專利名稱：包含免疫原性微顆粒的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物，疫苗組合物，在研究對象中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法和生產(chǎn)這些組合物的方法。
背景技術(shù)：
調(diào)控人和動物的免疫系統(tǒng)是一種得到廣泛認(rèn)可的避免或治療某些疾病或情況的手段。
免疫系統(tǒng)控制疾病的機(jī)理包括誘導(dǎo)中和抗體(一種體液免疫應(yīng)答)和產(chǎn)生細(xì)胞或T細(xì)胞免疫應(yīng)答。后者包括T輔助細(xì)胞(TH)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。在病毒感染例如脊髓灰質(zhì)炎或肝炎，抗體通過阻止病毒感染細(xì)胞而提供保護(hù)。通過利用殺菌機(jī)制和中和細(xì)菌毒素，抗體也能抵抗細(xì)菌如肺炎鏈球菌和葡萄球菌。
當(dāng)抗原的肽片段結(jié)合到稱為MHC I或MHC II的分子(主要組織相容性復(fù)合物，I型或II型)并被呈遞在專門的APC(抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells))如DC(樹突狀細(xì)胞(dendritic cells))或巨噬細(xì)胞表面時，T細(xì)胞能被激活。T細(xì)胞含有的抗原受體能用于監(jiān)視細(xì)胞表面的抗原肽片段的出現(xiàn)。TH細(xì)胞的抗原受體識別結(jié)合于MHC II分子的抗原肽。相反的，CTL的受體和呈現(xiàn)在I型分子的抗原反應(yīng)。
激活的T細(xì)胞放大免疫應(yīng)答，這是因為當(dāng)T細(xì)胞識別被病原體感染或包含它能識別的抗原決定簇的目標(biāo)細(xì)胞時，鏈?zhǔn)绞录挥|發(fā)，這些最終導(dǎo)致感染的細(xì)胞的死亡。另外，一些T細(xì)胞能刺激分泌細(xì)胞因子或淋巴因子，這些反過來可最終導(dǎo)致病原體的失活或消除。
盡管市場上有很多疫苗，但是對于大量的疾病或情況仍然需要生產(chǎn)更有效和廣譜的疫苗。也仍然需要保護(hù)性對抗那些尚未獲得疫苗或疫苗效果不佳的感染體或病原體。另外，需要一種有效的單劑量的疫苗，就經(jīng)濟(jì)、運(yùn)輸和患者或研究對象的順從性等原因而言，它顯得尤其需要。
大多數(shù)疫苗的缺點為不能誘導(dǎo)最佳的、不同類型的體液和細(xì)胞應(yīng)答的組合，以達(dá)到免疫學(xué)有效性。例如，當(dāng)抗體和細(xì)胞應(yīng)答兩者同時存在會更有效時，一些疫苗只能刺激抗體應(yīng)答。其他例子中，需要多劑的疫苗注射如追加注射才能抵抗相關(guān)的感染體。
在一些其他的例子中，與所需要的免疫球蛋白如IgA、IgG和IgM一起被誘導(dǎo)產(chǎn)生的還有IgE。誘導(dǎo)IgE的疫苗是不利的，因該免疫球蛋白出現(xiàn)在過敏反應(yīng)中。
刺激IgA的生成對于經(jīng)黏膜位置或表面進(jìn)入感染的病原體是“第一線”防御。因此，能產(chǎn)生高IgA分泌的免疫應(yīng)答而不增加IgE生成的疫苗也將是有用的。
然而在其他例子中，盡管疫苗能刺激APC，免疫刺激的程度是不樂觀的。例如，樹突狀細(xì)胞或DC被一系列的細(xì)胞亞群所特征化，它們能通過表面分子彼此區(qū)別開來，一些表面分子是能結(jié)合于T細(xì)胞受體的特異配體。因此，需要去生產(chǎn)一種疫苗能選擇性地定向于DC的一類亞群，例如一類能有效地啟動CD8 T細(xì)胞的亞群，因為這些T細(xì)胞在對抗許多細(xì)胞內(nèi)病原體和腫瘤的保護(hù)性免疫中發(fā)揮重要作用，但其難于誘導(dǎo)是眾所周知的。
進(jìn)一步，對于疫苗，就大多數(shù)細(xì)胞而言，細(xì)胞外的抗原傳統(tǒng)地不進(jìn)入MHC I處理途徑。通常，利用死疫苗產(chǎn)生CTL免疫是不太可能的，盡管有人認(rèn)為存在APC通過攝取凋亡細(xì)胞、免疫復(fù)合物和顆粒[1]來進(jìn)行處理和呈遞的I型的選擇性途徑。乙型肝炎的表面蛋白或酵母逆轉(zhuǎn)錄蛋白顆粒構(gòu)成的非感染性病毒樣顆粒(VLP)已經(jīng)顯示能被巨噬細(xì)胞用于有效地加工以呈遞MHC I來在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)CD8CTL細(xì)胞應(yīng)答[2，3]。VLP是多亞基、包含脂質(zhì)的蛋白顆粒，其中脂質(zhì)成分構(gòu)成超過干重的50％。
然而，因為乙型肝炎核心蛋白顆粒不具有免疫原性，并具有較低的脂質(zhì)成分，推測VLP的免疫原性不是因為其大小而是在于其生物化學(xué)成分。這與關(guān)于當(dāng)抗原表現(xiàn)為包含脂質(zhì)或去污劑的形式時，它們可能通過損壞細(xì)胞膜而與APC融合，然后進(jìn)入細(xì)胞漿的假說一致。
應(yīng)用載有抗原的微球已經(jīng)被試驗作為一種可能的疫苗組合物。微球由可生物降解的乳酸和羥乙酸多酯(PLA和PLGA)構(gòu)成。微球被構(gòu)建成使得它們的大小和聚合物組合物能夠控制其自身的降解速度。當(dāng)微球降解后，其載有的抗原從中被釋放，并提供了抗原的控釋來刺激免疫應(yīng)答。這些分子通過與蛋白顆粒一樣的方式與免疫細(xì)胞接觸和反應(yīng)是不太可能的，蛋白顆粒的構(gòu)造與細(xì)胞膜具有生物相容性。
然而，這種形式的疫苗組合物的難點還包括抗原穩(wěn)定性、微球大小和抗原釋放的動力學(xué)，所有的這些仍需要去解決以生產(chǎn)出具有好的抗原性和永久免疫原性的疫苗，以生產(chǎn)出能經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)和施用的疫苗[4]。
在美國專利No.4,225,581中，一種包含不同大小的異源性顆?；旌衔锏慕M合物被描述為對于將吸附于聚合物顆粒表面的抗原運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)是有用的。然而，這種疫苗的成功轉(zhuǎn)運(yùn)、抗原性和免疫原性沒有被闡述或展示。特別的，沒有證據(jù)顯示誘導(dǎo)了CD8 T細(xì)胞應(yīng)答，或甚至參與了MHC I型呈遞途徑。顆粒的聚合物材料認(rèn)為和上面討論的PLA或PLGA微顆粒具有相似的特性。
因此，在本發(fā)明之前還不清楚，作為疫苗的一部分而被施用的顆粒，其本身的大小是否能誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答。
在形成本發(fā)明的工作中，發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)結(jié)合于抗原的、與病毒大約一樣大小的微顆粒能在研究對象上引起強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液抗體應(yīng)答。
發(fā)明概述在本發(fā)明的第一部分提供了一種免疫原性組合物，其包含結(jié)合于微顆粒的至少一種抗原，其中微顆粒有著和病毒一樣的大小范圍。
涉及免疫原性組合物使用的術(shù)語“包含”意思是組合物中包括抗原和微顆粒。也可以包括其他成分。
術(shù)語“抗原”指的是任何能引起免疫應(yīng)答的分子、成分或?qū)嶓w。免疫應(yīng)答包括細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答。依賴于組合物設(shè)定的功能可以包含一種或多種抗原。
抗原可以是一種肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸或其他類型的分子或任何的這些分子的組合。
抗原可以來自病原體、組織、細(xì)胞、器官或分子，這依賴于組合物設(shè)定的功能?？梢允羌兓目乖蚴侵亟M來源的，生產(chǎn)于合適的載體如細(xì)菌、酵母菌或細(xì)胞培養(yǎng)。病原體例如可以是任何病原體、細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的、抗原成分或它們的部分、病毒、細(xì)菌或原蟲來源、如HIV、流感病毒、肝炎病毒、瘧疾。特別的，本發(fā)明中采用的抗原例子如下花粉、丙型肝炎病毒、(HIV)核心、E1、E2和NS2蛋白、來自瘧原蟲屬的抗原、如間日瘧原蟲和其他瘧原蟲屬包括惡性瘧原蟲的環(huán)孢子蛋白(CS)和人惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲、TRAP、MSP-1、MSP-2、MSP-3、MSP-4、MSP-5、AMA-1、RESA、SALSA、STARP、LSA1和LSA3、HIV-gp120/160包膜糖蛋白、鏈球菌表面蛋白抗原、流感核蛋白、血凝素-神經(jīng)酰胺酶表面感染、TcpA菌毛蛋白亞基、VP1蛋白、LMCV核蛋白、碩大利什曼原蟲表面糖化蛋白(gp63)、百日咳博德特氏菌表面蛋白、狂犬病病毒G蛋白、鏈球菌M蛋白、葡萄球菌蛋白或幽門螺旋桿菌蛋白、合胞體病毒(RSV)F或G蛋白、Epstein Barr virus(EBV)gp340或核抗原3A、血凝素、博氏疏螺旋體外表面蛋白(Osp)A、結(jié)核分支桿菌38kD脂蛋白或30kD蛋白(Ag85)、10kD或65kD蛋白、腦膜炎奈瑟菌I型外蛋白、水痘帶狀皰疹I(lǐng)E62和gp1、風(fēng)疹病毒殼體蛋白、乙型肝炎病毒前S1抗原、皰疹單純病I型糖化蛋白G或gp D或CP27、墨累灰牛流域腦炎病毒E糖蛋白、甲型肝炎病毒VP1、脊髓灰質(zhì)炎病毒殼體蛋白VP1、VP2、VP3和VP6、沙眼衣原體表面蛋白、乙型肝炎病毒包膜前S2抗原、人鼻病毒(HRV)殼體、人乳頭狀瘤病毒來自癌基因E6和E7的肽、李斯特桿菌表面蛋白、水痘病毒殼體蛋白、牛痘病毒包膜蛋白、布氏桿菌表面蛋白、輪狀病毒VP-3、VP-4、VP-5、VP-7和VP-8、上述一種或多種抗原的組合、上述抗原的長度上包含5個或更多氨基酸的氨基酸亞基或一個或多個上述亞基的組合。
