duì)病人進(jìn)行檢查的過程中，拉扯頭發(fā)測驗(yàn)?zāi)茱@示出脫落的異常。在這種測驗(yàn)中，將10-20根成組的頭發(fā)夾在食指和拇指之間，穩(wěn)健地一拉。如果其中有20％多的頭發(fā)拔出可能表示出異常的脫落，通常有休止期頭發(fā)。休止期頭發(fā)(“畸形頭發(fā)”)很容易辨認(rèn)，它們的毛球是畸形和發(fā)白的，并且沒有根鞘。在正常情況下，生長期頭發(fā)是很難分開的，而且發(fā)黑，發(fā)根是鋸齒狀，具完整的根鞘(Whiting，Web MD ScientificMedicine，2頁XIII1-7(1999))。
在人類中觀察到了不同形式的禿頭癥。盡管在人類中也能觀察到擴(kuò)散性脫發(fā)，休止期脫發(fā)(telogen effluvium)，生長期脫發(fā)(anageneffluvium)(即anagen arrest)，斑禿，創(chuàng)傷性脫發(fā)，拔毛癥，瘢痕性脫發(fā)以及其他類型的脫發(fā)，但最普通的還是雄性遺傳性脫發(fā)。此外，和癌癥治療相關(guān)的脫發(fā)也十分常見，引起了很大一部分患者的極大關(guān)注。事實(shí)上，用不同藥物(例如α阻斷物，血管收縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，抗凝血因子，抗痙攣藥物，抗甲狀腺藥物，β阻斷物，鈣離子通道阻斷物，降低膽固醇藥物，H2受體阻斷物，非甾體抗炎藥，維他命A酸，維他命A，三環(huán)抗郁劑等)進(jìn)行治療會(huì)導(dǎo)致相當(dāng)大部分的患者脫發(fā)。
根據(jù)嚴(yán)重性，脫發(fā)的治療和處理范圍從持續(xù)觀察到藥物和手術(shù)治療，再到使用假發(fā)。美國食品和藥品管理局已經(jīng)批準(zhǔn)在男性和女性中可以局部使用2％的米諾地爾。利用這種藥物，可以使大約1/3的男性和女性雄性遺傳性脫發(fā)患者長出肉眼可見的頭發(fā)，大約1/3的患者長出細(xì)發(fā)，而大約1/3的患者則可能長不出頭發(fā)。然而，這種藥物看起來有相對(duì)有效的預(yù)防性治療作用，因?yàn)樗茏璧K大約80％的患者脫發(fā)。Whiting，Web MD Scientific American Medicine，2頁XIII1-7(1999)。局部施用5％的米諾地爾可以使45％的男性雄性遺傳性脫發(fā)患者長出肉眼可見的頭發(fā)，時(shí)間比施用2％的米諾地爾的作用時(shí)間更短。米諾地爾給藥的副作用包括頭皮發(fā)炎以及面部毛發(fā)增加。此外，至少花費(fèi)1年的時(shí)間來評(píng)估這種藥物是否有效。如果這種藥物有效，那這種藥物治療會(huì)持續(xù)多長時(shí)間就不確定了。
其他發(fā)現(xiàn)有用的化合物包括口服非那雄胺(1mg/天)。如果對(duì)18-41歲的男性患者持續(xù)使用兩年，劑量是1mg/天，那66％的患者都會(huì)長出可見的毛發(fā)，而且也能抑制83％的患者進(jìn)一步脫發(fā)。Whiting，Web MDScientific American Medicine，2頁XIII1-7(1999)。然而，對(duì)停經(jīng)后婦女給藥1年，劑量是1mg/天，發(fā)現(xiàn)無效。非那雄胺的副作用包括沒有性欲，缺乏力氣，以及精子有輕微下降。因?yàn)檫@種藥可能會(huì)導(dǎo)致男性胎兒嚴(yán)重畸形，因此應(yīng)禁忌對(duì)停經(jīng)前婦女施用這種藥。
其他用于治療女性雄性遺傳性脫發(fā)患者的藥物包括口服避孕藥(如炔雌醇-雙醋炔諾醇，去氧孕烯-乙炔雌二醇，炔雌醇-norgesterimate)，這些藥物能減少毛發(fā)脫落，而且有時(shí)候還能輕微增加毛發(fā)生長。Whiting，Web MD Scientific American Medicine，2頁XIII1-7(1999)?？诜輧?nèi)脂和地塞米松對(duì)女性患者的治療也是有用的。
對(duì)于其他類型的脫發(fā)，有不同的方法，包括蒽林，補(bǔ)骨脂素加上紫外線A照射，類固醇，局部免疫療法，免疫抑制劑，和長期的抗菌藥物治療等。然而，這些治療方案中的一些會(huì)有一定的風(fēng)險(xiǎn)，而且伴隨著副作用，其中一些副作用是很嚴(yán)重的。
對(duì)于那些對(duì)這些組合物沒有反應(yīng)，而且在頭皮的后面和兩側(cè)均有頭發(fā)的患者，微量或少量毛發(fā)移植法是一種選擇。在其他情況下，假發(fā)是一種主要的選擇。事實(shí)上，盡管在尋求成功治療和抑制脫發(fā)的過程中，投入了大量的財(cái)力，但是以前已知的治療方法都有嚴(yán)重的缺陷。因此，尋求促進(jìn)毛發(fā)生長的組合物和方法還是有必要的。
只要存在多效性干細(xì)胞，毛囊穩(wěn)定更新的能力就能得到保證，多效性干細(xì)胞通過分裂，能產(chǎn)生兩類子細(xì)胞。一些子細(xì)胞仍然保持多效性表型，而另一些則成為快速分裂的過渡擴(kuò)增(TA)細(xì)胞，這種細(xì)胞在每次新的周期開始前，能提供一些分化的子細(xì)胞用于較低毛囊的再生和毛干的形成。Janes等人，“表皮干細(xì)胞(Epidermal stem cells)”，J.Pathol.197479-494(2002)。最近，毛囊的膨脹部被鑒定為干細(xì)胞的“巢(niche)”，它緊靠堅(jiān)毛肌插入的地方。參看Lyle等人，“人毛囊膨脹細(xì)胞在生化上是獨(dú)特的并且具有上皮干細(xì)胞表型(Human follicle bulgecells are biochemically distinct and posses an epithelial stem cellphenotype)”，J.Invest.Dermatol.Symp.Proc.4296-301(1999)；Taylor等人，“毛囊干細(xì)胞參與形成毛囊和表皮(Involvement of follicular stemcells in forming not only the follicle but also the epidermis)”，Cell102453-461(2000)；Oshima等人，“發(fā)囊從成人多效性干細(xì)胞中形態(tài)發(fā)生和更新(Morphogenesis and renewal of hair follicles from adultmultipotent stem cells)”，Cell 104233-245(2001)。在生長期開始時(shí)，位于膨脹部的多效性干細(xì)胞或它們的TA子細(xì)胞遷移到毛囊的基底部，成為母質(zhì)細(xì)胞，并且產(chǎn)生新的毛干。有意思的是，發(fā)源于膨脹部的細(xì)胞既可以向下遷移，重新遷入毛母質(zhì)，也可以向上遷移，補(bǔ)充上皮，因此，它能有助于傷口治愈。
胸腺素β4是一種普遍存在的4.9kDa的多肽，它最初是從牛胸腺中分離出來的，是一些類型細(xì)胞遷移和分化的潛在介質(zhì)。參看Low等人，“牛胸腺素的完整氨基酸序列能在胸腺細(xì)胞群中誘導(dǎo)出末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶活性的胸腺激素(Complete amino acid sequence ofbovine thymosina thymic hormone that induces terminaldeoxynucleotidyl transferase activity in thymocyte populations)”，Proc.Natl.Acad.Sci.781162-1166(1981)；Grant等人，“胸腺素β4的新角色matrigel誘導(dǎo)的基因參與了內(nèi)皮細(xì)胞分化和血管新生(A novel rolefor thymosin beta 4a Matrigel-induced gene involved in endothelial celldifferentiation and angiogenesis)”，J.Cell.Science 1083685-3694(1995)；Malinda等人，“胸腺素β4刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的定向遷移(Thymosinβ4 stimulates directional migration of human umbilical veinendothelial cells)”，F(xiàn)ASEB J.11474-481(1997)；Malinda等人，“胸腺素β4加速傷口愈合(Thymosinβ4 accelerates wound healing)”，J.Invest.Dermatol.113364-368(1999)；Sosne等人，“胸腺素β4能促進(jìn)角膜傷口愈合以及堿性受傷后體內(nèi)降低炎癥(Thymosin beta 4 promotes cornealwound healing and decreases inflammation in vivo following alkaliinjury)”，Ex.Eye.Res.74293-299(2002)。胸腺素β4可以用一個(gè)基因來確定，后來顯示出促進(jìn)血管生成，而用來鑒定它的基因在早期內(nèi)皮細(xì)胞管形成過程中能被正調(diào)節(jié)4-6倍。胸腺素β4出現(xiàn)在傷口流出的液體中，當(dāng)局部給藥或全身性給藥時(shí)，它能促進(jìn)血管生成和傷口愈合。參看Frohm等人，“人傷口和水泡中液體的生化和抗菌分析(Biochemical and antibacterial analysis of human wound and blisterfluid)”Eur.J.Biochem，23786-92(1996)；Malinda等人，J.Invest.Dermatol.113364-368(1999)。它也是一種潛在的抗炎藥。Sosne等人，Ex.Eye.Res.74293-299(2002)；Frohm等人，Eur.J.Biochem，23786-92(1996)；Young等人，“在糖皮質(zhì)激素存在的情況下，胸腺素β4亞砜是一種由單核細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎藥(Thymosin beta 4 sulfoxide is an anti-inflammatory agent generated by monocytes in the presence ofglucocoticoids)”，Nat.Med.51424-1427(1999)。此外，胸腺素β4在轉(zhuǎn)移瘤中的水平是遞增的，并且當(dāng)轉(zhuǎn)染到低的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中時(shí)，它會(huì)引起惡性腫瘤。Clark等人，“轉(zhuǎn)移的基因組分析揭示出RhoC發(fā)揮了關(guān)鍵的作用(Genomic analysis of metastasis reveals an essential role forRhoC)”，Nature 406532-535(2000)；Kobayashi等人，“胸腺素β4調(diào)節(jié)惡性小鼠纖維肉瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移(Thymosin-beta 4 regulatesmotility and metastasis of malignant mouse fibrosarcoma cells)”，Am.J.Pathol.160869-882(2002)。一個(gè)相關(guān)的家族成員，胸腺素β15，在某些腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中也很重要。Bao等人，“胸腺素β15轉(zhuǎn)移性前列腺癌癥中正調(diào)控的一種新型腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)蛋白”，Nat.Med.21322-1328(1996)；Bao等人，“胸腺素β15在具不同轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)(Thymosin beta 15 expression in tumor cell lines withvarying metastatic potential)”，Clin.Exp.Metastasis 16227-233(1998)。胸腺素β4的轉(zhuǎn)移活性和它的血管生成活性，促進(jìn)遷移活性以及抑制免疫監(jiān)視的能力相關(guān)。最近，發(fā)現(xiàn)胸腺素β4是一種有效的抗菌藥。Tung等人，“來自人血小板的抗菌肽(Antimicrobial peptides from humanplatelets)”，Infect.Immun.706524-6533(2002)。
胸腺素β4典型的作用方式是加速內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的遷移，并且增加胞外基質(zhì)降解酶的產(chǎn)量。
公開內(nèi)容概述本公開內(nèi)容證實(shí)了在不同的體外和體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，胸腺素?在毛發(fā)生長中的作用。胸腺素β4能促進(jìn)年老的和裸體的小鼠模型，以及正常大鼠的毛發(fā)生長。并不是想拘囿于任何具體的理論，在小鼠皮膚中，起源于膨脹部的特定亞類的毛囊角質(zhì)細(xì)胞，在毛發(fā)生長周期的不同階段，能以高度協(xié)同的方式表達(dá)胸腺素β4。對(duì)于毛發(fā)生長周期不同階段的干細(xì)胞和他們的子代TA細(xì)胞而言，這些角質(zhì)細(xì)胞在時(shí)間和空間上的分布和Taylor等人在Cell 102453-461(2000)中介紹的類型一致。當(dāng)克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞從大鼠觸須囊的膨脹室中分離出來時(shí)，它進(jìn)一步被表征成干細(xì)胞的直接后代，并且當(dāng)它在體外培養(yǎng)時(shí)，能表達(dá)高水平的胸腺素β4。發(fā)現(xiàn)胸腺素β4能促進(jìn)毛發(fā)克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞的遷移，以及胞外基質(zhì)降解酶MMP-2的分泌。綜合考慮的話，這些結(jié)果表明除了已知的促進(jìn)血管生成和傷口愈合的特點(diǎn)外，胸腺素β4是毛發(fā)生長中自然出現(xiàn)的調(diào)節(jié)蛋白。