上述例舉的病原體的裂解物或培養(yǎng)的過濾物也可以作為抗原。這些片段可以是純化的、濃縮的或稀釋的形式、同樣他們提供了抗原性和或免疫原性。因此，根據(jù)本發(fā)明，這使得為患者特制免疫原性組合物成為可能，通過將患者腫瘤裂解物或腫瘤蛋白的某一特定成分結(jié)合到微顆粒上。
抗原也可以來自任何腫瘤類型或惡性物。可以生成抗原的腫瘤類型的例子是乳腺癌、肺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌和黑色素瘤。一些進(jìn)一步來源于腫瘤的特異性抗原的例子是黑色素瘤特異抗原(例如，MAGE系列抗原)，來自結(jié)腸的癌胚胎抗原(CEA)，nm23癌抗原和其他癌抗原或任何腫瘤中提取的真抗原，如粘蛋白如MUC-1到MUC-7抗原。單獨或組合的重組肽或蛋白也可以被利用。
抗原也可以是合成的抗原決定簇，如基于上述提及的一種或多種抗原的模擬物或肽樣模擬物。
術(shù)語“結(jié)合于”指的是微顆粒和抗原之間的連接。這可以是通過吸附、或通過結(jié)合或共價偶聯(lián)。優(yōu)選的抗原共價連接于微顆粒。甚至更優(yōu)選的，抗原結(jié)合于微顆粒的表面。
術(shù)語微顆粒指的是小顆粒。它可以是珠樣或球樣或其他任何合適的形式。
術(shù)語“病毒大小顆粒”(VSP)在本文中用于描述本發(fā)明的免疫原性組合物的某個實施方案。應(yīng)該明白術(shù)語VSP被采用僅僅是因為便利，并不將本發(fā)明限制在已知的病毒大小。例如，和未知病毒一樣大小的顆粒也在本發(fā)明的預(yù)期之中。
優(yōu)選的，微顆粒具有實心的核心，給結(jié)合的或相連的抗原提供了穩(wěn)定性，區(qū)別于以往是空心或膠囊工藝的微球。方便起見，這里指的病毒大小實心顆粒(VSSP)，其抗原出現(xiàn)在顆粒外面。用于制造VSSP的顆粒可以從制造商得到且基本上是統(tǒng)一規(guī)格(也就是，在預(yù)定大小的10％以內(nèi))。
術(shù)語“實心的核心”指的是基本上實心(也就是顆粒不是空心的)。微顆粒可以由任何合適材料構(gòu)成只要它不減弱免疫原性組合物的功能。因此微顆粒可以由乳膠、亞鐵分子、金(如金的納米顆粒)、玻璃、磷酸鈣、聚苯乙烯或可生物降解的和生物相容性的聚合物如PLG(聚賴氨酸g)構(gòu)成。優(yōu)選的，微顆粒由聚苯乙烯、PLG或金構(gòu)成。最優(yōu)選的，微顆粒由聚苯乙烯構(gòu)成。
微顆粒有著和已知的病毒相同的大小范圍。這意味著微顆粒是優(yōu)選的小于大約0.50μm。優(yōu)選的如此大小的微顆粒適合于引起免疫應(yīng)答。尤其它適合于被人體研究對象或動物中的抗原呈遞細(xì)胞所攝取。更優(yōu)選的，微顆粒在大約0.03和0.5μm之間，優(yōu)選的在大約0.03和0.15μm之間，仍更優(yōu)選的在0.03和0.10μm之間。甚至更優(yōu)選的微顆粒在約0.03到0.05μm之間，更優(yōu)選的，微顆粒在約0.03μm和0.049μm之間。仍更優(yōu)選的微顆粒在約0.03和約0.04μm之間或約0.04和0.049μm之間。
在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的微顆粒群體，如用于單次劑量免疫接種的微顆粒群體，是統(tǒng)一大小的。這意味著在約定群體中的絕大多數(shù)顆粒是所指定的大小。
優(yōu)選的微顆粒/抗原組合物是特別適合于引起細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答。細(xì)胞應(yīng)答優(yōu)選的選自TH細(xì)胞尤其是生成IFN和IL-4的T細(xì)胞、CTL尤其是CD8 CTL和B細(xì)胞的活化、成熟或增殖。
優(yōu)選的微顆粒/抗原組合物引發(fā)了MHC I型抗原呈遞機(jī)制，抗原通過包括內(nèi)凹(caveole)和/或網(wǎng)格蛋白凹(pit)的迄今未知的機(jī)制被攝取以通過Rab 4非依賴性和TAP依賴性過程來進(jìn)一步處理，如在這里的實施例4和7中解釋的一樣。體液應(yīng)答優(yōu)選地選自IgA、IgD、IgG、IgM和它們的亞組。
這種組合物也可以刺激那些有助于增強(qiáng)或放大免疫應(yīng)答的細(xì)胞。這些包括但不限制于APC如髓樣或淋巴樣兩者來源的DC，和巨噬細(xì)胞。這些細(xì)胞的成熟、活化或增殖是預(yù)期之中的，這些細(xì)胞上和T細(xì)胞作用的共刺激配體或分子，如CD40、CD80和CD86也是如此。
本發(fā)明的免疫原性組合物可以用于治療、預(yù)防或防治抗原引起的或與抗原接觸相關(guān)的疾病或情況。例如，這種組合物可以用于特定的癌癥的治療或預(yù)防。
在本發(fā)明的另一部分提供了一種疫苗組合物，包括結(jié)合于微顆粒的至少一種抗原，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍。本發(fā)明的組合物尤其有用和有優(yōu)點的是它是一種有效的單劑量疫苗，但是也可以用于多劑量方案。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種單劑量的疫苗組合物，包括結(jié)合于微顆粒的至少一種抗原，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍。
“單劑量”是指在一次給予該組合物或疫苗后，體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答被刺激或增強(qiáng)到最大水平(“最大”是指這種水平不能被重復(fù)接種進(jìn)一步增強(qiáng))，或提供給這種組合物的受者以保護(hù)。施用可以通過任何合適的方式，如通過經(jīng)肌肉、經(jīng)腹腔、經(jīng)靜脈注射、口服、吸入、或通過黏膜表面或位置施用。
優(yōu)選的，抗原結(jié)合于微顆粒的表面。微顆粒的大小直徑在約0.03和0.5μm之間，優(yōu)選的在約0.03到0.15μm，更優(yōu)選的在約0.03到0.1μm，甚至更優(yōu)選的約0.03到0.05μm，甚至更優(yōu)選的約在0.03到0.049μm。仍更優(yōu)選的0.03到0.04μm或0.04到0.049μm。微顆粒最優(yōu)選的由聚苯乙烯、PLG、玻璃、磷酸鈣或金構(gòu)成。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明應(yīng)用的每種抗原都結(jié)合于固定大小的微顆粒上。
在另一個實施方案，本發(fā)明提供了一種單劑量疫苗組合物，它能增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，組合物包括結(jié)合于微顆粒的至少一種抗原，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍。
細(xì)胞應(yīng)答優(yōu)選的選自TH細(xì)胞、CTL和B細(xì)胞的刺激、成熟或增殖。體液應(yīng)答是優(yōu)選的選自IgA、IgG、IgM和它們的亞組。優(yōu)選的，IgG、IgA和/或IgM應(yīng)答被刺激。
這種組合物也可以刺激那些有助于增強(qiáng)或擴(kuò)增免疫應(yīng)答的細(xì)胞。這些包括但不限制于APC如髓樣或淋巴樣兩者來源的DC、和巨噬細(xì)胞。這些細(xì)胞的成熟、活化或增殖是預(yù)期之中的。
術(shù)語“包含”有著和上面提及的相同的含義。
術(shù)語微顆粒有著和上面提及的含義。優(yōu)選的微顆粒適合于被動物的抗原呈遞細(xì)胞所攝取。優(yōu)選的微顆粒在0.03和0.5μm之間，優(yōu)選的在0.03和0.15μm之間。更優(yōu)選的微顆粒在約0.03和0.10μm之間，更優(yōu)選的微顆粒在約0.03μm和約0.05μm之間。仍更優(yōu)選的微顆粒在約0.03到0.049或0.04和0.049μm。