本申請公開的是一些方法，通過給受試者施用治療有效量的肽，可以促進(jìn)人和其他動(dòng)物的毛發(fā)生長，其中施用的肽含有胸腺素β4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合部分(“Tβ4”)，這一部分序列是胸腺素β4序列中能結(jié)合肌動(dòng)蛋白(如T-3或第17-22位殘基)或其它任何肌動(dòng)蛋白結(jié)合多肽的部分。在某些實(shí)驗(yàn)中，Tβ4以水凝膠混合物的形式進(jìn)行局部給藥。在一個(gè)沒有限制的實(shí)施例中，T-3是以治療有效量給藥的。
本公開內(nèi)容進(jìn)一步提供了一種最小的胸腺素β4序列片段，它和毛發(fā)生長相關(guān)，例如“T-3”片段(第17-23位殘基)或更短的肌動(dòng)蛋白結(jié)合序列(第17-22位殘基)。這些片段，或含有這些序列的肽，用來促進(jìn)人和其它動(dòng)物毛發(fā)的生長。在一些實(shí)施方案中，含有一種或多種這些序列的肽局部施用到將要處理的區(qū)域。在另外的實(shí)施方案中，該肽和附加的成分共同施用，附加的成分包括，但不限于抗菌藥，抗寄生蟲病藥，皮膚和/或頭發(fā)調(diào)理香波，肥皂，潤膚劑以及其它合適的成分。在另外的實(shí)施方案中，T-3與載體和/或膠共同施用。在另一些實(shí)施方案中，T-3與水凝膠共同施用。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，這些結(jié)合區(qū)用于促進(jìn)毛發(fā)生長。這些序列的變體或同源序列(如，保守和/或非保守性氨基酸替換)也可以考慮用于促進(jìn)毛發(fā)生長。此外，這些肽包括全長的Tβ4序列，在肌動(dòng)蛋白結(jié)合序列(殘基17-22)之外有一個(gè)或多個(gè)保守替換。肌動(dòng)蛋白結(jié)合多肽部分的聚體(例如Tβ4，T-3或含有Tβ4的第17-22位氨基酸序列的肽的二聚體和三聚體)也有促進(jìn)毛發(fā)生長的活性，和任何鍵合了一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合部分的融合分子一樣。因此，本公開內(nèi)容中有用的肌動(dòng)蛋白結(jié)合部分可以許多方式表達(dá)，包括大肽的一部分，融合分子的一部分，或以聚體或其組合的形式。
此外，在另一個(gè)實(shí)施方案中，將胸腺素β4外源添加到分離的克隆發(fā)生的毛囊干細(xì)胞中會(huì)導(dǎo)致遷移增加，以及增加細(xì)胞基質(zhì)金屬結(jié)合蛋白酶(MMP)活性(并且，具體而言，增加MMP-2水平)。在這個(gè)及相關(guān)實(shí)施方案中，毛囊干細(xì)胞被激活，能促進(jìn)分化但不能促進(jìn)擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，干細(xì)胞中對(duì)毛發(fā)生長重要的許多活性被增強(qiáng)了，包括遷移，蛋白酶產(chǎn)生和分化。
研究表明，sonic hedgehog可以促進(jìn)毛囊進(jìn)入生長期。Sato等人，“通過sonic hedgehog的局部瞬時(shí)表達(dá)，可以誘導(dǎo)出生后小鼠毛發(fā)的生長(Induction of the hair growth phase in postnatal mice by localizedtransient exprssion of Sonic hedgehog)”，J.Clin.Invest.104855-864(1999)。Shh信號(hào)傳導(dǎo)截?cái)嗪陀绊慦nt信號(hào)傳導(dǎo)，而Wnt信號(hào)傳導(dǎo)參與了毛發(fā)生長。Tβ4出現(xiàn)在克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞核中，有可能調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)。盡管不拘囿于任何理論，但在某些實(shí)施方案中，胸腺素β4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合部分能激活sonic hedgehog的表達(dá)，從而促進(jìn)毛囊進(jìn)入生長期。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)類似于胸腺素β4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，參與血管生成。由VEGF或胸腺素β4誘導(dǎo)的毛囊在尺寸上更大。參看Yano等人，“VEGF介導(dǎo)的血管生成對(duì)毛發(fā)生長和毛囊大小的控制(Control of hair growth and follicle size by VEGF-mediatedangiogenesis)”，J.Clin.Invest.107409-417(2001)。因此，在某些實(shí)施方案中，胸腺素β4序列，T-3或其他肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)通過促進(jìn)血管生成，能促進(jìn)毛發(fā)生長，和/或增加毛囊大小。本申請公開的肽也能和其他促進(jìn)毛發(fā)生長的組合物(可以是口服或局部施用)，如米諾地爾或finisteride組合使用(同時(shí)給藥或先后給藥)。盡管不拘囿于任何理論，但在某些實(shí)施方案中，胸腺素β4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合部分能激活VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)毛囊進(jìn)入生長期。
附圖簡述

圖1A-1D是大鼠皮膚組織學(xué)切片的顯微照片的數(shù)字圖像，顯示的是7天后，傷口逐漸閉合，以及用胸腺素β4處理皮膚后，傷口邊緣的其他毛囊。
圖2A-2D是顯微照片的數(shù)字圖像，顯示的是處理后7天，胸腺素β4的水凝膠刺激大鼠皮膚新的毛發(fā)生長。
圖3A-3D是顯微照片的數(shù)字圖像，顯示的是處理后30天，胸腺素β4的水凝膠刺激大鼠皮膚新的毛發(fā)生長。使用了蘇木精與伊紅(H&E)染色法。
圖4A和4B是顯微照片的數(shù)字圖像，顯示的是用胸腺素β4局部處理無胸腺裸小鼠30天后，生長活躍的毛囊數(shù)目增加。相對(duì)水凝膠的對(duì)照，也觀察到了毛囊數(shù)目增加。
圖5A-5D是顯微照片的數(shù)字圖像，顯示的是用0.05％胸腺素β4的水凝膠處理年老的小鼠7天后，它的毛囊發(fā)育增強(qiáng)。
圖6A和6B是皮膚樣品顯微照片的數(shù)字圖像，顯示的是胸腺素β4的七氨基酸片段(SEQ ID NO1的第17-23位氨基酸，即Leu Lys Lys ThrGlu Thr Gln，它在本發(fā)明被稱作T-3)，施用在水介質(zhì)中能刺激年老小鼠的毛囊發(fā)育增強(qiáng)。
圖7A-7F是顯微照片的數(shù)字圖像，顯示的是對(duì)照和胸腺素β4處理的動(dòng)物中皮膚組織外貌。圖7A-7C是對(duì)照介質(zhì)處理的皮膚。圖7D，7E是胸腺素β4處理的皮膚。圖7A，7D都表示的是處理7天后的大鼠皮膚。圖7B，7E表示的是處理7天后年老小鼠的皮膚。圖7C，7F表示的是處理35天后裸小鼠的皮膚。
圖8A-8C是顯微照片的數(shù)字圖像，顯示的是脫毛誘導(dǎo)毛發(fā)生長周期后的正常小鼠皮膚的組織外貌以及胸腺素β4表達(dá)細(xì)胞的免疫定位。(S＝皮脂腺；M＝毛母質(zhì)；AP＝豎毛?。患^指的是膨脹區(qū)的位置和胸腺素β4陽性染色細(xì)胞。)圖9A-9C是顯微照片的數(shù)字圖像，顯示的是不同角蛋白和胸腺素β4在克隆發(fā)生的干細(xì)胞中的分離、培養(yǎng)和表達(dá)，克隆發(fā)生的干細(xì)胞來自大鼠觸須。圖9A是顯微照片，表示的是膨脹區(qū)的位置，其中插圖/放大的照片表示的是抗角蛋白15抗體的免疫染色(角蛋白15是毛囊干細(xì)胞的分子標(biāo)準(zhǔn)。已知角蛋白5和14也能在干細(xì)胞中表達(dá))。圖9B所示的是6天后干細(xì)胞的培養(yǎng)。注意觀察到了兩群克隆發(fā)生的干細(xì)胞。圖9C是干細(xì)胞和胸腺素β4抗體的免疫染色。圖9D是克隆發(fā)生的干細(xì)胞和不同的角蛋白抗體的Western雜交圖，它表示的是角蛋白在分離的干細(xì)胞中的表達(dá)形式。注意角蛋白10沒有表達(dá)，它是終端分化的早期標(biāo)記，而角蛋白K5，K14和K15的出現(xiàn)是膨脹部衍生的干細(xì)胞的特征。
圖10A和10B是雜交圖和圖表，表示的是外源胸腺素β4能使克隆發(fā)生的大鼠觸須干細(xì)胞的角蛋白15mRNA的表達(dá)下降。對(duì)同一樣品進(jìn)行Northern雜交和定量分析也表示出來了。細(xì)胞從血清中耗盡16小時(shí)，然后在含或不含不同濃度胸腺素β4的情況下培養(yǎng)6小時(shí)。這種處理后，用RIPA緩沖液裂解處理的細(xì)胞，裂解液和抗K15抗體進(jìn)行免疫雜交(圖10A，上圖)。用抗GAPDH抗體作為探針重新檢測同一塊膜(圖10A，下圖)，然后用密度檢測術(shù)使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化(圖10B)。干細(xì)胞標(biāo)記K15表達(dá)的下降說明胸腺素β4通過加速毛囊干細(xì)胞分化而促進(jìn)毛發(fā)生長。
圖11A-11C是雜交圖和圖表，表示的是外源胸腺素β4能增加克隆發(fā)生干細(xì)胞中MMP-2的水平，但對(duì)MMP-9無效。酶法(zymographic)分析和定量分析也表示出來了。帶點(diǎn)的柱子代表的是細(xì)胞裂解液，而實(shí)心柱子代表的是條件培養(yǎng)基。
序列表氨基酸序列如附圖所示，它使用的是氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)三字代碼，如37C.F.R.1.822所定義的那樣。在附圖中，Tβ4的序列名是SEQ ID NO1Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys LeuLys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile GluGln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser。
若干實(shí)施方案的詳述縮寫和術(shù)語下面提供的術(shù)語和方法的解釋是為了更好地介紹本公開內(nèi)容，指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本公開內(nèi)容。如這里和隨附權(quán)利要求書中使用的那樣，單數(shù)形式“一個(gè)”，“一種”或“該”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文有明確說明。例如，“一種蛋白”包括多種這樣的蛋白，而“這種抗體”包括一種或多種抗體，及其本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的等同物等等。
除非有別的解釋，本公開內(nèi)容使用的全部科技術(shù)語和本公開內(nèi)容所在領(lǐng)域一名普通技術(shù)人員所理解的意思一樣。
縮寫℃(攝氏度)；H2O(水)；aa或AA(氨基酸)；bp(堿基對(duì))；kb(千堿基對(duì))；kD或kDa(千道爾頓)；gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；μl或μL(微升)；ml或mL(毫升)；mm(毫米)；nm(納米)；μm(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；μM(微摩爾)；U(單位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘)；hr(s)(小時(shí))；BSA(牛血清白蛋白)；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；PBS(磷酸緩沖液[150mM NaCl，10mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.2])；PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；RT(室溫)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；w/v(重量/體積)；v/v(體積/體積)；H&E(蘇木精與伊紅染色法)；HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)；HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)；Sigma(Sigma化學(xué)藥品公司，St.Louis MO)；AmericanHistolabs(American Histolabs，Gaithersburg，MD)；和Hawkeye Jensen，Inc.(Hawkeye-Jensen，Inc.Reading，PA)。
肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽一種能結(jié)合肌動(dòng)蛋白并且促進(jìn)毛發(fā)生長的肽，包括但不限于含有T-3氨基酸序列的肽，含有Tβ4中第17-22位氨基酸殘基序列的肽，含有氨基酸序列Leu Lys Lys Thr Asn Thr的肽，含有氨基酸序列Leu Lys Lys Thr Asn Thr Glu的肽，以及含有任何前述序列的肽，其中至多只有2個(gè)保守氨基酸被取代。通過實(shí)施例10所介紹的技術(shù)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能輕易地鑒定出其他相關(guān)肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽，這些肽可以用在本公開內(nèi)容中。例如，肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽可以定義為這樣的肽，它的血管芽生活性可以通過添加外源肌動(dòng)蛋白而被抑制。在一些實(shí)施方案中，有用的肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽和G-肌動(dòng)蛋白形成復(fù)合物，解離常數(shù)大于0.3μM，或更普遍的是大于0.5μM，或在0.5-2.5μM之間。
脫發(fā)癥從毛發(fā)應(yīng)該正常生長的地方脫發(fā)(即光禿或毛發(fā)稀少)。它的意思包括任何起因的脫發(fā)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該術(shù)語指的是頭發(fā)的脫落，盡管它的意思并不如此有限。事實(shí)上，這個(gè)術(shù)語包括的是全部或部分毛發(fā)脫落，或者在身體毛發(fā)正常生長的任何部位毛囊數(shù)或生長期毛囊數(shù)的下降。
化學(xué)合成這是一種人工方法，通過這種方法，人們能制造蛋白或肽。合成的蛋白或肽就是通過這種人工方法合成的。
包含該術(shù)語意思是“包括”。例如，“包含A或B”意思是指包括A，B或A和B都包括，除非另有明確說明。
增強(qiáng)提高某物的質(zhì)量，數(shù)量或力量。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果受試者的毛發(fā)脫落受到阻礙，停止或逆轉(zhuǎn)了(即毛囊數(shù)目上升了，或生長期毛囊數(shù)目上升了)，那這種處理就能增強(qiáng)或促進(jìn)受試者(如患有脫發(fā)或其他和脫發(fā)相關(guān)癥狀的人)毛發(fā)生長。促進(jìn)毛發(fā)生長也包括減少在根上或因?yàn)槌稊?脆弱而引起的脫發(fā)，例如，可以通過拉扯頭發(fā)測驗(yàn)進(jìn)行檢測?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的或本申請公開的任何方法檢測任何的增強(qiáng)，例如對(duì)處理的區(qū)域或受試者與對(duì)照進(jìn)行定量和定性比較。
片段Tβ4，T-3或任何其他肽的“片段”包括任何氨基酸殘基序列，它們短于全長氨基酸序列。因此，Tβ4的片段包括SEQ ID NO1序列中最多42個(gè)氨基酸氨基序列。同樣，T-3片段含有最多6個(gè)氨基酸殘基，這6個(gè)氨基酸殘基包含于本申請定義的T-3序列中。
毛發(fā)是一種特化的角質(zhì)結(jié)構(gòu)，它衍生自表皮上皮細(xì)胞凹陷或者說是從表皮上皮細(xì)胞凹陷中前突出來的，這種凹陷可以在動(dòng)物中，包括哺乳動(dòng)物中觀察到。因此，這個(gè)術(shù)語的意思也包括不同的非人動(dòng)物的皮毛(如軟毛)。
同源的描述的是相關(guān)的蛋白。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，該術(shù)語被用來代表本申請公開的不同的肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽，以及其他具有相似序列，結(jié)構(gòu)，功能和/或其他特征的蛋白/肽。參看定義“序列同一性/相似性”中的討論。
水凝膠任何水凝膠都含有不同的聚體。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，許多獨(dú)占的水凝膠劑型都是已知的。在某些實(shí)施方案中，使用了交聯(lián)聚體凝膠的水凝膠片。不同來源的水凝膠也被考慮用于本發(fā)明方法和組合物中，包括但不限于商業(yè)上購買到的水凝膠，包括那些適用在傷口上水凝膠，如TEGAGEL(3M)，VIGILON(Bard)，CLEARSITE(Conmed)，AQUASORB(DeRoyal)，F(xiàn)LEXDERM(Bertek[Dow Hickam])，NU-GEL(Johnson&Johnson)，CURAGEL(Kendall)，DERMA-GEL(Medline Industries)，F(xiàn)LEXIGEL(Smith&Nephew)，SMARTHYDROGELTM(MedLogic Global，United Kingdom)，和0.2％的聚丙烯酸(Hawkeye-Jensen，Reading PA)。
局部的“局部化的”和“局部的”指的是有限的面積。因此，和“全身”的處理相反，在全身性處理中，整個(gè)身體都參與了(通常通過血管系統(tǒng)和/或淋巴系統(tǒng))，“局部處理”涉及的是特定的有限的面積。因此，在本申請的一些實(shí)施方案中，利用本公開內(nèi)容的方法和組合物對(duì)分散的區(qū)域進(jìn)行局部的處理。
可藥用載體任何已知用于本領(lǐng)域中傳遞藥物，藥品等給受試者的介質(zhì)。因此，可藥用載體可能特別適合在局部施用傳遞，包括但不限于水凝膠，乳膏劑，洗劑，洗發(fā)劑，潤滑劑，85％乙醇/15％乙二醇，軟膏，噴霧劑，油，調(diào)味品，糊狀物，滴劑，藥膏，脂質(zhì)體等。
多肽或僅僅是肽，指的是聚體，其中單體是通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基。當(dāng)氨基酸是α氨基酸時(shí)，L-光學(xué)異構(gòu)體或D-光學(xué)異構(gòu)體都可以使用，而L-光學(xué)異構(gòu)體是優(yōu)選的。本申請中使用的“多肽”或“蛋白”意思包括任何氨基酸序列，也包括修飾的氨基酸序列如糖蛋白。術(shù)語“多肽”和“肽”特定的意思是涵蓋天然發(fā)生的蛋白，以及通過重組或合成產(chǎn)生的蛋白。因此，Tβ4，含有Tβ4第17-22位氨基酸殘基序列的肽T-3，或含有這些序列中任何一條的聚體都可以通過重組方法合成，其宿主包括細(xì)菌或酵母細(xì)胞。
術(shù)語“多肽的功能性片段”指的是保持多肽活性的所有多肽片段，如Tβ4。例如，生物功能片段在大小上有變化，它可以小到能夠結(jié)合抗體分子的表位這么小，大到和參與細(xì)胞中特征誘導(dǎo)或表型變化編程的多肽一樣大，而表型變化包括細(xì)胞增殖或分化。“表位”是多肽中能結(jié)合免疫球蛋白的區(qū)域，免疫球蛋白是由于和抗原接觸發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的。
術(shù)語“可溶的”指的是一種多肽形式，這種多肽沒有插入細(xì)胞膜。本申請公開的多肽是可溶性多肽。
本申請中使用的術(shù)語“基本純化的多肽”指的是基本上沒有其它蛋白，脂質(zhì)，碳水化合物或其他在天然條件下與其相連的物質(zhì)的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽至少有50％，如至少80％不含其它蛋白，脂質(zhì)，碳水化合物或其他在天然條件下與該多肽相連的物質(zhì)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，多肽至少有90％不含其它蛋白，脂質(zhì)，碳水化合物或其他在天然條件下與該多肽相連的物質(zhì)。仍然在另外一個(gè)實(shí)施方案中，多肽有至少95％不含其它蛋白，脂質(zhì)，碳水化合物或其他在天然條件下與該多肽相連的物質(zhì)。
保守替換是用另一個(gè)在大小、疏水性等方面相似的氨基酸取代一個(gè)氨基酸。保守替換的例子如下表所示。
原始?xì)埢Ｊ匦匀〈鶤la Ser，GlyArg LysAsn Gln，HisAsp GluCys SerGln Asn，GluGlu AspHis Asn，GlnIle Leu，ValLeu Ile，Val，ArgLys Arg，Gln，GluMet Leu，Ile，ValPhe Met，Leu，Tyr
SerThrThrSerTrpTyrTyrTrp，PheValIle，LeucDNA序列的變異會(huì)導(dǎo)致氨基酸的改變，不管保守與否，因此，為了保持編碼蛋白的功能和免疫同一性，理想的情況是將這種變異降到最小。因此，在若干非限制性的實(shí)施例中，一個(gè)變異的多肽包括最多2個(gè)，最多5個(gè)，最多10個(gè)，最多20個(gè)，或最多40個(gè)保守性取代。該蛋白的免疫同一性可以通過確定該蛋白是否能被抗體識(shí)別而得以評(píng)估；能被這種抗體識(shí)別的變體是免疫保守的。任何cDNA序列變體優(yōu)選的是導(dǎo)入不超過20個(gè)，更優(yōu)選的是導(dǎo)入不超過10個(gè)氨基酸取代到編碼多肽中。例如，變異的氨基酸序列和天然的氨基酸序列有80％，90％或甚至于95％或98％的同一性。
促進(jìn)用本文解釋“增強(qiáng)”的同樣方法來解釋這個(gè)術(shù)語。
樣品和標(biāo)本在本說明書和權(quán)利要求書中，這些術(shù)語以其最廣的意思使用。這些術(shù)語包括從人和其它動(dòng)物中獲得的所有類型的樣品，包括但不限于體液，如尿液，血液，排泄物，腦脊液，精液和唾液，以及實(shí)體組織和毛發(fā)。然而，這些例子并不解釋成限制適用于本公開內(nèi)容中的樣品類型。
序列同一性/相似性兩個(gè)或多個(gè)核酸序列，或兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列之間的同一性/相似性用序列之間的同一性/相似性來表示。序列同一性根據(jù)同一性的百分率來檢測；百分率越高，序列就越有同一性。序列相似性根據(jù)相似性的百分率來檢測(相似性要考慮保守的氨基酸取代)；百分率越高，序列就越有相似性。
序列對(duì)比的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。不同的程序和排列算法在下列文獻(xiàn)中介紹了Smith & Waterman，Adv，Appl.Math，2482(1981)；Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)；Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.852444(1988)；Higgins & Sharp，Gene，73237-44(1988)；Higgins & Sharp，CABIOS 5151-3(1989)；Corper等人，Nuc.Acids.Res.1610881-90(1988)；Huang等人，Computer Appls.Inthe Biosciences 8155-165(1992)；和Pearson等人，Meth.Mol.Bio.24307-31(1994)。Altschul等人在J.Mol.Biol.215403-10(1990)中對(duì)序列排列方法和同源性計(jì)算提出了詳細(xì)地考量。
可以通過若干渠道，包括國家生物信息中心(NCBI，國家醫(yī)學(xué)圖書館，38A樓，房間8N805，Bethesda，MD20894)和互聯(lián)網(wǎng)獲得NCBI基本局部比對(duì)檢索工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-10(1990))，它可以和序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx一塊使用。其他信息可以從NCBI網(wǎng)址中找到。
為了比較多于約30個(gè)氨基酸的氨基酸序列，利用參數(shù)設(shè)置成默認(rèn)值的BLOSUM62矩陣，對(duì)兩段序列進(jìn)行Blast對(duì)比，(存在空隙值記為11，每個(gè)殘基空隙值記為1)。當(dāng)比對(duì)短肽時(shí)(小于約30個(gè)氨基酸)，采用參數(shù)設(shè)置成默認(rèn)值的PAM30矩陣(開放空隙罰9分，延伸空隙罰1分)，對(duì)兩段序列功能進(jìn)行Blast比對(duì)。當(dāng)用這種方法評(píng)估時(shí)，和參比序列相似性更高的蛋白表示出上升的同一性，如至少70％，如75％，80％，85％，90％，95％或者甚至于99％的同一性。當(dāng)部分序列進(jìn)行序列同一性比較時(shí)，在10-20個(gè)氨基酸的短窗口中，同源物通常具有至少75％的序列同一性，例如根據(jù)它們和參比序列的同一性，序列同一性至少是85％，90％，95％或98％。在這么短的窗口中確定序列同一性的方法在NCBI的網(wǎng)址中介紹了。
蛋白同源物的典型的特征是占有至少70％，如至少75％，80％，85％，90％，95％或甚至于98％的序列同一性，利用NCBI Basic Blast2.0，用氨基酸序列計(jì)算全長比對(duì)，用如nr或swissprot的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行有空隙的blastp。用DUST(Hancock和Armstrong，Comput.Appl.Biosci.1067-70(1994))過濾通過blastn程序搜索到的查詢。其他程序使用SEQ。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到提供的這些序列同一性范圍只是用作指南，不在所提供的范圍之內(nèi)，也可獲得很有意義的同源物。上述肽的同源物以及編碼這種同源物的核酸序列在本申請中提供了。