術(shù)語“抗原”和“結(jié)合”有著上面提及的含義?？筛鶕?jù)意欲進(jìn)行預(yù)防接種的情況/疾病應(yīng)用任何合適的抗原。
給予患者的本發(fā)明的疫苗組合物的量是非關(guān)鍵性的或非限制性的。疫苗組合物的有效量是能刺激對抗抗原成分的免疫應(yīng)答，優(yōu)選的在單劑量或給藥后將引起強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液應(yīng)答。根據(jù)患者的免疫狀態(tài)(依賴于患者是否是免疫抑制或免疫刺激)，主治醫(yī)師或獸醫(yī)的判斷，是否該組合物被用作疫苗防治或治療疾病狀態(tài)，或作為防治腫瘤形成的疫苗，或是否疫苗被用做治療已經(jīng)存在的腫瘤，給予的組合物的量可以不同。例如，患者可以接受1μg到10,000μg的本發(fā)明的組合物，更優(yōu)選的50μg到5,000μg，仍更優(yōu)選的100μg到1,000μg和甚至更優(yōu)選的100μg到500μg的本發(fā)明的組合物。佐劑通常是不需要的，然而，佐劑可以用于接種。合適的佐劑包括明礬，和任何其他佐劑或在應(yīng)用于人的疫苗工藝中已經(jīng)熟知的佐劑。
本發(fā)明的疫苗可以通過注射施用，通過口服給藥，或通過黏膜表面或位置給藥。在一個實施方案中，疫苗通過基因槍方式施用。根據(jù)本發(fā)明如果應(yīng)用亞鐵微顆粒和金微顆粒是特別適合于通過基因槍施用。然而，其他類型的抗原微顆粒可以按此方式給藥。例如，來源于瘧疾基因庫的抗原，根據(jù)Smooker PM等(《疫苗》18(22)2522-2540“表達(dá)基因庫免疫保護(hù)小鼠對付毒性瘧疾的挑戰(zhàn)”)描述的方法，DNA或質(zhì)粒已經(jīng)顯示是能被基因槍有效地施用。在此將其全文并入作為參考。接種可以通過單或多劑量施用或通過接觸抗原一加強(qiáng)而進(jìn)行。
在本發(fā)明的另一實施方案提供了一個在研究對象上引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，上述方法包括給予研究對象施用免疫有效量的包含至少一種結(jié)合于微顆粒的抗原的組合物，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍。
研究對象可以是任何被要求去引發(fā)免疫應(yīng)答的人或動物。這包括家養(yǎng)動物、家畜(如牛、養(yǎng)、馬、母牛、豬、山羊、美洲駝羊、家禽、鴕鳥、鴯鹋)和本土和外來動物，野生動物和兇猛動物。
術(shù)語“包含”有著和上面提及的相同的含義。
免疫有效量指的是能在研究對象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的有效劑量，優(yōu)選的在單次給予后產(chǎn)生免疫應(yīng)答。免疫有效量的不同依賴于很多因素包括上面討論的，和可能依賴于研究對象是否是人或動物，它們的年齡，體重等。
術(shù)語“抗原”和“結(jié)合”有著和和上面提及的相同的含義。
術(shù)語“免疫應(yīng)答”指的是上面描述的細(xì)胞和體液應(yīng)答，也是上面描述的輔助增強(qiáng)或擴(kuò)增免疫應(yīng)答的細(xì)胞的應(yīng)答。特別的，免疫應(yīng)答可以被樹突狀細(xì)胞的增殖和/或擴(kuò)增來提供，尤其是DEC205+，CD40+和CD86+細(xì)胞，術(shù)語微顆粒有著和上面提及的相同的含義。
優(yōu)選的微顆粒在0.03和0.5μm之間，更優(yōu)選的在0.03和0.1μm之間。仍更優(yōu)選的在0.03和0.1μm之間，甚至更優(yōu)選的微顆粒在約0.03μm和約0.05μm之間。甚至更優(yōu)選的在約0.03和0.04或0.19和0.049μm。仍更優(yōu)選的抗原/微顆粒組合物特別適合于引發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞和或體液免疫應(yīng)答。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一個在研究對象上引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，上述方法包括給予研究對象一個免疫有效量的包含至少一種結(jié)合于微顆粒的抗原的組合物，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍，并且免疫應(yīng)答包括刺激和/或擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞。優(yōu)選的微顆粒是約40到50nm，最優(yōu)選的是40到49nm大小。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一個通過單劑量引發(fā)對抗原的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，上述方法包括施用，僅是單次給予研究對象，免疫有效量的、包括至少一種結(jié)合于微顆粒的抗原的組合物，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍，并且免疫應(yīng)答包括刺激和/或擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞。優(yōu)選的所述微顆粒是約40到50nm，最優(yōu)選的是40到49nm大小。
在另一部分本發(fā)明提供了一種為了引發(fā)免疫應(yīng)答在體內(nèi)將抗原轉(zhuǎn)運(yùn)入樹突狀細(xì)胞的方法，上述方法包括給予研究對象施用免疫有效量的、包括至少一種結(jié)合于微顆粒的抗原的組合物，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍，并且免疫應(yīng)答包括刺激和/或擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞。優(yōu)選的微顆粒是約40到50nm，最優(yōu)選的是40到49nm大小。
本發(fā)明也擴(kuò)展到一種制造免疫原性微顆粒/抗原組合物的方法，其包含將具有和病毒一樣的大小范圍的微顆粒與一種或多種抗原接觸，以使得微顆粒和抗原相結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)熟知用于制造這種組合物的技術(shù)。
發(fā)明的詳細(xì)闡述本發(fā)明現(xiàn)在將參考下面的非限制性的實施例和圖表來描述。


圖1組A-巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞比較對不同大小微顆粒的不同攝取。每細(xì)胞1000個0.02，0.1或1微米的熒光珠與培養(yǎng)的、來自C57BL/B6小鼠的腹膜滲出液的巨噬細(xì)胞或骨髓來源的樹突狀細(xì)胞一起孵育過夜，F(xiàn)ACSCan檢測熒光細(xì)胞百分比。三個相似實驗之一被顯示。用10倍的珠濃度，與珠或Balb/c來源的抗原呈遞細(xì)胞作用3小時，得到在攝取不同大小的珠上的類似的差異。組B-病毒大小的顆粒在體內(nèi)淋巴結(jié)的細(xì)胞中被優(yōu)先發(fā)現(xiàn)。左邊在腳趾處用50微升的0.1％的不同大小(0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1和2微米)的熒光珠溶液皮內(nèi)接種于C57BL/B6小鼠，10天后取走引流的腘淋巴結(jié)，用FACScan檢測已攝取珠的細(xì)胞的百分比。數(shù)據(jù)用三次重復(fù)樣本的平均熒光細(xì)胞百分比+/-標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示。0.04和0.1微米大小的顆粒有著比其他任何大小的顯著更高的攝取(p＞0.001)。在僅用0.1或1微米珠的類似的實驗中，0.1微米珠在接種后3，6，9天收集的淋巴結(jié)中比1微米珠有著顯著更高的攝取。組C和D-病毒大小顆粒被淋巴結(jié)NLDC145+(也稱為DEC205+)(組C)和F4/80+(組D)細(xì)胞優(yōu)先攝取。用FACScan分析已攝取熒光顆粒的淋巴結(jié)細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞標(biāo)記NLDC145/DEC205或巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞標(biāo)記F4/80的共表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示歸結(jié)于珠攝取而發(fā)出熒光的NLDC145+或F4/80+細(xì)胞百分比。
圖2組A-用結(jié)合于不同大小珠的OVA通過接種誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素γ的CD8和CD4 T細(xì)胞。用100μg結(jié)合于0.02，0.04，0.1，0.2，0.5，1或2微米大小珠的OVA皮內(nèi)接種C57BL/B6小鼠兩次(間隔10天)，用IFNγ ELISPOT檢測追加接種10天后的脾T細(xì)胞活性。測定對H-2Kb限制的CD8 T細(xì)胞抗原決定簇SIINFEKL或整個OVA的應(yīng)答。對于檢測對OVA的反應(yīng)性，在檢測前用磁珠(Dynabeads)先消除脾細(xì)胞中的CD8 T細(xì)胞再定量OVA反應(yīng)性的CD4 T細(xì)胞。應(yīng)用的SIINFEKL為2.5μg/ml和OVA為25μg/ml。三個相似實驗之一被顯示。對于每種大小的珠每組中接種2只小鼠。ELISPOT培養(yǎng)被重復(fù)兩次，用每100萬個被測定的細(xì)胞中的斑點形成單位(SFU)的平均值表示。標(biāo)準(zhǔn)差(SD)一直小于平均值的20％。組B-反應(yīng)于SIINFEKL時通過ELISPOT檢測的細(xì)胞毒活性的T細(xì)胞和分泌r干擾素的T細(xì)胞之間的相關(guān)性。用不同大小的OVA珠接種C57BL/B6小鼠，用上面描述的IFNγELISPOT檢測對SIINFEKL的活性。此外，通過有限稀釋分析平行檢測SIINFEKL特異的細(xì)胞毒活性的T細(xì)胞數(shù)目。帶鉻的EL4細(xì)胞本身或用2.5μg/ml的SIINFEKL預(yù)處理的EL4細(xì)胞被用做靶細(xì)胞。顯示的數(shù)據(jù)說明了兩個檢測之間的強(qiáng)相關(guān)性(R平方＝0.9254)。兩個相似實驗之一被顯示。組C-用結(jié)合于不同大小的珠的OVA接種誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。從組A中描述的小鼠中收集血清，用ELISA檢測稀釋血清的OVA特異性IgG應(yīng)答性。接受0.02，0.04，O.1，0.2，0.5，1或2微米大小的OVA珠接種的個體小鼠被標(biāo)記。兩個相似實驗之一被顯示。
圖3抗原共價結(jié)合于珠對于誘導(dǎo)理想的T細(xì)胞應(yīng)答是必要的。組A-珠結(jié)合的OVA本身說明I型MHC限制性T細(xì)胞應(yīng)答。用OVA共價結(jié)合的先前未透析的(對照)或用PBS通過300Kd分離膜透析的(透析)0.04微米珠接種C57BL/B6小鼠，用ELISPOT檢測一次皮內(nèi)接種10天后對生成干擾素γ的脾SIIFEKL特異性CD8 T細(xì)胞的誘導(dǎo)。用在兩次重復(fù)實驗中ELISPOT檢測的每組4只小鼠的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤表示。組B-合用珠和可溶性O(shè)VA不能誘導(dǎo)理想的MHC I型限制性的T細(xì)胞應(yīng)答。用共價結(jié)合于0.1微米珠的OVA(珠結(jié)合的OVA)或注射前與OVA混合的珠(珠/OVA混合)接種C57BL/B6小鼠。用ELISPOT檢測一次皮內(nèi)接種10天后對生成干擾素γ的脾SIIFEKL特異性CD8 T細(xì)胞的誘導(dǎo)。兩次重復(fù)實驗中ELISPOT檢測每組中兩只小鼠的平均T細(xì)胞前體頻率被顯示。
圖4用病毒大小的珠-OVA的單次接種能有效地誘導(dǎo)持久的高水平的I型MHC限制性的T細(xì)胞。組A-用珠-OVA(0.1微米)皮內(nèi)接種C57BL/B6小鼠1次，2次或3次，每次14天間隔，用ELISPOT檢測每組最后一次接種10天后它們的干擾素γ對SIINEKL的應(yīng)答。每組中有3只小鼠被接種，數(shù)據(jù)顯示每個小鼠兩次實驗的平均值。兩個相似實驗之一被顯示。組B-用珠-OVA(0.1微米)接種一次小鼠，并在12天或82天后通過ELISPOT測定干擾素γ對SIINFEKL或OVA的應(yīng)答。如圖2顯示測定對OVA的抗體水平保持到第82天。
圖5檢測皮內(nèi)接種后引流淋巴結(jié)內(nèi)攝取珠的細(xì)胞的CD40的表達(dá)。來自純種C57BL/6小鼠(左)或用熒光0.04μm熒光珠皮內(nèi)接種于腳趾的小鼠的腘淋巴結(jié)在注射后48小時被分離，用PE結(jié)合的對這些標(biāo)記物特異的抗體的染色來分析CD40的表達(dá)。FL-1＝FITC陽性細(xì)胞(珠陽性)和FL-2＝PE陽性細(xì)胞(標(biāo)記物陽性)。背景染色可以忽略(小于1％)。左邊組表示來自非接種動物的腘淋巴結(jié)細(xì)胞，右邊組表示來自VAP-OVA接種動物的相同類型細(xì)胞。
圖60.1μm OVA-珠誘導(dǎo)成熟和不成熟小鼠DC的增殖。DC培養(yǎng)來自從C57BL/6小鼠后腿的脛骨和股骨提取的骨髓細(xì)胞，加有GM-CSF和IL-4。培養(yǎng)5天后，細(xì)胞按1.25×106細(xì)胞/1.25ml被分成實驗條件和與每細(xì)胞1000珠的結(jié)合有OVA的珠(0.1μm)處理。4小時處理后，在培養(yǎng)物中加入LPS和a干擾素。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)過夜，胸腺嘧啶核苷增殖分析設(shè)定在第二天，孵育過夜。每個數(shù)值代表三次的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤(未處理的DC和實驗組之間的*p＜0.00001，非配對t檢驗)。
圖7在腳趾處注射有50μl 0.04或1μm熒光珠-OVA的C57BL/6小鼠體內(nèi)攝取0.04μm和1μm顆粒的APC表型特征的比較。48小時后分析引流的腘淋巴結(jié)的珠陽性細(xì)胞的活性與抗原呈遞細(xì)胞系的細(xì)胞標(biāo)記物的共染色。用3-14只小鼠/標(biāo)記物的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差表示。0.04和1μm熒光珠陽性細(xì)胞有著顯著不同的DEC205、F4/80、CD40、CD80和CD86(p＜0.05)的表達(dá)。
圖8ADC攝取病毒大小的顆粒的機(jī)制。骨髓來源培養(yǎng)的DC與0(黑色)、5(白色)、10μM(灰色)的十四酸佛波酯乙酸鹽(PMA)；0(黑色)、1(白色)、3mM(灰色)的阿米洛利(amiloride，AML)或0(黑色)、0.25(白色)或0.5μg/ml(灰色)的松胞菌素D(cytochalasinD，CCD)孵育30分鐘，然后加入0.04μm的OVA熒光顆粒繼續(xù)3小時。選擇性抑制內(nèi)凹、網(wǎng)格蛋白包被的小凹形成或吞噬已經(jīng)在10μM PMA、3mM阿米洛利和0.5μg/ml CCD中被報道，相應(yīng)的14，15。當(dāng)同時使用時，PMA恒定在10μM，而加入AML 1(白色)或3mM(灰色)。用FACScan檢測熒光細(xì)胞數(shù)目。數(shù)據(jù)用三次培養(yǎng)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
圖8B確認(rèn)攝取的機(jī)制。DC在有或無1μg/ml CDD、1μg/ml非律平(FIL)或40mM氯化銨(AC)條件下孵育30分鐘，加入0.04μm或1μm的熒光珠繼續(xù)3小時。選擇性抑制內(nèi)凹或網(wǎng)格蛋白有被小凹形成在1μg/ml非律平和40mM氯化銨中被報道，相應(yīng)的14-17，29。用FACScan檢測熒光細(xì)胞數(shù)目。數(shù)據(jù)用三次培養(yǎng)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
圖9可溶性O(shè)VA和1μmOVA珠不能誘導(dǎo)與0.05μmOVA-珠能相比較的保護(hù)。C57/B6小鼠用結(jié)合于0.05μm或1μm珠的OVA、可溶性O(shè)VA接種或不處理，然后如上比較。數(shù)據(jù)用每組8個動物在第10天時個體腫瘤大小來表示。兩次相似實驗之一被顯示。0.05μmOVA-珠組和其他任何一組的腫瘤頻率的差異是顯著的P＝0.0001對未處理組；P＝0.0007對可溶性組和P＝0.0035對1μmOVA-珠組。
圖10病毒大小的顆粒不能和早期內(nèi)體共存(左側(cè))。骨髓來源的DC和0.1微米珠-OVA(500珠/細(xì)胞)孵育過夜，輕輕洗滌以洗去游離珠，涂在玻璃載片上用于共聚焦顯微鏡。細(xì)胞然后用多聚甲醛固定，用triton增加通透性，用生物素結(jié)合的早期內(nèi)體標(biāo)記物Rab4的單克隆抗體染色，再加入抗生蛋白鏈霉素-Alexa。在未結(jié)合的0.04和0.1微米的珠中觀察到了相似的結(jié)果，顯示了三個實驗之一。用DC和珠孵育30分鐘或3小時，0.1微米珠同樣不能和Rab4染色共存(右側(cè))。將0.1微米的珠-OVA皮內(nèi)注射在小鼠的后腳趾，48小時后切除引流的腘淋巴結(jié)如上用于共聚焦分析。Rab4標(biāo)記物和OVA結(jié)合或未結(jié)合的0.1微米或0.04微米珠沒有發(fā)現(xiàn)有共存。顯示了三個實驗之一。相反的，在用1微米大小的熒光珠接種的陽性對照小鼠中確定有共存。