盡管如此，沒有表示高度同一性的核酸序列也能編碼相同或相似(保守)的氨基酸序列，因?yàn)檫z傳密碼具簡并性。利用簡并性可以對(duì)核酸序列加以改變，從而得到多個(gè)核酸分子，但它們編碼基本一樣的蛋白。這種同源肽，通過這種方法確定的序列同一性例如至少有75％，80％，90％，95％，98％或99％。例如，當(dāng)部分序列對(duì)序列同一性加以比較時(shí)，同源物在10-20個(gè)氨基酸的短窗口中，例如至少有75％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性。在這么短的窗口中確定序列同一性的方法在NCBI網(wǎng)址中可以找到。本領(lǐng)域的任何一個(gè)技術(shù)人員都會(huì)意識(shí)到提供的這些序列同一性范圍只是用作指南，不在所提供的范圍之內(nèi)，也可能獲得很有意義的同源物或其他變體。
受試者活的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物，它包括人和獸類受試者，例如哺乳動(dòng)物，嚙齒類動(dòng)物和鳥類。
治療有效量足以達(dá)到想要的生物效應(yīng)的數(shù)量，例如，能有效促進(jìn)毛發(fā)生長的數(shù)量。在特定的實(shí)施例中，治療有效量指的是能有效促進(jìn)比如對(duì)其給藥的受試者或者其他任何含有毛囊的有生命或非生命的樣品毛發(fā)生長的Tβ4，T-3或其他肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽的濃度。
在一個(gè)療程中，治療有效量可以一次劑量給藥，也可以若干劑量給藥。
本申請公開的方法在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用相同。因此，一個(gè)總的術(shù)語“正在處理的受試者”應(yīng)該被理解可以包括所有的動(dòng)物(如人，猿，狗，貓，馬和母牛)，它們需要增加期望的生物效應(yīng)，如促進(jìn)毛發(fā)生長，增加克隆發(fā)生干細(xì)胞的遷移，增加干細(xì)胞遷移或增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶活性。
治療有效的同源物以某個(gè)“治療有效量”促進(jìn)受試者毛發(fā)生長的同源序列。
胸腺素β4一種43個(gè)氨基酸的小蛋白(Ser Asp Lys Pro Asp Met AlaGlu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu LysAsn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly GluSer，SEQ ID NO1)。這個(gè)術(shù)語的意思包括天然的，重組的和合成的胸腺素β4。本申請也稱作Tβ4或Tβ4。
T-37個(gè)氨基酸序列Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln，對(duì)應(yīng)于全長Tβ4(即SEQ ID NO1)的第17-23位氨基酸。這個(gè)術(shù)語的意思包括天然的，重組的和合成的T-3。
局部應(yīng)用在皮膚，粘膜，內(nèi)臟，毛發(fā)等表面應(yīng)用。換句話說，不是通過攝取或注射。
局部活性劑一種物質(zhì)或組合物，它在應(yīng)用部位能引起藥物反應(yīng)或生物效應(yīng)。
變體“變體”指的是同源肽。
胸腺素β4的“變體”指的是和編碼胸腺素β4的序列相似的氨基酸序列，它在一個(gè)或多個(gè)氨基酸上發(fā)生了改變(即和SEQ ID NO1中提出的序列相比較而言)。因此，“變體”和Tβ4有不到100％的序列同一性。變體有“保守的”改變，其中取代的氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)(如用異亮氨酸取代亮氨酸)。更罕見的事，變體有“非保守的”變化(例如，用色氨酸取代甘氨酸)。相似的一些小的變異也包括氨基酸缺失或插入，或兩者都有。利用本領(lǐng)域眾所周知的以及上述“序列同一性/相似性”中所討論的計(jì)算機(jī)程序，可以發(fā)現(xiàn)指南，這種指南用于確定哪個(gè)氨基酸殘基被取代、插入或缺失，而不會(huì)破壞它的生物或免疫活性。
同樣，T-3的變體是和胸腺素β4第17-23位氨基酸片段相似的序列，但在一個(gè)或多個(gè)氨基酸上發(fā)生了改變。和胸腺素β4的變體一樣，這種變化可以是保守的，也可以是非保守的。
采用同樣的方式，本申請介紹的任何氨基酸序列或片段都有“變體”。
描述本公開內(nèi)容涉及適合促進(jìn)人和其它動(dòng)物的毛發(fā)生長的方法和組合物。具體而言，本公開內(nèi)容提供含有肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽的組合物。在一些實(shí)施方案中，肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽含有胸腺素β4的片段。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供的組合物含有一個(gè)或多個(gè)胸腺素β4片段和/或別的適合治療禿發(fā)癥和其他與脫發(fā)相關(guān)的癥狀的肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供的組合物含有胸腺素β4中能結(jié)合肌動(dòng)蛋白的6或7個(gè)氨基酸序列。
胸腺素β4是一種43個(gè)氨基酸的小蛋白(Ser Asp Lys Pro Asp MetAla Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln GluLys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly GluSer，SEQ ID NO1)(Low和Goldstein，J.Biol.Chem.，2571000(1982))。在不同的組織和細(xì)胞類型中，它的濃度從1×10-5到5.6×10-1。胸腺素β4是胸腺素組分5(TF5)的一個(gè)小的組分(典型的大約是1％)，其中胸腺素組分5是從不同動(dòng)物胸腺(例如，牛，豬，鼠，公山羊，大鼠，小雞和人)中制備的多肽的部分純化混合物?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的任何適合的方法來制備TF5。已知TF5由至少40-50個(gè)不同的多肽組成，這些多肽可以在等電聚焦的聚丙烯酰胺凝膠(pH3.5-9.5)中觀察到，它基本上不含脂質(zhì)，碳水化合物和內(nèi)毒素。參看Hooper等人，Ann.NY.Acad.Sci.249125(1975)。TF5在胸腺缺乏或免疫缺陷的動(dòng)物，具原發(fā)性免疫缺乏的人，和免疫抑制的癌癥患者中能有效地重建免疫功能。
胸腺素β4能和G-肌動(dòng)蛋白相互作用，而且是細(xì)胞中主要的肌動(dòng)蛋白隱蔽蛋白(sequestering protein)。胸腺素β4對(duì)體外內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞遷移以及體內(nèi)血管生成有活性。胸腺素β4也能極大加速正常動(dòng)物或受損愈合模型(即膽固醇處理的大鼠，糖尿病的小鼠，以及年老的小鼠)大鼠皮膚的全層傷口修復(fù)。在用胸腺素β4局部或全身給藥的動(dòng)物中，傷口的深度和寬度會(huì)顯著降低。此外，膠原沉積上升，可能是因?yàn)樵缙趥诘难?yīng)增加。胸腺素β4的濃度在血小板中的濃度是最高的，這些血小板位于第一種進(jìn)入傷口并釋放顆粒內(nèi)含物的細(xì)胞中，顆粒中含有修復(fù)因子和負(fù)責(zé)募集其他細(xì)胞到傷口部位來的分子。然而，為了使用本公開內(nèi)容中的方法和組合物，沒必要知道機(jī)制。
胸腺素β4在傷口液體中也有。它和其他修復(fù)因子如生長因子不同在于(1)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞遷移，(2)不會(huì)和基質(zhì)結(jié)合，分子量非常低(使得它能通過組織擴(kuò)散相對(duì)遠(yuǎn)的距離)，而且(3)不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞生長。
外源添加胸腺素β4或其肌動(dòng)蛋白結(jié)合片段到分離的克隆發(fā)生的毛囊干細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致遷移增加，和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性的增強(qiáng)(和具體而言，是增強(qiáng)MMP-2水平)。因此，毛囊干細(xì)胞被激活，促進(jìn)分化但不是增殖。通過本申請公開的方法，干細(xì)胞中許多對(duì)毛發(fā)生長重要的活性被增強(qiáng)了，包括遷移，蛋白酶產(chǎn)生和分化。
sonic hedgehog已顯示可以促進(jìn)毛囊進(jìn)入生長期。Sato等人，“通過sonic hedgehog的局部瞬時(shí)表達(dá)，可以誘導(dǎo)出生后小鼠的毛發(fā)生長期(Induction of the hair growth phase in postnatal mice by localizedtransient expression of Sonic hedgehog)”，J.Clin.Invest.104855-864(1999)。Shh信號(hào)傳導(dǎo)截?cái)嗪陀绊慦nt信號(hào)傳導(dǎo)(signaling)，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)參與了毛發(fā)生長。Tβ4出現(xiàn)在克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞核中，有可能調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)。盡管不拘囿于任何理論，但在某些實(shí)施方案中，胸腺素β4激活sonic hedgehog的表達(dá)，從而促進(jìn)毛囊進(jìn)入生長期。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)類似于胸腺素β4，參與血管生成。由VEGF或胸腺素β4誘導(dǎo)的毛囊在尺寸上更大。參看Yano等人，“VEGF介導(dǎo)的血管生成對(duì)毛發(fā)生長和毛囊大小的控制(Control of hair growthand follicle size by VEGF-mediated angiogenesis)”，J.Clin.Invest.107409-417(2001)。因此，在某些實(shí)施方案中，胸腺素β4的片段，T-3或其他肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽通過促進(jìn)血管生成能促進(jìn)毛發(fā)生長和/或增加毛囊大小。盡管不拘囿于任何理論，但在某些實(shí)施方案中，Tβ4能激活VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成和毛發(fā)生長。
最近，另一個(gè)在毛囊中表達(dá)的血管生成分子肝細(xì)胞生長因子也被發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)毛發(fā)生長。Grant等人，“分散因子在體內(nèi)能誘導(dǎo)血管形成(Scatter factor induces blood vessel formation in vivo)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 901937-1941(1993)；Lee等人，“在毛囊中表達(dá)的肝細(xì)胞生長因子(HGF)激活劑在體外參與依賴HGF的毛囊延長(Hepatocyte growthfactor(HGF)activator expressed in hair follicles is involved in in vitroHGF-dependent hair follicle elongation)”J.Dermatol.Sci.25156-163(2001)；Lindner等人，“肝細(xì)胞生長因子/分散因子以及met受體信號(hào)傳導(dǎo)參與毛囊形態(tài)形成和循環(huán)(Involvement of hepatocyte growthfactor/scatter factor and met receptor signaling in hair folliclemorphogenesis and cycling)”，F(xiàn)ASEB，J.，14319-332(2000)。肝細(xì)胞生長因子也能正調(diào)節(jié)胸腺素β4的表達(dá)。Oh等人，“人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中，肝細(xì)胞生長因子正調(diào)節(jié)胸腺素β4(Hepatocyte growth factorupregulates thymosin beta4 in human umbilical vein endothelial cells)”，Biochem.Biophys.Res.Commun.296401-405(2002)。因此，如果利用肝細(xì)胞生長因子促進(jìn)毛發(fā)生長是通過增加胸腺素β4和/或與它協(xié)同而發(fā)揮作用的話，那事實(shí)上可能模仿或復(fù)制了本申請公開的方法。
此外，也利用類固醇來治療某些類型的脫發(fā)。Shapiro等人，“毛發(fā)重新生長的治療劑(Hair regrowth.Therapeutic agents)”，Dermatol.Clin 16341-356(1998)。胸腺素β4是一種抗炎分子，在類固醇處理的單核細(xì)胞中鑒定出了這類分子。Young等人，Nat.Med.51424-1427(1999)。因此，用類固醇處理也可能涉及胸腺素β4在毛發(fā)生長上的作用。
所有這些數(shù)據(jù)支持的結(jié)論和結(jié)果表明胸腺素β4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)是天然出現(xiàn)的傷口修復(fù)因子和angiogen，即毛發(fā)生長的促進(jìn)劑和調(diào)節(jié)劑。