圖11保護(hù)性對抗腫瘤。組A用OVA-VSSP(接種)單次皮內(nèi)接種或未處理(純種)的C57/B6小鼠30天后用5×106EG7(腫瘤細(xì)胞)挑戰(zhàn)。用測徑器測定腫瘤大小。顯示了每組10只動物個體的腫瘤生長曲線。組B腫瘤如上誘導(dǎo)，在第8天的腫瘤生長(第0天接種)，6只動物未處理(純種)和6只用OVA-VSSP皮內(nèi)接種(接種)顯示了接種后3-13天個體的生長曲線。
圖12VSSP接種后小鼠經(jīng)受致命瘧疾挑戰(zhàn)的生存率。用100μgVSSP-OVA、VSSP-裂解物或裂解物本身皮內(nèi)接種C57/B6小鼠，再將之用500,000致命性約氏瘧原蟲17XL感染的C57/B6紅細(xì)胞挑戰(zhàn)。每天監(jiān)測生存率。每組感染5只動物，六個代表性實驗之一被顯示。在相似實驗中，純種小鼠在2周后有40％生存率(8/20)。將約氏瘧原蟲17XL感染的紅細(xì)胞反復(fù)凍融得到裂解物，超速離心，用標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)合到VSP上。
圖13按上面對抗原OVA描述的將抗原nm23被結(jié)合到0.05μm珠(VSP)，100μg/小鼠皮內(nèi)注射到小鼠，10天后用ELISPOT檢測接種動物脾中干擾素γ應(yīng)答性。應(yīng)答于nm23的前體細(xì)胞頻率的數(shù)據(jù)用每100萬脾細(xì)胞的斑點形成單位來表示，平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。三只小鼠(m1-m3)的個體應(yīng)答被顯示。
圖14每方案中腫瘤抗原nm23或OVA被結(jié)合到VSP，100μg/小鼠皮內(nèi)注射。10天后用ELISPOT檢測白介素4分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)。數(shù)據(jù)用每種免疫原接種的三只獨立小鼠的斑點形成單位/百萬細(xì)胞+/-標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
圖15A用結(jié)合有OVA的0.05μm珠(VSP-OVA)單次皮內(nèi)接種小鼠血漿對OVA的抗體反應(yīng)性，90天后用ELISA(B組)檢測與未接種對照(A組)的比較。
圖15B用ELISA檢測來自圖15A中小鼠的相同血漿中的OVA特異IgE抗體，在兩個純種小鼠(A2和A3)和三個VSP-OVA小鼠(B2，3和5)。
圖16組A單次接種誘導(dǎo)持久的抗體應(yīng)答。C57/B6小鼠用OVA結(jié)合的0.04μm珠單次接種，在不同的時間點收集血漿。顯示了OVA特異的IgG的ELISA里，每組4個動物在405nm的平均光密度+/-平均差。未經(jīng)免疫的血漿作為陰性對照。兩次相似實驗之一被顯示。相似的ELISA結(jié)果在總Ig中得到，沒有IgM或IgA被檢測到(未顯示)。OVA單獨不能誘導(dǎo)PBS接種的動物的IgG應(yīng)答，在完全Freund佐劑(CFA)中的OVA誘導(dǎo)的IgG應(yīng)答比單劑量0.05μm珠-OVA對數(shù)級更高(未顯示)。組B用0.04μm珠-OVA單次接種對持久的高水平的生成干擾素γ的T細(xì)胞的誘導(dǎo)。用結(jié)合于0.04μm珠的OVA(黑色或格子柱)，PBS中的可溶性O(shè)VA(白色柱)或用混合于0.04μm珠的OVA(灰色柱)皮內(nèi)接種C57/B6小鼠。用IFNγELISPOT檢測10天后(黑、白和灰色柱)或12月后(格子柱)的SIINFEKL活性脾T細(xì)胞的前體細(xì)胞頻率。每組中有四只小鼠被測定，兩次相似實驗之一被顯示。每組的每100萬細(xì)胞的斑點形成單位(SFU)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差被顯示。在相似實驗中，用降低10倍的抗原(10μgVSP-OVA)單次接種誘導(dǎo)出每100萬的102+/-56SIINFEKL特異性脾細(xì)胞(n＝4)。單次接種的10天后在標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放檢測中也觀察到了細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答(對于3/3動物大于50％特異性裂解在E∶T＝20∶1，沒有顯示)。
圖17初始/追加接種C57/B6動物分成未處理組或最初用100μg來自MUC1的肽cp13-32，其在完全Freunds佐劑(cp13)中結(jié)合到700μg的KLH，或用結(jié)合到重組MUC1-GST融合蛋白(MFP)的甘露聚糖，或用0.1μm結(jié)合到MUC1-GST融合蛋白的VSP(VSP)，進(jìn)行皮內(nèi)注射。10天后動物被用100萬有傳染性的表達(dá)MUC1蛋白的痘病毒再次加強(qiáng)接種，10天后用IFNγELISPOT檢測對Cp13-32抗原簇的反應(yīng)性。數(shù)據(jù)用每組2-3動物平均的每100萬脾細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ細(xì)胞的平均數(shù)目+/-平均差來表示。
圖18比較聚苯乙烯和玻璃的0.05μmVSP-OVA顆粒。聚苯乙烯0.05μm珠如上所述被結(jié)合到OVA(PS)并與以同樣方式結(jié)合到玻璃珠的OVA(G1)作比較。另外，一種不同的化學(xué)操作比較于玻璃珠。簡言之，玻璃珠被稱量，懸浮在PBS中形成2.5％固體，洗滌2遍。在微量離心機(jī)中離心5分鐘去除PBS。珠被重懸在8％戊二醛的pH值7.4的PBS溶液中，在室溫下輕輕混合過夜。珠用PBS再洗滌3遍，重懸在PBS中。加入每毫升500ug的蛋白，輕輕混合5小時。珠被沉淀，將沉淀物重懸在0.5M的氨基乙醇中混合30分鐘而終止反應(yīng)。用PBS洗滌珠并用于接種(G2)。將聚苯乙烯(PS)或玻璃(G1或G2)的VSP-OVA按100μg/小鼠的量皮內(nèi)接種，10天后ELISPOT定量化來源于脾的SIINFEKL特異性分泌干擾素γT細(xì)胞。數(shù)據(jù)用每組三只動物的個體平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差表示。
圖19珠結(jié)合形式和免疫原性。50mM MES緩沖液(pH 6.0)中的2mg/ml卵白蛋白與聚苯乙烯羥基修飾的0.05μm的珠(2％固體)混合15分鐘。在每份制備物中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳二亞胺到4mg/ml(pH 6.5)，在室溫下孵育2小時。標(biāo)準(zhǔn)(甘氨酸)用7mg/ml甘氨酸或20μl 1M pH 7.4的氨基乙醇(胺)，或20μl 1MpH 8.0的胺乙醛二甲基乙縮醛(醛)，或20μl 1M pH 7.4的乙二胺(醇)淬火。制備物在室溫下孵育近16小時。所有的制備物在4℃下PBS中透析過夜。醛的制備物進(jìn)一步用20μl 1M HCL淬火并孵育4小時，在4℃下PBS中透析過夜。用100μg每種VSSP-OVA顆粒皮內(nèi)接種2-3只C57/B6小鼠，用干擾素γELISPOT檢測脾中針對CD8 T細(xì)胞抗原決定簇SIINFEKL的免疫原性。結(jié)果用每只動物中每100萬脾細(xì)胞中斑點形成單位的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差來表示。
實施例1使用的材料和方法小鼠和接種6-8周大小的C57BL/6和BALB/c小鼠都購自Walter和Eliza Hall。小鼠以100ul的抗原結(jié)合珠皮內(nèi)(ID)接種在后腳趾。
試劑所有試劑包括抗原卵白蛋白(OVA，III級)和1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺(EDAC)，除非另外說明都購自Sigma公司。用于FACScan和共聚焦研究的單克隆抗體來自在蛋白G柱(Pharmacia)上自雜交瘤系自制(in house)純化或購自Pharmigen。FITC結(jié)合的和羧化的0.02-2μm熒光球都購自Molecular Probes，非熒光的羧化微球購自Polysciences。使用了以下標(biāo)記物的抗體MHCII、MHC I、CD11c、CD11b、F4/80、NLD-145、CD8 alpha、CD40、CD80和CD86。共聚焦研究中使用的抗Rab4單克隆抗體是Dr.Russel(Peter McCallum Research Institute)的惠贈品。