如實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)介紹的那樣，在本方法和組合物的開發(fā)過程中，在雌性大鼠中進(jìn)行了傷口愈合試驗(yàn)。在這些試驗(yàn)中，在傷口上涂了一些含胸腺素β4的水凝膠制劑(0.2％聚丙烯酸)。對(duì)照動(dòng)物只是涂了水凝膠。當(dāng)受傷后第7天觀察傷口時(shí)，發(fā)現(xiàn)傷口部位周圍的毛發(fā)生長顯著增加?？雌饋砻l(fā)生長得比該動(dòng)物其它剃刮區(qū)域的毛發(fā)要長和濃密。7天后，動(dòng)物被殺死，制備涂了水凝膠的區(qū)域的組織切片，用本領(lǐng)域已知的方法(蘇木紫與伊紅染色以及Masson氏三色染色)染色。如圖1所示，在用胸腺素β4處理的愈合傷口邊緣，觀察到毛囊數(shù)增加。
此外，實(shí)施例2介紹的試驗(yàn)是為了直接測試胸腺素β4對(duì)正常(即沒受傷)雌性大鼠皮膚局部給藥的效果。在試驗(yàn)最后，殺死動(dòng)物，組織切片泡在10％緩沖的福爾馬林中，用標(biāo)準(zhǔn)的組織染色方法進(jìn)行染色。如圖2和圖3所示，胸腺素β4在處理后的第7和第30天能刺激新的毛發(fā)生長。皮膚所有別的方面在處理后第30天看起來沒受影響，只在表皮上有一點(diǎn)小變化，或在真皮厚度上有點(diǎn)變化。
在實(shí)施例3中詳細(xì)介紹的進(jìn)一步試驗(yàn)中，測試了無胸腺的雌性裸小鼠，以確定胸腺素β4是否能促進(jìn)小鼠后背毛發(fā)生長。毛發(fā)生長可以用肉眼觀察。在處理過的皮膚上，沒有觀察到毛發(fā)生長增強(qiáng)或別的差異，和用不含胸腺素β4的對(duì)照(即水凝膠)處理的皮膚完全一樣。
此外，檢測了胸腺素β4對(duì)26個(gè)月齡的年老雌性BALB/c小鼠的效果。清晰地觀察到了新的毛囊發(fā)育，如圖5所示。在對(duì)這些年老小鼠的進(jìn)一步試驗(yàn)中，測試了胸腺素β4的合成片段刺激毛發(fā)生長的能力，該片段含有7個(gè)氨基酸序列T-3。該結(jié)果表明該片段能促進(jìn)毛囊的發(fā)育，超過單獨(dú)用水觀察到的毛囊發(fā)育。因此，胸腺素β4的片段，包括含有這個(gè)片段的多肽，也被考慮用于毛發(fā)再生組合物中。
公開的方法能促進(jìn)年老小鼠和裸小鼠的毛發(fā)生長。總之，毛發(fā)看起來很粗糙，根據(jù)處理過的皮膚上大毛囊的相對(duì)數(shù)目，這在組織水平上很明顯。當(dāng)檢查胸腺素β4在新激活的毛囊中的分布時(shí)，發(fā)現(xiàn)它在膨脹部表達(dá)，而隨著毛囊生長活躍，它在細(xì)胞亞群中開始表達(dá)，這些細(xì)胞亞群從膨脹部遷移到球形部，毛發(fā)開始在球形部活躍生長。分離的克隆發(fā)生的毛囊干細(xì)胞能產(chǎn)生胸腺素β4。當(dāng)胸腺素β4被外源加入這些細(xì)胞時(shí)，可以觀察到遷移加快以及MMP-2水平上升。這些數(shù)據(jù)表明胸腺素β4通過激活毛囊肝細(xì)胞而促進(jìn)毛囊生長。此外，公開的方法和組合物能增強(qiáng)干細(xì)胞中對(duì)毛發(fā)生長重要的許多活性，包括遷移，蛋白酶產(chǎn)生和分化。
因?yàn)門-3的7個(gè)氨基酸序列包括了一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，因此其他含有肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)的肽也可用來促進(jìn)毛發(fā)生長。這個(gè)序列的同源物以及胸腺素β4序列SEQ ID NO1的片段(例如在肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)有保守或非保守性氨基酸取代，或?qū)ｉT在肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)之外)也可以考慮用來促進(jìn)毛發(fā)生長。任何能保持電荷或疏水性的氨基酸保守取代，如賴氨酸取代精氨酸，蘇氨酸取代絲氨酸，或亮氨酸取代精氨酸都將保持肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)或含有肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)的片段的活性。例如，其他含有T-3序列或SEQ ID NO1第17-22位殘基的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白包括，但不限于不同的β胸腺素或其片段(如Tβ4Ala，Tβ4Xen，Tβ9，Tβ9Met，Tβ10，Tβ11，Tβ12，Tβ12鱸魚，Tβ海膽，Tβ13(前面介紹的所有這些都含有T-3序列，Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln)，以及Tβ扇貝和Tβ14(含有序列Leu Lys Lys Thr Asn Thr Glu))都可以用于本申請內(nèi)容。別的例子是一些含有T-3(第17-23位殘基)或SEQ ID NO1第17-22位殘基的肽，其每條序列都有1-2個(gè)保守取代。相似的肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽的例子可以在Tβ斑馬魚(含有序列Leu Arg Lys Thr Glu Thr Gln)和Tβ15(含有序列Leu Lys Lys Thr Asn Thr)中找到。因此，事實(shí)上，任何已知的β胸腺素或其片段含有可用于本申請的肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元。參看Huff等人，“β胸腺素，具多種功能的小酸性肽(β-Thymosins，small acidicpeptides with multiple functions)”，Intl.J.Biochem.& Cell Bio.33205-220(2001)(定義的β胸腺素縮寫，及提供的序列，一些序列在表2中也復(fù)制了)。對(duì)這些不同序列的比較也提供了關(guān)于氨基酸取代的指南，這種取代可以在Tβ4肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)中進(jìn)行，同時(shí)保持它的治療活性。例如，在第1，3和4位的殘基看起來是高度保守的，因此，不太可能被取代。
此外，本領(lǐng)域已知的促進(jìn)小肽活性的方法可以和能促進(jìn)毛發(fā)生長的公開序列組合使用。這些方法可以提高這種肽在受試者中的半壽期，或增加它用于其他原因的活性。例如，可以使用本領(lǐng)域已知的不同的融合分子。不同分子量的聚乙二醇(“PEGs”)，尤其是那些分子量介于3000-9000gm/mol的聚乙二醇，其能轉(zhuǎn)變成氨基聚乙二醇(“APEG”)，可以和短肽偶聯(lián)，導(dǎo)致活性增加，這和Kawasaki等人在“[Arg-Gly-Asp]-[氨基聚乙二醇]雜合分子的制備及其對(duì)實(shí)驗(yàn)性癌癥轉(zhuǎn)移的抑制效果(Preparation of[Arg-Gly-Asp]-[Amino-poly(ethyleneglycol) hybrids and their inhibitory effect on experimental metastasis])”，Chem.Pharm.Bull.3373-3375(1991)中介紹的一樣。如Hojo等人在“抗轉(zhuǎn)移的層粘連蛋白相關(guān)肽的殼聚糖雜合分子的制備(Preparation of achitosan hybrid of an antimetastatic laminin-related peptide)”，Pharm.Pharmacol.Commun.5277-280(1999)中所介紹的那樣，可以將殼聚糖連接到肽上，從而使其活性增強(qiáng)。同樣的處理對(duì)牛血清白蛋白，葡萄球菌蛋白A(參看Maeda等人，J.Biochem.115182-189(1994))，纖維粘連蛋白和任何正常的血清蛋白也是真實(shí)的。因此，將本申請公開的肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元融合到別的分子上同樣會(huì)導(dǎo)致受試者體內(nèi)毛發(fā)生長活性增強(qiáng)。
其他用來增加小肽活性的方法也能增加本申請公開的用于促進(jìn)毛發(fā)生長的序列的活性。肽序列線性或分支的聚體單獨(dú)或和融合分子共同作用能增加活性。本領(lǐng)域已知多種不同方法通過形成聚體可以增強(qiáng)活性。參看Kawasaki等人，Biochem.and Biophys.Res.Comm.1741159-1162(1991)；Nomizu等人，Cancer Res.533459-3461(1993)；Saiki等人，Br.J.Cancer.59194-197(1989)；Murata等人，Int.J.Biol.Macromol.1197-99(1989)；Saiki等人，Cancer Res.493815-3822(1989)。因此，通過制備包含這些序列的聚體或共聚體和任選將這些聚體與另一分子融合，本申請中公開的氨基酸序列的活性可以增強(qiáng)。這樣的結(jié)構(gòu)包括(T-3)n，(T-3)n-APEG，(T-3)2，(Tβ4)n，(T-3)m-(Tβ4)n，(Leu Lys Lys Thr Asn Thr)n，[(Leu Lys Lys Thr Asn Thr)-(Leu LysLys Thr Asn Thr Gln)]n，(Leu Lys Lys Thr Asn Thr Gln Glu)n，(Leu LysLys Thr Asn Thr Glu)n，(T-3)-Cys-Cys-(T-3)，Cys-(T-3)n-Cys[通過二硫鍵環(huán)化]，[Ac-(T-3)]8Lys4Lys2LysGly-OH等，在這些結(jié)構(gòu)中，n代表的數(shù)字大于1，如整數(shù)(例如2)或分?jǐn)?shù)(例如2.5)。在某些特定的實(shí)施例中，聚體是線性的，具有重復(fù)基元Leu Lys Lys Thr Asn Thr或Leu Lys LysThr Asn Thr Gln，而且在一些實(shí)施例中，n大于2而小于100，例如2-50或2-10。重復(fù)基元可包括在多肽中，該多肽中除了重復(fù)基元外，還包括氨基酸序列。
因?yàn)楸旧暾埞_的內(nèi)容分離和提供了不同肽的活性區(qū)，而不僅僅是全長的，天然存在的蛋白如Tβ4，根據(jù)公開的方法可以獲得某種好處，在這些方法中，使用了更短的肽。這種好處包括有助于更簡單和更經(jīng)濟(jì)地合成活性肽，這些肽比天然的全長蛋白要短。另一個(gè)好處是肽越短，活性越高，因?yàn)橥瑯幽柕闹亓?，活性相似，而在某些情況下，短肽在作用部位有更好的穿透力或生物藥效率。本方法甚至能使天然蛋白的活性增強(qiáng)，例如，通過使用含有一個(gè)以上活性位點(diǎn)的肽。
為了證明并進(jìn)一步例證本公開內(nèi)容的某些實(shí)施方案和許多方面，提供了下列實(shí)施例，這些實(shí)施例不可理解成對(duì)其范圍的限制。
實(shí)施例1大鼠毛發(fā)生長的證明本實(shí)施例是為了證明胸腺素β4對(duì)大鼠毛發(fā)生長的促進(jìn)。在對(duì)雌性大鼠進(jìn)行傷口愈合研究過程中，開發(fā)了一種含有胸腺素β4的水凝膠制劑。具體而言，在0.2％水凝膠(聚丙烯酸，Hawkeye-Jensen公司)中制備0.05％胸腺素β4的制劑。使用棉棒作為涂藥器，將這種制劑涂在傷口上。對(duì)照動(dòng)物只涂水凝膠。
在實(shí)驗(yàn)開始前，將測試的大鼠刮剃一次，以在它們背上去掉盡可能多的毛發(fā)，使得試劑和對(duì)照介質(zhì)能穿透。在8周齡的Sprague Dawley大鼠背上開了6個(gè)全層8mm切口大小的傷口，每3個(gè)大鼠一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。在受傷的當(dāng)天和受傷后48小時(shí)，用棉棒將濃度大致為25μg/50μl胸腺素β4的水凝膠涂在傷口上。涂藥的確切體積依靠估計(jì)，但藥要涂成一薄層。水凝膠很難正好涂在傷口上，因此相鄰的組織和水凝膠接觸。當(dāng)肉眼檢查傷口時(shí)，清楚地觀察到傷口周圍的毛發(fā)生長加速。和動(dòng)物其他刮剃區(qū)域周圍毛發(fā)相比，觀察到傷口周圍的毛發(fā)生長得又長又密。7天后，殺死動(dòng)物，涂藥區(qū)域的組織切片用10％的福爾馬林緩沖液固定，并用本領(lǐng)域眾所周知的染色方法染色(蘇木紫與伊紅染色和Masson氏三色染色，Histoserv，Gaithersburg，MD)。如圖1所示，組織學(xué)數(shù)據(jù)表明，相對(duì)用對(duì)照水凝膠處理的動(dòng)物和未處理的動(dòng)物而言，在用胸腺素β4處理的動(dòng)物中，毛囊數(shù)目增加。
實(shí)施例2胸腺素β4對(duì)正常大鼠的作用這個(gè)實(shí)施例證明的是胸腺素β4局部給藥時(shí)，對(duì)正常(未受傷)的雌性大鼠的作用。在這些實(shí)驗(yàn)中，利用了8周齡的雌性Sprague Dawley大鼠。每周3次(周一，周三和周五)，將濃度為0.5mg/ml胸腺素β4的水凝膠涂在動(dòng)物刮剃過的背上。在30天內(nèi)對(duì)動(dòng)物的毛發(fā)進(jìn)行觀察。在處理開始后7天殺死其中一些動(dòng)物，而另一些動(dòng)物在處理開始后30天殺死。利用本領(lǐng)域眾所周知的方法制備組織切片，如實(shí)施例1介紹的那樣。一個(gè)在皮膚病學(xué)方面受過訓(xùn)練的觀察者以事先未知的方式(blind)將組織切片全部觀察和比較一遍。
如圖2所示，發(fā)現(xiàn)胸腺素β4在第7天能促進(jìn)新的毛發(fā)生長。此外，如圖3所示，在涂藥后30天，胸腺素β4也能刺激新的毛發(fā)生長。皮膚所有別的方面在處理后30天看起來不受影響，在表皮上或在真皮厚度上幾乎沒有變化。膠原沉積沒有觀察到上升，而血管數(shù)目看起來也沒有變化，盡管觀察到炎性細(xì)胞數(shù)目增加了。
實(shí)施例3胸腺素β4對(duì)雌性小鼠皮膚的作用該實(shí)施例證明的是胸腺素β4對(duì)無胸腺的雌性裸小鼠皮膚的作用。無胸腺的雌性裸小鼠在皮膚上看不到毛發(fā)，但卻有一些毛囊，用它們來測試看看胸腺素β4是否能促進(jìn)毛發(fā)生長。用胸腺素β4處理35天，每周3次(濃度和前面的實(shí)施例中一樣)，用肉眼可以觀察到毛發(fā)生長，并且通過組織學(xué)方法觀察到新的毛囊數(shù)目增加。
在26個(gè)月齡的年老雌性BALB/c小鼠中也證明了胸腺素β4的作用。這些小鼠被認(rèn)為很老了，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)超出了正常小鼠的壽命。這些小鼠表示出許多老年癥狀，包括白內(nèi)障，關(guān)節(jié)炎，傷口愈合困難，以及毛發(fā)稀薄。將這些小鼠刮剃，并用胸腺素β4在刮剃的當(dāng)時(shí)和48小時(shí)后按上述的方法處理。在第7天，收集皮膚，并用組織學(xué)方法檢查，方法和實(shí)施例1介紹的一樣。沒有觀察到明顯的新的毛囊發(fā)育，如圖5所示。
為了證明胸腺素β4的T-3部分是否具有和全長Tβ4同樣的活性，用同樣的方式將T-3肽涂在年老的小鼠上，其中T-3含有7個(gè)氨基酸大小的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，位于Tβ4的第17-23位氨基酸上。使用全自動(dòng)肽合成儀合成T-3片段，這在本領(lǐng)域眾所周知。
合成的T-3肽的水溶液/混合物的濃度是5μg/50μl。結(jié)果(參看圖6)表明與單獨(dú)利用水的對(duì)照處理中所觀察到的相比，該片段增加了毛囊發(fā)育。因此，含有這些氨基酸的胸腺素β4片段可被用來生產(chǎn)毛發(fā)再生組合物。
實(shí)施例4利用年老的小鼠，裸小鼠和大鼠模型研究毛發(fā)生長為了進(jìn)一步證明胸腺素β4對(duì)毛發(fā)生長的作用，0.05％的肽和水凝膠載體組合使用，每隔一天對(duì)刮剃的大鼠，刮剃的年老小鼠(24-26個(gè)月齡)，以及裸小鼠進(jìn)行局部涂藥。
一個(gè)研究中使用的是刮剃的大鼠，在這些大鼠中，胸腺素β4在刮剃區(qū)域的一側(cè)局部涂藥，而另一側(cè)涂的是對(duì)照載體。處理7天后，觀察到在用胸腺素β4處理過的大鼠中，生長期的毛囊數(shù)目增加了(參看圖7A)。生長期毛囊的數(shù)目大致是用空白載體單獨(dú)處理的對(duì)照大鼠中的2倍(參看圖7D)。和未處理的區(qū)域相比，毛發(fā)看起來更長更密，毛囊直徑也更大。在30天內(nèi)，隨著連續(xù)每周3次的處理，生長期毛發(fā)的數(shù)目持續(xù)生長。然而，在停止處理的14天內(nèi)，活性的毛囊數(shù)目下降到對(duì)照水平。
處理7天后，年老的小鼠(22-26周齡)毛囊數(shù)目生長表示出相似的增長(參看圖7B，7E)。在第7天和第35天(參看圖7E，7F)，在處理區(qū)域，裸小鼠顯示毛發(fā)生長增加。這些數(shù)據(jù)表明當(dāng)對(duì)大鼠和鼠模型進(jìn)行胸腺素β4局部施用時(shí)，其會(huì)促進(jìn)毛發(fā)生長。
實(shí)施例5遷移試驗(yàn)用8μm孔的涂有50μg/ml的大鼠尾巴I型膠原(BD Bioscience，Bedford，MA)的聚碳酸酯PVPF膜(Poretics，Livermore，CA)在48孔的Boyden室中進(jìn)行克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞遷移研究，其中I型膠原稀釋在角質(zhì)細(xì)胞-SFM中，SFM中含有72mM的HEPES緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。包被的膜在使用前干燥2小時(shí)。用胰蛋白酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)收獲培養(yǎng)的克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞，并重懸在結(jié)合介質(zhì)中，結(jié)合介質(zhì)中含有下列成分角質(zhì)細(xì)胞-SFM，1％的牛血清白蛋白因子(Sigma，St.Louis，MO)，以及25mM的HEPES緩沖液。底室用結(jié)合介質(zhì)填滿，結(jié)合介質(zhì)中含有1或100ng3×合成的Tβ4(FDA)。成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基用作陽性對(duì)照。將角質(zhì)細(xì)胞加入上室，濃度是每個(gè)孔30000個(gè)細(xì)胞，用5％CO2在37℃溫育4.5小時(shí)。然后固定膜，并且用Diff-Quik(VWR)進(jìn)行染色。隨機(jī)計(jì)算每個(gè)孔的三個(gè)區(qū)域的細(xì)胞數(shù)，并將計(jì)算得的細(xì)胞數(shù)平均，便能對(duì)成功通過膜上小孔遷移的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量。在Nikon Optiphot-2顯微鏡下以10×鏡頭計(jì)數(shù)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。
克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞在體外向胸腺素β4遷移Tβ4在前面已經(jīng)被顯示能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。Malinda等人(1997)。在Boyden室實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)的克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞在4.5小時(shí)后對(duì)Tβ4有反應(yīng)。在Tβ4存在情況下，細(xì)胞的遷移比只有結(jié)合介質(zhì)存在情況下細(xì)胞的遷移增加了將近2倍(p0.0006)(參看表1)。這個(gè)肽對(duì)細(xì)胞遷移的作用在1ng/ml的情況下是最大，而Tβ4濃度較高，遷移表現(xiàn)下降。
表1在存在Tβ4的情況下，克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞的遷移上升。
每個(gè)值的SEM計(jì)算在表1。
實(shí)施例6毛發(fā)生長過程中胸腺素β4活性的證明按Paus等人在“休止期皮膚含有毛發(fā)生長的抑制劑(Telogen skincontains an inhibitor of hair growth)”，Br.J.Dermatol.122777-784(1990)中介紹的方法，用脫毛來誘導(dǎo)休止毛囊的毛發(fā)生長周期。簡而言之，用毛發(fā)去除器蠟帶試劑盒(Hair Remover Wax Strip Kit)(Del Laboratories，F(xiàn)armingdale，NY)為休止期的8周齡的雌性C57/BL6小鼠后背皮膚去毛，導(dǎo)致生長期毛囊同步發(fā)育。在去毛后第0天(沒去毛的皮膚-休止期)，第4天(早生長期)，和第9天(晚生長期)收集皮膚組織樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集5只小鼠。用4％的多聚甲醛固定樣品，并將樣品包埋在石蠟中。
用毛囊細(xì)胞亞群表達(dá)胸腺素β4在C57/BL6小鼠脫毛誘導(dǎo)的同步的成熟毛發(fā)生長周期中，內(nèi)源胸腺素β4在毛囊中表達(dá)的空間和時(shí)間模型已經(jīng)被證明。這樣就把觀察到的給藥胸腺素β4的作用效果和內(nèi)源性胸腺素β4在毛發(fā)生長中的功能聯(lián)系起來了。在去毛后1天，在休止期毛囊中觀察到了低水平的胸腺素β4(圖8)。在這些毛囊中，胸腺素β4表達(dá)限定在少量的位于膨脹區(qū)的細(xì)胞中，在上毛囊或下毛囊中都沒檢測到胸腺素β4。皮脂腺在所有階段都被染色了，可能是因?yàn)樗鼘?duì)抗胸腺素β4抗體的非特異性吸收。
毛囊向早生長期轉(zhuǎn)變(去毛后4天)伴隨著膨脹區(qū)中胸腺素β4表達(dá)細(xì)胞數(shù)目的增加(圖8)。此外，在毛囊下部，即膨脹部和球形部之間檢測到了一些胸腺素β4陽性染色細(xì)胞。在晚生長期(去毛后8天)，位于下毛囊(包括基質(zhì)和外根鞘)的為數(shù)眾多的細(xì)胞都表達(dá)胸腺素β4。這些數(shù)據(jù)表明胸腺素β4表達(dá)細(xì)胞在時(shí)間和空間上的分布與毛囊干細(xì)胞的位置類型相似(參看Taylor等人，Cell 102453-461(2000)，和Oshima等人，Cell 104233-245(2001))。隨著毛發(fā)開始生長，在膨脹部外面靠近球形部的地方，觀察到了胸腺素β4陽性細(xì)胞，它們是從膨脹部遷移到這的。
實(shí)施例7從大鼠觸須中分離克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞(毛囊干細(xì)胞)根據(jù)Kobayashi等人在“大鼠觸須膨脹部中角質(zhì)細(xì)胞克隆形成細(xì)胞的隔離(Segregation of keratinocyte colony-forming cells in the bulgeregion ofthe rat vibrissa)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 907391-7395(1993)中介紹的方法，作了一些修改，從大鼠觸須囊中分離克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞。簡而言之，用CO2窒息的方法殺死Fisher 344大鼠。將含有觸須墊的上嘴唇割下來，并將其內(nèi)表面顯露出來。在雙目顯微鏡下解剖觸須囊，拔去毛墊的毛囊，然后把它放在無菌的培養(yǎng)基中。將含有毛囊膨脹部的片段割下來，并在膠原酶/離散酶(dispase)溶液(1mg/ml；Roche Molecular Biochemicals，Quebec，Canada)中37℃培養(yǎng)30分鐘。從膠原蛋白囊中分離表皮核，并且在0.05％的胰蛋白酶溶液中進(jìn)一步培養(yǎng)(30分鐘，37℃)，以利于表皮細(xì)胞的解離。分離的細(xì)胞培養(yǎng)在角質(zhì)細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基中，其補(bǔ)充有EGF，牛垂體提取物(Invitrogen，Carlsbad，CA)和10％的FCS(Hyclone，Logan，UT)。
培養(yǎng)的大鼠觸須克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞表達(dá)胸腺素β4
來自膨脹區(qū)的大鼠觸須毛囊角質(zhì)細(xì)胞能表達(dá)胸腺素β4。以前，已經(jīng)確定位于膨脹區(qū)的毛囊干細(xì)胞具有體外高度增殖能力的角質(zhì)細(xì)胞。盡管根據(jù)特定的標(biāo)記，毛囊干細(xì)胞并沒有被完全表征，但它們能優(yōu)先表達(dá)細(xì)胞角質(zhì)蛋白15(K15)。從大鼠觸須膨脹區(qū)分離的克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞(圖9A，9B)顯示該分離的細(xì)胞是高度克隆發(fā)生的(圖9C)。這些細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記K15，但不能表達(dá)細(xì)胞角質(zhì)蛋白10(K10)，K10是一個(gè)已知的末端角質(zhì)細(xì)胞分化的早期標(biāo)記(圖9A，9D)。此外，當(dāng)在體外培養(yǎng)時(shí)，這些細(xì)胞能以平均26μm/小時(shí)的速度移動(dòng)。這些特征支持了這樣的結(jié)論，即通過這些方法獲得細(xì)胞群體代表的是毛囊干細(xì)胞的直系后代。這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)3-4天后能表達(dá)胸腺素β4(圖9C)。
有意思的是，用外源的胸腺素β4處理這些克隆發(fā)生角質(zhì)細(xì)胞時(shí)，能引起K15水平出現(xiàn)劑量依賴的下降(圖10)，這表明胸腺素β4對(duì)早期干細(xì)胞分化是重要的(即向TA表型轉(zhuǎn)變)。沒有發(fā)現(xiàn)胸腺素β4對(duì)干細(xì)胞增殖有作用。這些數(shù)據(jù)將從大鼠觸須中分離出來的細(xì)胞定義為能產(chǎn)生胸腺素β4的克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞。
實(shí)施例8克隆發(fā)生的角質(zhì)細(xì)胞在胸腺素β4存在下能提高M(jìn)MP-2的水平以前認(rèn)為胞外基質(zhì)降解是正常appendageal發(fā)育過程中必要的步驟。在這個(gè)實(shí)施例中證明了胸腺素β4對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的作用。
用外源胸腺素β4處理克隆發(fā)生的膨脹部衍生的干細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衍生的MMP-2分泌水平以劑量依賴方式上升，卻觀察不到對(duì)MMP-9水平的顯著作用(圖11)。這些數(shù)據(jù)表明胸腺素β4能激活MMP-2的活性，MMP-2對(duì)于干細(xì)胞從膨脹部逃逸和便利它們遷移到球形部都是重要的。