抗原呈遞細(xì)胞樹突狀細(xì)胞制備于骨髓單核細(xì)胞按以前發(fā)表的方法稍加改動[5]。簡要的，通過用培養(yǎng)基將細(xì)胞從后肢的脛骨和長骨的骨腔中沖洗出來，收集后接著裂解紅細(xì)胞。細(xì)胞按1×106/ml種植在RPMI(CSL、AUST)中，其中含有10％熱滅活的胎牛血清(FCS)，4mM L-谷酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素、100μM巰基乙醇、1000U/ml GM-CSF和0.2ng/ml的白細(xì)胞介素-4。在直徑100mm的petri-dishes中的10ml培養(yǎng)基在潮濕的CO2孵箱中37℃下生長5-6天。在腹膜內(nèi)注射硫膠質(zhì)3天后從小鼠的腹膜腔內(nèi)獲得巨噬細(xì)胞，如所述方法培養(yǎng)3天來富集粘附細(xì)胞組分。
珠-抗體結(jié)合按生產(chǎn)商說明進(jìn)行。簡要的，OVA在0.05M MES緩沖液pH6.0中稀釋為2.0mg/ml，和2％固體/體積的珠按體積比1∶1混合。輕輕搖動混合液15分鐘，然后加入4mg/ml EDTA。用稀釋的NaOH將混合液pH值調(diào)整為6.5。輕輕搖動混合液2到3小時。加入甘氨酸使得其終濃度為100mM以終止反應(yīng)。混合30分鐘后，制備物在冷PBS中透析過夜。制備物可以馬上使用或與0.01％疊氮化物儲存在4℃?zhèn)溆谩?br> 細(xì)胞毒檢測按[3]描述的方法進(jìn)行。簡要的，用于細(xì)胞毒檢測的效應(yīng)細(xì)胞為脾細(xì)胞，在2ml培養(yǎng)皿按2.5×106/ml在37℃、潮濕的CO2孵箱，和含10μg/ml肽抗原的RPMI(CSL、AUST)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，其中含有10％熱滅活的胎牛血清(FCS)，4mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素和100μmβ-巰基乙醇。白介素2(10U/ml，重組人白介素2，Lymphocult HT、Biotest、UK)在第三天加入。靶細(xì)胞是51Cr標(biāo)記的EL4細(xì)胞，單獨(背景)或在37℃下和10μg/ml SIINFEKL肽預(yù)處理1小時，或EG7，一種卵白蛋白轉(zhuǎn)化的EL4細(xì)胞株。除非另外說明，檢測在效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞比為20∶1下重復(fù)2次。在四次重復(fù)實驗中對所有靶細(xì)胞都設(shè)定了自發(fā)裂解(僅有培養(yǎng)基)和最大裂解(有5％triton)。4小時后收集上清。裂解％計算為100×(實驗釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)。特異裂解％(SL％)為肽裂解％-無肽裂解％。
細(xì)胞毒T細(xì)胞前體(CTLp)檢測CTLp檢測按以前描述的[7]進(jìn)行。對于至少6個效應(yīng)細(xì)胞數(shù)目(1×103-1.28×105)，要至少32次重復(fù)以得到CTLp頻率。5×105絲裂霉素C處理過的同源脾細(xì)胞被培養(yǎng)在U底的微量滴定盤上的含有10％胎牛血清、5μM SIINFEKL或OVA和10U/ml重組人白介素2的DMEM中。7天后，用以含有10451Cr標(biāo)記的EL4或EG7細(xì)胞為靶細(xì)胞的100μl靶細(xì)胞懸液取代100ml的培養(yǎng)基來檢測每個微培養(yǎng)的細(xì)胞毒性。如果發(fā)現(xiàn)每個盤中Cr的釋放在僅和刺激物共培養(yǎng)的104個效應(yīng)細(xì)胞或僅和肽或僅和重組人白介素2的刺激細(xì)胞中的平均同位素釋放值的3個標(biāo)準(zhǔn)誤之上，那么認(rèn)為存在細(xì)胞毒活性。在應(yīng)答細(xì)胞數(shù)目之間存在著線性關(guān)系(0.987≤r2≤1)，表現(xiàn)為線性曲線，陰性細(xì)胞頻率為對數(shù)曲線。CTLp頻率用達(dá)到產(chǎn)生37％陰性孔的應(yīng)答細(xì)胞劑量的倒數(shù)表示。CTLp頻率檢測進(jìn)行3次，每次頻率差異不超過平均值的20％。
ELISPOT IFNγ檢測按[3]描述的進(jìn)行。簡要的，100μl的5×106/ml新近分離的脾細(xì)胞和設(shè)定的刺激物在預(yù)包被抗小鼠IFNγ單克隆抗體(R4)的乙酸板(MAHA Millipore)上培養(yǎng)18小時(EACC)。每個條件都設(shè)置復(fù)孔。應(yīng)用的培養(yǎng)基為RPMI1640(CSL)，附加物同上描述。過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞被洗滌，板和第二種生物素結(jié)合的抗小鼠IFNγ單克隆抗體(XMG.21-生物素、Pharmigen、CA、USA)孵育，之后結(jié)合1μg/ml的extravidin堿性磷酸酶(A-AP)(Sigma)。用比色法AP檢測試劑盒((Biorad、Hercules、CA、USA)檢測堿性磷酸酶活性斑點，利用解剖顯微鏡計數(shù)。數(shù)據(jù)用每百萬細(xì)胞的斑點形成單位表示。使用的SIINFEKL肽為2.5μg/ml。
統(tǒng)計分析在保護(hù)性研究中，每組受保護(hù)的小鼠數(shù)目的比較用Epilnfo Version 5.0的STAT程序的卡方檢驗。在免疫原性研究中，組間的ELISPOT和Cr釋放應(yīng)答的比較用Microsof Excel Version 5.0a中的Student′s t檢驗。線性回歸用于檢測免疫原性和保護(hù)性之間的相關(guān)性用SPSS for Windows統(tǒng)計軟件包，樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞攝取珠在顯微鏡玻片上的生長3天的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物和5天的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)物用不同大小的熒光微珠孵育5分鐘到24小時。培養(yǎng)物被洗滌以去除游離的珠和準(zhǔn)備用于FACScan或共聚焦分析。
體內(nèi)攝取珠的細(xì)胞分析從珠接種的小鼠中從接種后12小時直到12天間隔不同時間收集其引流的淋巴結(jié)和脾。收集細(xì)胞，裂解紅細(xì)胞后洗滌，準(zhǔn)備用于FACScan或共聚焦分析。
細(xì)胞表面標(biāo)記物染色和流式細(xì)胞分析對于表面染色，5×105細(xì)胞與PE標(biāo)記的抗表面標(biāo)記物F4/80和NLD-145、CD的單克隆抗體孵育。對于那些不能被直接標(biāo)記的抗體，兩步洗滌后，細(xì)胞和對第一種抗體特異的第二種PE標(biāo)記的抗體孵育。在和第二種抗體孵育之前的封閉步驟中使用生產(chǎn)第二種抗體的物種的天然血清。兩次洗滌后，細(xì)胞用PBS/0.2％多聚甲醛洗滌，用FACScan流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)和CeIlQuest軟件分析。設(shè)定光柵門以去除死細(xì)胞和非淋系細(xì)胞。來自珠接種的未經(jīng)任何表面標(biāo)記染色的細(xì)胞和來自天然小鼠經(jīng)對表面標(biāo)記的PE標(biāo)記抗體染色的細(xì)胞用于確定FITC和PE發(fā)射譜之間重疊的校正。
吞噬FITC標(biāo)記的珠的共聚焦顯微鏡檢測使用Olympus鏡頭的共聚焦顯微鏡，帶有Krypton-Argon激光光源，裝備有雙重的熒光和發(fā)射檢測來確定是否不同大小的熒光珠被巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞吞噬。將標(biāo)本制成0.5-1.0微米尺寸的的系列切片以確定吞噬作用和用Optiscan分析儀分析。細(xì)胞在488nm和568nm被激活相應(yīng)熒光素和Alexa594，相應(yīng)的通過530nm和610nm區(qū)帶濾過片來檢測。所有的采集中，激光能保持在飽和水平以下，增益和補(bǔ)償參數(shù)在單一實驗中固定。
ELISA檢測用ELISA測定反應(yīng)于OVA的抗體。聚氯乙烯板用OVA(10μg/ml在0.2M NaHC03緩沖液、pH 9.6)4℃包埋過夜。板用PBS/0.05％Tween20洗滌4遍和PBS洗滌4遍，利用2％小牛血清白蛋白非特異性結(jié)合在室溫下封閉1小時。如上洗滌后，加入小鼠血清的系列稀釋液，室溫下孵育1小時。非免疫小鼠的血清作為陰性對照。板被洗滌，用辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗小鼠Ig(Selinus、AUS)和顯色底物2，2’-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(Amersham、UK)檢測結(jié)合的抗體。用EL 312e微量反應(yīng)板讀取器記錄在405nm的吸光度。
實施例2體內(nèi)和體外抗原呈遞細(xì)胞對VSSP的優(yōu)選攝取。
大量利用來自巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞系的研究已經(jīng)顯示顆粒大小依賴性的吞噬作用，理想的攝取是1微米直徑[10，11]。在樹突狀細(xì)胞中也觀察到了攝取，然而，顆粒大小的綜合范圍還沒有被測定。發(fā)明者尤其感興趣于是否病毒大小的蛋白包被的顆粒(0.03-0.1μm)也能被樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞有效地攝取。圖1a顯示硫膠質(zhì)引發(fā)的腹膜滲出液的巨噬細(xì)胞內(nèi)吞了1μm和0.1μm的熒光素標(biāo)記的顆粒(熒光素珠)。相反的，發(fā)現(xiàn)未成熟的骨髓來源的樹突狀細(xì)胞優(yōu)先攝取0.1μm大小的熒光素珠。共聚焦顯微鏡用于確認(rèn)顆粒在細(xì)胞內(nèi)(未顯示)。這體內(nèi)數(shù)據(jù)提示病毒大小的實心顆粒(VSSP)在體內(nèi)也能被抗原呈遞細(xì)胞優(yōu)先攝取。一組不同大小(0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1和2μm)的熒光素聚苯乙烯蛋白結(jié)合的顆粒被皮內(nèi)注射到C57/B6小鼠的腳趾中。10天后收集引流淋巴結(jié)的細(xì)胞用于FACScan分析。0.04-0.1μm大小的顆粒被淋巴結(jié)細(xì)胞優(yōu)先攝取(圖1b)。分析顆粒注射后的第1、3、6和10天的淋巴結(jié)細(xì)胞和未結(jié)合的顆粒取得了相同的結(jié)果。VSSP被同時表達(dá)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗原呈遞細(xì)胞有效攝取(圖1b)。骨髓來源的樹突狀細(xì)胞體外也攝取VSSP。和預(yù)想的一樣，這些細(xì)胞主要是髓系表型的[12]。
實施例3VSSP誘導(dǎo)高的細(xì)胞毒和IFNγ分泌T細(xì)胞的前體頻率和抗體體內(nèi)樹突狀細(xì)胞對VSSP的有效攝取提示它們可以用作靶抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)和新疫苗的潛能。用卵白蛋白(OVA)包被的0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1或2μm顆粒接種C57/B6小鼠，15天后追加接種，10天后收集血清或脾細(xì)胞。圖2a顯示用0.04μm大小的顆粒獲得了對MHC I型限制性SIINFEKL抗原決定簇誘導(dǎo)的IFNγ分泌CD8 T細(xì)胞的滿意誘導(dǎo)。應(yīng)答于OVA的CD4 T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)有著于OVA結(jié)合的范圍在0.04-1微米的顆粒相似的前體頻率。VSSP誘導(dǎo)的對SIINFEKL的細(xì)胞毒T細(xì)胞和IFNγ分泌T細(xì)胞的前體頻率相關(guān)(R2＝0.92)(圖2b)。OVA特異IgG在用0.04μm接種的小鼠具有最高的前體頻率，其次為用1μm顆粒接種的小鼠中。用無熒光素的VSSP也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。因此，與許多免疫原和佐劑優(yōu)選地啟動細(xì)胞或體液應(yīng)答不同，VSSP對兩者都能誘導(dǎo)出高水平的應(yīng)答。
圖2顯示的結(jié)果是基于注射相同總量的結(jié)合抗原，但未消除殘留的可溶性抗原。圖3a顯示在可溶性抗原被透析或超速離心去除后，用0.04微米VSSP獲得了相似的T細(xì)胞應(yīng)答。因此，可溶性抗原對于觀察到的T細(xì)胞應(yīng)答沒有顯著的作用。這也被結(jié)合和未結(jié)合OVA和VSSP混合物的比較所支持。圖3b顯示只有共價結(jié)合的VSSP能誘導(dǎo)高水平的SIINFEKL特異性T細(xì)胞。因此，共價結(jié)合到VSSP對于在體內(nèi)將OVA導(dǎo)入I型呈遞途徑和誘導(dǎo)I型限制性的T細(xì)胞是必要的。能推測更大量的結(jié)合蛋白在更小的顆粒比在更大的顆粒能產(chǎn)生更高的VSSP免疫原性。然而，不是這樣，因為1)0.04μm為免疫原性高峰，而0.02μm大小的珠誘導(dǎo)出的反應(yīng)性極低(圖2)；2)0.04-0.1微米的VSSP比1μm顆粒一直具有更高的免疫原性，而不論結(jié)合抗原的水平；3)將1μm顆粒的接種濃度增加到所用VSSP的濃度的100倍(到1mg/小鼠)也不能將免疫原性增強(qiáng)到在結(jié)合于VSSP的一定濃度范圍的抗原上看到的水平；4)用等效價量的不同大小的珠上的結(jié)合蛋白，或用相同數(shù)目的不同大小的珠接種，一直顯示VSSP比濃度范圍廣泛(0.5-1000μg總OVA、0.5-50μg結(jié)合的OVAand 103-108珠/動物)的更大的顆粒有著更高的免疫原性。
實施例4顆粒攝取和加工的新途徑已經(jīng)顯示通過II型MHC加工途徑消化形成的肽能被返流并最終結(jié)合到細(xì)胞表面空置的I型MHC分子[1，10]。I型呈遞的不同機(jī)制是獨立于TAP(抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)子)介導(dǎo)的進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的轉(zhuǎn)運(yùn)。乙型肝炎病毒表面蛋白VLP在巨噬細(xì)胞內(nèi)通過非TAP依賴性機(jī)制被加工成I型呈遞[2]。發(fā)明者用OVA-結(jié)合的VSSP接種敲除TAP的C57/B6小鼠，在TAP敲除動物中沒有檢測到對SIINFEKL或OVA的上述背景水平的T細(xì)胞應(yīng)答，這提示對VSSP的I型呈遞相反的是TAP依賴的。對于吸收進(jìn)1μm顆粒的蛋白，外源性抗原的I型呈遞的TAP依賴性機(jī)制已經(jīng)被描述成基于內(nèi)飲囊泡的“滲漏”和抗原偶然地釋放到細(xì)胞漿內(nèi)[1，10]。被吞噬作用攝取的如此大的顆粒的加工包括了與表達(dá)Rab4銜接子蛋白的溶酶體早期結(jié)合的步驟[13]。本發(fā)明者用共聚焦顯微鏡確定是否VSSP將按這個途徑進(jìn)行。圖4顯示Rab4和含VSSP熒光珠的囊泡在骨髓來源的培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞和皮內(nèi)注射VSSP 24小時后體內(nèi)的淋巴結(jié)細(xì)胞中都沒有共存。因此，VSSP可能利用一種不同于VLP和更大顆粒的加工途徑，它是Rab4非依賴性和TAP依賴性的。機(jī)制在實施例7中進(jìn)一步研究。
實施例5VSSP在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞擴(kuò)增。
C57/B6或不處理或用熒光素0.1μm熒光珠在腳趾皮內(nèi)接種。在注射48小時后切除腘淋巴結(jié)(LN)，通過用PE結(jié)合的CD40特異性抗體染色分析該標(biāo)記物的表達(dá)。
結(jié)果(圖5)顯示0.04，0.05，0.1μm聚苯乙烯珠單獨或結(jié)合到OVA能增加皮內(nèi)接種后來自引流淋巴結(jié)的細(xì)胞總數(shù)達(dá)4倍。此外，它們能引起NLDC145+(樹突狀細(xì)胞標(biāo)記物)細(xì)胞的比例增加1.5倍，但對F4/80+(單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)細(xì)胞則不能。它們也增加表達(dá)活性分子CD40和CD86的淋巴結(jié)細(xì)胞的比例大于1.5倍。圖5顯示用FACScan觀察到接種后增加CD40+細(xì)胞的例子(33％到66％)。也顯示這些細(xì)胞中的許多已經(jīng)攝取0.04μm珠，在這里我們使用的綠色熒光素核心的0.04μm珠。
0.04，0.05和0.1μm的聚苯乙烯珠本身或結(jié)合到OVA能誘導(dǎo)純化于小鼠骨髓的樹突狀細(xì)胞在體外的擴(kuò)增。不成熟的，而非成熟(LPS和alpha腫瘤壞死因子活化后)的樹突狀細(xì)胞對于VSSP的激活效應(yīng)是敏感的(圖6)。
這些數(shù)據(jù)綜合提示，0.04-0.1μm大小的顆粒(VSSP)有著不可質(zhì)疑的、前所未知的刺激抗原呈遞細(xì)胞的能力，包括樹突狀細(xì)胞，和表達(dá)象CD40和CD86的有效共刺激分子的特殊細(xì)胞的增殖和擴(kuò)增。另外，這提示VSSP對于免疫應(yīng)答可能有佐劑效應(yīng)的機(jī)制，甚至是對于那些非化學(xué)性地與其結(jié)合的抗原所引起的應(yīng)答。