實(shí)施例9促進(jìn)人毛發(fā)生長本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易地意識(shí)到上述的處理方法能輕易地用來處理人的禿發(fā)癥。任何可藥用載體，尤其是那些適合局部給藥的載體，可以用作肽給藥時(shí)的載體，該肽含有有效治療量的Tβ4，T-3，含有肌動(dòng)蛋白結(jié)合序列的Tβ4片段，以及任何其他肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽或他們的混合物。這種肽也可以以純的形式給藥，不帶載體。如果使用了載體，該肽可以任何有效量存在，但通常是以混合物的形式給藥，混合物中含有0001-50％的肽或肽的混合物。更優(yōu)選地，可藥用載體含有0.01-5％的肽或肽的混合物。這種處理包括對(duì)局部受禿發(fā)影響的區(qū)域局部給藥一個(gè)或多個(gè)劑量。在某些實(shí)施方案中，每天，每隔一天，每周、兩周或每月一次或多次多劑量給藥。局部給藥劑量的形式可以是洗劑，凝膠，噴霧或任何其他方便的形式。
實(shí)施例10肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元的確定使用天然產(chǎn)生的胸腺素β4，蛋白水解的片段，以及合成的肽，發(fā)現(xiàn)胸腺素β4中的6或7個(gè)氨基酸大小的肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元對(duì)于血管生成活性是關(guān)鍵的，該活性又能促進(jìn)毛發(fā)生長。采用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移試驗(yàn)和利用雞主動(dòng)脈弓的血管芽生試驗(yàn)表明胸腺素β4和肽的肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元在約50nM時(shí)表現(xiàn)出幾乎完全一樣的活性，而缺乏肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元任何一部分的肽是沒有活性的。胸腺素β4的粘連和出芽活性隨著添加5-50nM的可溶性肌動(dòng)蛋白而被抑制。這就證明了胸腺素β4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元對(duì)其血管生成活性是關(guān)鍵位點(diǎn)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明細(xì)胞表面的肌動(dòng)蛋白可以充當(dāng)胸腺素β4的受體。
本申請公開的方法被用來確定若干肽中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元，而且這些方法也能輕易地用來確定其他促進(jìn)毛發(fā)生長肽中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元。
肽和片段合成的胸腺素β4由Bethesda，MD的RegeneRx公司提供。下列胸腺素β4的肽片段是用常規(guī)方法合成的Tβ41-15(即SEQ IDNO1的前15個(gè)氨基酸殘基)，Tβ410-28(即SEQ ID NO1的第10-28位的氨基酸殘基)，Tβ420-43(即SEQ ID NO1的第20-43位的氨基酸殘基)，Tβ1513-23(即SEQ ID NO1的第13-23位的氨基酸殘基)，Tβ417-23(即SEQID NO1的第17-23位的氨基酸殘基，也叫T-3)，Tβ419-26(即SEQ ID NO1的第19-26位的氨基酸殘基)，Tβ413-19(即SEQ ID NO1的第13-19位的氨基酸殘基)。天然產(chǎn)生的β胸腺素，胸腺素β4-亞砜，以及蛋白水解片段(即表2第1組中的7種肽)可以用Huff等人以前在Anal.Chim.Acta352239-248(1997)和Eur.J.Biochem.230650-657(1995)中介紹的方法來制備。所有的肽都溶解在磷酸緩沖液(PBS)中，并按等分貯存在-70℃。
細(xì)胞HUVECs在2-5節(jié)中被分離和使用。Grant等人，J.Cell.Sci.1083685-3694(1995)。細(xì)胞在RPMI 1640(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培養(yǎng)，其補(bǔ)充有20％的小牛血清(Hyclone Laboratories，Logan，UT)，200μg/ml的內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)體(ECGS)(Collaborative BiomedicalProducts，Bedford，MA)，0.8U/ml肝素鈉(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，青霉素/鏈霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)，10μg/ml慶大霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)，和1％的兩性霉素B(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
細(xì)胞粘附為了確定哪種離子對(duì)HUVEC的粘連是必需的，將0.1M碳酸緩沖液中的層粘連蛋白(laminin)-1肽(50μl中有25ng)和兩種測試濃度的Tβ4(50μl中有100和500ng)結(jié)合到U形底的96孔滴定板的底部，4℃過夜。用磷酸緩沖液沖洗孔兩遍，并用150μl3％BSA的PBS(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在室溫下阻斷30分鐘。再次沖洗孔，然后將50000 HUVEs的50μl無血清培養(yǎng)基加入每個(gè)孔中，無血清培養(yǎng)基中含有指示的鹽(1mMCa2+，0.5mMMg2+和0.5mMMn2+)，這些鹽或者單獨(dú)存在，或者組合存在于培養(yǎng)基中。用于本研究的HUVECs在使用前血清缺乏2小時(shí)。滴定板在37℃培養(yǎng)45分鐘。通過兩次PBS沖洗，將沒有粘附的細(xì)胞輕輕地去掉。剩下的細(xì)胞用0.2％結(jié)晶紫的20％甲醇染色，多余的染色液用水沖洗，在37℃干燥過夜，用10％SDS裂解10分鐘，并在600nm處測定滴定板的OD值。(Molecular Devices的精準(zhǔn)微孔板閱讀器)。每一個(gè)條件測試三次，而每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次。
Boyden-室實(shí)驗(yàn)用Salcedo等人以前在J.Imnunol.1667571-7578(2001)中介紹的方法，在48孔的微趨化室(Neuro Probe公司，CabinJohn，MD)里進(jìn)行HUVEC遷移試驗(yàn)。簡而言之，將50μg/ml大鼠尾巴膠原蛋白(BD Biosciences，Bedford，MA)的RPMI 1640涂在8μm孔的不含PVP的聚碳酸酯膜上，4℃過夜，其中RPMI 1640含25mMHEPES(Invirtogen，Carlsbad，CA)。膜在使用前至少干燥1小時(shí)。HUVECs被血清缺乏2小時(shí)，用Versene(Invirtogen，Carlsbad，CA)收獲，并重懸在結(jié)合介質(zhì)中，結(jié)合介質(zhì)包括具有1％BSA和25mM HEPES的RPMI1640。室的下孔用稀釋在結(jié)合介質(zhì)中的1，10，100和1000ng/ml胸腺素β4或其肽片段上樣。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)(200ng/ml)用作陽性對(duì)照。將細(xì)胞加到室的上部，濃度是每個(gè)孔50000個(gè)細(xì)胞。小室在37℃溫育4小時(shí)。使用Diff-Quik(VWR，Bridgeport，NJ)對(duì)過濾器進(jìn)行固定和染色。利用CK-2 Olympus顯微鏡，在10×放大率下對(duì)通過膜孔成功遷移的細(xì)胞進(jìn)行手工定量。每種條件實(shí)驗(yàn)三次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩遍。
小雞主動(dòng)脈弓實(shí)驗(yàn)從13天大的雞胚中取出主動(dòng)脈弓，并將它放在RPMI 1640中。去掉周圍的結(jié)締組織后，得到主動(dòng)脈弓的橫斷面(1mm)。小心翼翼地將得到的弓環(huán)用20-30μl Matrigel(CollaborativeBiomedical Products)附著到48孔滴定板的底部，每個(gè)孔一個(gè)環(huán)。把環(huán)如此放置，以使得各個(gè)環(huán)的內(nèi)腔可以被看見。在環(huán)的頂部加入更多的Matrigel，這樣可以把環(huán)密封在它們的位置上。往每個(gè)孔中加入100μl的人內(nèi)皮細(xì)胞-SFM基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基(Invitrogen)，該培養(yǎng)基中含有1％的青霉素鏈霉素。將胸腺素β4、肽片段和外源性肌動(dòng)蛋白(SigmaChemical Co.)以無血清培養(yǎng)基的形式加入孔中，最終使得每個(gè)孔的體積達(dá)到400μl。ECGS(200μg/ml)被用作陽性對(duì)照。滴定板在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。用Diff-Quik溶液將環(huán)固定和染色。觀察者用Olympus顯微鏡，在10×放大率下，以盲(blind)估計(jì)法對(duì)出芽進(jìn)行計(jì)數(shù)。每一個(gè)測試的條件使用六個(gè)孔，而每次試驗(yàn)重復(fù)三遍。
肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞粘連到胸腺素β4上錳對(duì)細(xì)胞粘連到胸腺素β4上是必要的，而且在隨后的粘連實(shí)驗(yàn)中都用到了它。
因?yàn)樾叵偎卅?含有肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，因此在細(xì)胞粘連實(shí)驗(yàn)中加入了肌動(dòng)蛋白。這表明可溶性肌動(dòng)蛋白能阻斷胸腺素β4的粘連。作為對(duì)照，可溶性肌動(dòng)蛋白對(duì)層粘連蛋白-1介導(dǎo)的粘連沒有作用。這些數(shù)據(jù)表明肌動(dòng)蛋白能阻斷胸腺素β4介導(dǎo)的粘連，同時(shí)也表明胸腺素β4上的肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于細(xì)胞粘連到胸腺素β4上是重要的。這些數(shù)據(jù)也表明肌動(dòng)蛋白可以作為胸腺素β4的細(xì)胞表面受體。
在胸腺素β4存在下，肌動(dòng)蛋白能阻斷主動(dòng)脈環(huán)的血管芽生利用一個(gè)小雞胚主動(dòng)脈環(huán)模型，發(fā)現(xiàn)胸腺素β4能促進(jìn)芽生。肌動(dòng)蛋白在這個(gè)模型系統(tǒng)中表現(xiàn)出了血管生成活性。在促進(jìn)芽生過程中，胸腺素β4和肌動(dòng)蛋白都沒有與ECGS陽性對(duì)照一樣有活性。添加外源肌動(dòng)蛋白能顯著地抑制胸腺素β4介導(dǎo)的芽生。外源肌動(dòng)蛋白對(duì)胸腺素β4介導(dǎo)的血管生成的作用是特異的，因?yàn)樗荒芤种艵CGS介導(dǎo)的血管芽生。當(dāng)肌動(dòng)蛋白和ECGS一塊加入時(shí)，可以觀察到芽生的增長。這些數(shù)據(jù)表明胸腺素β4離體能促進(jìn)血管生成，而外源肌動(dòng)蛋白能阻斷這種活性。因此，有理由相信胸腺素β4是通過結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面上的肌動(dòng)蛋白而發(fā)揮作用的。
胸腺素β4中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)具有血管生成活性的確定不同胸腺素β4的合成肽和蛋白水解片段用來確定Tβ4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管芽生的活性位點(diǎn)，根據(jù)本申請公開的方法，這些過程至少部分負(fù)責(zé)促進(jìn)毛發(fā)生長。無論是合成的，還是天然產(chǎn)生的胸腺素β4在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中都有活性(表2和數(shù)據(jù)沒有顯示)。胸腺素β4-亞砜也是有活性的。含有肌動(dòng)蛋白結(jié)合序列的C端或全長的合成肽和蛋白水解片段(Tβ41-26，Tβ413-23，Tβ47-43，Tβ413-43，Tβ410-28，Tβ420-43和Tβ417-23)在這些實(shí)驗(yàn)中一般具有很高的活性。相反，不含肌動(dòng)蛋白結(jié)合序列的合成肽和蛋白水解片段(Tβ41-6和Tβ413-19)是沒活性的，而Tβ41-15。僅在血管芽生實(shí)驗(yàn)中表示出很弱的活性。最小的有活性的合成肽是Tβ417-23，含有7個(gè)氨基酸，對(duì)遷移和芽生具有完全的活性(表2，以前和表里的數(shù)據(jù)沒有顯示，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO1中第17-22位的氨基酸殘基能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移)。具有保守的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，即SEQ ID NO1中第17-22位氨基酸殘基的β胸腺素的所有其他成員(β4-亞砜，β4Ala，β9和β10)，也是有活性的(表2)。包含在第13-23位氨基酸中的胸腺素β15的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)在芽生實(shí)驗(yàn)中是有活性的。這些數(shù)據(jù)表明胸腺素β4內(nèi)包含的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)具有共同的生理活性。因此，有理由相信具序列同源性的這些和其他相關(guān)家族成員具有這個(gè)對(duì)促進(jìn)毛發(fā)生長重要的活性。
表2.Tβ4的蛋白水解片段和合成肽研究的總結(jié) 表2聯(lián)想肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元下面劃了線。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的活性打分n.t.＝?jīng)]有測試；-＝?jīng)]有活性；+/-＝活性低；+＝有活性；和++＝活性高。從天然產(chǎn)生的肽中制備前7種成分，如亞砜的形式，命名為“(O)”。
在β胸腺素家族中，肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元已知是高度保守的。參看例如，Huff等人，Int.J.Biochem.Cell Biol.33205-220(2001)。這些分子的大多數(shù)異質(zhì)性是出現(xiàn)在C端。根據(jù)肌動(dòng)蛋白結(jié)合序列的保守性，以及根據(jù)被測試的β胸腺素的其它成員對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管芽生是有活性的這樣一個(gè)事實(shí)，對(duì)本領(lǐng)域一名普通技術(shù)人員來說，許多本申請?zhí)峁┑男蛄械淖凅w和/或同源物很明顯可用于這些公開的方法中。此外，因?yàn)檫@些肽和相似的肽體外活性和體內(nèi)活性相關(guān)，前述的結(jié)果表明哪種肽對(duì)促進(jìn)毛發(fā)生長有用。
實(shí)施例11Western雜交分析和免疫化學(xué)在前面的實(shí)施例中，Western雜交分析按下列方法進(jìn)行。添加RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)化成等量蛋白的細(xì)胞裂解液在4-12％的Bis-TrisNuPAGE膠中進(jìn)行分離(Invitrogen，Carlsbad，CA)。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，并用能和小鼠角蛋白1，5，6，10，14，15(Covance Research Product，Richmond，CA)拮抗的多克隆抗體檢測。用抗GAPDH的抗體(Research Diagnostics，F(xiàn)landers，NJ)對(duì)同一塊膜進(jìn)行重新檢測，利用NIH成像軟件，通過光密度法將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。
利用和全長胸腺素β4肽序列拮抗的多克隆兔抗體(A.Goldstein博士，GWU，Washington DC饋贈(zèng)的禮物)對(duì)5μm石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色。用Dako EnVision試劑盒(DakoCytomation，Denmark)檢測一級(jí)抗體，并用蘇木精對(duì)組織切片進(jìn)行復(fù)染。
在不偏離本申請介紹的原則的精神和范圍下，可以對(duì)本申請介紹的方法和組合物進(jìn)行修飾和改動(dòng)，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很明顯的。盡管本發(fā)明結(jié)合特定的實(shí)施例已加以介紹了，但還是應(yīng)該意識(shí)到所列舉的實(shí)施例僅僅是本公開內(nèi)容的一些特定的實(shí)施例，不應(yīng)看成對(duì)本申請的范圍進(jìn)行限制。事實(shí)上，對(duì)介紹的用來實(shí)施本發(fā)明方法所作的修改還是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，這對(duì)相關(guān)領(lǐng)域和/或分子生物學(xué)，皮膚病學(xué)，或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是明顯的。
序列表<110>美國政府健康及人類服務(wù)部(Government of the United States)<120>利用肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽促進(jìn)毛發(fā)生長的方法和組合物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PROMOTION OF HAIR GROWTH UTILIZING ACTINBINDING PEPTIDES)<130>SCT042794-47<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>43<212>PRT<213>胸腺素β4<400>1Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys1 5 10 15Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu20 25 30Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser35 40
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)受試者毛發(fā)生長的方法，包括將受試者皮膚的靶區(qū)域與多肽接觸，這種多肽除了含有全長SEQ ID NO1外，還含有肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中多肽含有β胸腺素的片段，或能促進(jìn)受試者毛發(fā)生長的片段的變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中能促進(jìn)受試者毛發(fā)生長的片段的變體在肌動(dòng)蛋白結(jié)合基元之外包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失或取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中變體和SEQ ID NO1至少有70％的同一性。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中β胸腺素的片段是胸腺素β4的片段，其長度不超過40個(gè)氨基酸殘基，并且包括SEQ ID NO1的第17-22位氨基酸殘基，其中所述胸腺素β4的片段包括0-5個(gè)保守性氨基酸取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中胸腺素β4的片段長度不超過40個(gè)氨基酸殘基，并且包括SEQ ID NO1的第17-23位氨基酸殘基，其中所述胸腺素β4的片段包括0-5個(gè)保守性氨基酸取代。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中胸腺素β4的片段長度不超過20個(gè)氨基酸殘基，其中所述胸腺素β4的片段包括0-4個(gè)保守性氨基酸取代。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中胸腺素β4的片段長度不超過10個(gè)氨基酸殘基，其中所述胸腺素β4的片段包括0-3個(gè)保守性氨基酸取代。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中胸腺素β4的片段長度不超過7個(gè)氨基酸殘基，其中所述胸腺素β4的片段包括0-2個(gè)保守性氨基酸取代。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中胸腺素β4的片段包括SEQID NO1的第17-22位氨基酸殘基。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中多肽由胸腺素β4的片段，或能促進(jìn)受試者毛發(fā)生長的片段的變體組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中多肽由SEQ ID NO1的第17-23位氨基酸殘基組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中多肽由SEQ ID NO1的第17-22位氨基酸殘基組成。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中多肽局部施用給受脫發(fā)癥影響的皮膚區(qū)域。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中受脫發(fā)癥影響的皮膚區(qū)域是受試者的頭皮。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽選自β胸腺素的片段，胸腺素β4的片段，含有T-3但不是全長胸腺素β4的肽，長度不超過7個(gè)氨基酸殘基的胸腺素β4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，長度不超過6個(gè)氨基酸殘基的胸腺素β4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，治療有效的上述任何肽的同源物或變體，以及這些肽中的兩種或多種的混合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中受試者是人。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中受試者是非人的動(dòng)物。
19.一種促進(jìn)毛發(fā)生長的組合物，其中該組合物包括除了含有全長SEQ ID NO1以外，還含有肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽的多肽。
20.權(quán)利要求19所述的組合物，進(jìn)一步包括可藥用載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中可藥用載體是局部的藥用制劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中可藥用載體包括水凝膠。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中多肽包括胸腺素β4的片段，或能促進(jìn)受試者毛發(fā)生長的片段的變體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中變體和SEQ ID NO1至少有70％的同一性。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中胸腺素β4的片段長度不超過40個(gè)氨基酸殘基，并且包括SEQ ID NO1的第17-23位或第17-22位氨基酸殘基，其中所述胸腺素β4的片段包括0-5個(gè)保守性氨基酸取代。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中胸腺素β4的片段長度不超過20個(gè)氨基酸殘基，其中所述胸腺素β4的片段包括0-4個(gè)保守性氨基酸取代。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中胸腺素β4的片段長度不超過10個(gè)氨基酸殘基，其中所述胸腺素β4的片段包括0-3個(gè)保守性氨基酸取代。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中胸腺素β4的片段長度不超過7個(gè)氨基酸殘基，其中所述胸腺素β4的片段包括0-2個(gè)保守性氨基酸取代。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中胸腺素β4的片段長度不超過6個(gè)氨基酸殘基，其中所述胸腺素β4的片段包括0-2個(gè)保守性氨基酸取代。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中胸腺素β4的片段由SEQID NO1的第17-23位氨基酸殘基組成。
31.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中胸腺素β4的片段由SEQID NO1的第17-22位氨基酸殘基組成。
32.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中多肽由胸腺素β4的片段，或能促進(jìn)受試者毛發(fā)生長的片段的變體組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了適用于增加人和其它動(dòng)物毛發(fā)生長的方法和組合物。公開的實(shí)施方案包括含有肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽的組合物。在若干實(shí)施方案中，肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽含有胸腺素β4的片段。在另一些實(shí)施方案中，公開的內(nèi)容提供了含有胸腺素β4和/或其他肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽的片段的組合物，這些組合物適合處理脫毛癥和其他與脫發(fā)相關(guān)的癥狀。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，公開的內(nèi)容提供了含有胸腺素β4中能結(jié)合肌動(dòng)蛋白的大約6或7個(gè)氨基酸序列的組合物。
文檔編號(hào)A61K8/64GK1622797SQ03802782
公開日2005年6月1日 申請日期2003年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月25日
發(fā)明者德博拉·菲爾普, 海因達(dá)·K·克萊因曼, 邁克爾·埃爾因 申請人:美國政府健康及人類服務(wù)部