實施例6注射后快速攝取VSSP的細(xì)胞的擴(kuò)展表型為了進(jìn)一步評價哪類細(xì)胞在皮內(nèi)腳趾注射后快速地攝取VSSP(因此可能有關(guān)于隨后的免疫激活)，切除了引流的腘引流淋巴結(jié)。FACScan分析攝取了帶有熒光素核心的0.04μmVSSP-OVA的細(xì)胞表型，并與相同的但為1μm大小的顆粒比較。圖7顯示表達(dá)每種表型標(biāo)記物的0.04μm珠陽性或1μm珠陽性細(xì)胞比例。攝取0.04μm珠的細(xì)胞最大多數(shù)是NLDC145+，CD40+和CD86+。另外，更多的CD11c+、CD4+和CD8+細(xì)胞是0.04μm珠陽性多于1μm珠陽性。這種已經(jīng)攝取了0.04μm珠的細(xì)胞的高度激活的DC表型可能進(jìn)一步解釋我們觀察到的免疫應(yīng)答是如此有效的原因，尤其是CD8 T細(xì)胞應(yīng)答。
實施例7微顆粒的攝取和加工為了明確樹突狀細(xì)胞攝取0.04μm珠-OVA的機(jī)制，將骨髓來源的DC和吞噬作用的抑制物(松胞菌素D，CCD)，網(wǎng)格蛋白小凹的抑制物(阿米洛利，AML)或內(nèi)凹介導(dǎo)的內(nèi)飲作用的抑制物(十四酸佛波酯乙酸鹽，PMA)一起孵育。將DC分別和設(shè)定濃度的PMA、AML、CDD、非律平(FIL)或氯化銨(AM)(都來自Sigma)在三個復(fù)孔中培養(yǎng)30分鐘。加入OVA-熒光素0.04μm珠繼續(xù)3小時，用FACScan檢測攝取。
PMA和AML都減少了DC對0.04μm珠-OVA的攝取，但是CCD不能造成任何的抑制(圖8a)。PMA和AML的抑制具有相加作用(圖8a)。這提示網(wǎng)格蛋白小凹和內(nèi)凹都參與了VSSP的攝取。
阿米洛利作用是抑制對于受體介導(dǎo)的內(nèi)飲所必要的Na+-H+交換[14]。本發(fā)明者另外試驗了通過干擾細(xì)胞漿酸化作用而抑制網(wǎng)格蛋白小凹裝配的氯化銨，氯化銨抑制了0.04μm而不是1μm大小的珠的攝取(圖8b)，確認(rèn)了網(wǎng)格蛋白小凹在VSSP攝取上的作用。內(nèi)凹也被提示是介導(dǎo)了DC攝取病毒顆粒的新的機(jī)制[15]。本發(fā)明者用PMA的結(jié)果提示內(nèi)凹參與了DC攝取VSSP(圖8a)。為了確認(rèn)這點，本發(fā)明者使用了另一種內(nèi)凹的抑制物，非律平。非律平通過降解膽固醇起作用，PMA影響了磷酸化作用而調(diào)節(jié)內(nèi)凹內(nèi)飲作用[14，15，16，17]。與PMA類似，非律平阻斷了0.04μm而不是1μm珠的攝取，確認(rèn)了本發(fā)明者的假設(shè)(圖8b)。
內(nèi)凹和網(wǎng)格蛋白小凹能將分子轉(zhuǎn)送到內(nèi)體和溶酶體的區(qū)域[14，16]?；蛘?，內(nèi)凹可以將抗原直接轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿[17]導(dǎo)致細(xì)胞漿的加工和ATP依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以用于I型MHC的呈遞。
這些結(jié)果，和實施例4中顯示的結(jié)果一起，說明了根據(jù)本發(fā)明所表現(xiàn)的一種新的加工抗原的途徑。本發(fā)明的免疫原性組合物表現(xiàn)為被抗原呈遞細(xì)胞通過內(nèi)凹和或網(wǎng)格蛋白小凹攝取，之后抗原被Rab4非依賴性和TAP依賴性的途徑加工用于I型MHC的呈遞。本發(fā)明關(guān)于內(nèi)凹誘導(dǎo)TAP依賴性的抗原呈遞途徑和CD8細(xì)胞的能力是新穎的，以前沒有報道過。
實施例8保護(hù)效應(yīng)的比較將50nm(也就是0.05μm)(VSSP)的OVA結(jié)合顆粒與OVA單獨或1000nm(也就是1μm)OVA結(jié)合顆粒進(jìn)行對照，以直接比較其在小鼠保護(hù)性對抗隨后皮下注射100,000表達(dá)OVA的腫瘤細(xì)胞(EL4)挑戰(zhàn)的能力。所有的小鼠用100μg上述的一種(或沒有＝未處理)皮內(nèi)接種一次，然后在30天后用腫瘤挑戰(zhàn)。圖9a顯示VSSP-OVA完全阻止了表達(dá)OVA的腫瘤的生長，OVA單獨或1000nm珠的保護(hù)效應(yīng)不顯著。
實施例9單次VSSP免疫誘導(dǎo)了高水平的免疫力和對保護(hù)性對抗腫瘤的挑戰(zhàn)用OVA結(jié)合的VSSP皮內(nèi)接種誘導(dǎo)了產(chǎn)生IFNγ干擾素的細(xì)胞毒性SIINFEKL特異性T細(xì)胞(圖10a和1a和b)。在接種82天后T細(xì)胞能保持高的前體頻率(圖10d)?？贵w應(yīng)答同樣被保持著(圖16)。單次VSSP接種獲得的CD8 T細(xì)胞前體頻率比單次甚至多次VLP顆粒接種觀察到的更高，唯與高效異源的初始/追加方案相當(dāng)[1，2，3，19，20]。高的產(chǎn)生IFNγ和細(xì)胞毒T細(xì)胞前體頻率與保護(hù)性對抗許多細(xì)胞內(nèi)病原體和腫瘤相關(guān)[21，22，23]。本發(fā)明者用單一皮內(nèi)劑量的OVA結(jié)合的VSSP接種C57/B6小鼠，然后用EG7腫瘤細(xì)胞株挑戰(zhàn)它們，EG7細(xì)胞株表達(dá)細(xì)胞漿內(nèi)的OVA并是細(xì)胞毒SIINFEKL特異性T細(xì)胞的體外靶細(xì)胞。結(jié)果顯示VSSP接種的小鼠完全保護(hù)性對抗了腫瘤的挑戰(zhàn)，而所有的未處理對照組都出現(xiàn)了腫瘤。另外，隨著抗原結(jié)合VSSP的單次注射，抗體水平也增加，和在圖2c中觀察到的相似。
關(guān)于VSSP疫苗進(jìn)一步的工作。
下面描述的實施例10到13正式示范了VSSP能和不同的抗原一起使用并誘導(dǎo)廣泛的免疫力，包括生成干擾素和白介素4的T細(xì)胞。單次劑量后被誘導(dǎo)的是高水平的IgG，而不是有潛在的過敏性的IgE。
VSSP對于治療的有效性還表現(xiàn)在另外兩個模式上。1)100％清除存在的腫瘤(見實施例10)和2)在單次疫苗注射后對致命性瘧疾的保護(hù)性對抗(見實施例11)。這進(jìn)一步確定了VSSP做為一種具有不同尋常的效果和可變通的免疫接種方案，可以發(fā)展為對抗不同疾病的單劑量疫苗。此外，基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明者相信VSSP可以被用于腫瘤的治療和預(yù)防。
實施例10清除已存在的腫瘤本發(fā)明者已經(jīng)觀察到用珠-OVA單次接種完全保護(hù)性對抗了隨后表達(dá)OVA的腫瘤的挑戰(zhàn)。
C57/B6小鼠用100μg珠(0.05μm)-OVA(皮內(nèi)注射)單次接種或不處理。30天后，用5×106EG7腫瘤細(xì)胞株挑戰(zhàn)小鼠。在接種的3-13天后用測徑器測定腫瘤大小。為回顧性研究，用EG7細(xì)胞種植小鼠，8天后分為相同腫瘤大小分布的組。一組不處理，另一組3天后(也就是在注射腫瘤細(xì)胞株11天后)用珠-OVA接種。
本發(fā)明者現(xiàn)在表明對存在腫瘤負(fù)荷的小鼠進(jìn)行單次接種能治愈已經(jīng)存在的腫瘤。在單次注射的2周后，腫瘤已被從接種的小鼠上清除。這個治療能力對于任何腫瘤疫苗都是極其不尋常的，這使得這個疫苗載體對于發(fā)展治療性疫苗是有很大希望的(圖11B)。
粘蛋白-1或Muc1是乳腺癌相關(guān)抗原。用VSSP-Muc1蛋白單次接種能抑制用表達(dá)乳腺癌抗原的腫瘤細(xì)胞株挑戰(zhàn)的小鼠的腫瘤形成(見圖11A)。
實施例11保護(hù)性對抗瘧疾本發(fā)明者證明直徑0.05μm的聚苯乙烯珠可以用做載體在小鼠中誘導(dǎo)對瘧疾的保護(hù)性對抗。來自約氏瘧原蟲感染的紅細(xì)胞的裂解物被結(jié)合到珠上，用于接種小鼠，然后用致死劑量的寄生蟲挑戰(zhàn)小鼠。
在50％寄生蟲血癥時收集感染了約氏瘧原蟲17XL的C57BL/6小鼠的血液。離心800g 15分鐘獲得的紅細(xì)胞被凍融3次和超聲裂解。裂解物如上所述被結(jié)合到0.05μm顆粒上。珠-裂解物，珠-OVA或裂解物本身被皮內(nèi)注射。在兩周后用1,000,000個約氏瘧原蟲感染的紅細(xì)胞腹腔內(nèi)注射，挑戰(zhàn)接種的或未處理的C57BL/6小鼠。
所有經(jīng)上述處理的動物均在挑戰(zhàn)中存活下來，而60％的僅用裂解物(沒有珠結(jié)合)接種的動物不能控制感染而死亡(圖12)。這是單劑量疫苗能用于實現(xiàn)對血液階段瘧疾的保護(hù)性對抗的第一個證明。單劑量疫苗對于在第三世界廣泛存在的瘧疾和其他疾病是特別有吸引力的，因為它簡化了疫苗的注射和分發(fā)，可以保證覆蓋廣泛的人群。
實施例12細(xì)胞免疫1)直徑0.05μm的聚苯乙烯珠結(jié)合了不同于OVA的抗原，如腫瘤抗原nm23，也能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫，如對分泌干擾素γ的T細(xì)胞的高水平的誘導(dǎo)(圖13)。
2)和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫一樣，珠-OVA或珠-nm23誘導(dǎo)了高水平的IL4(圖14)。這個淋巴因子啟動了抗體的生成，這可以解釋為什么我們觀察到了良好的抗體誘導(dǎo)以及細(xì)胞免疫(需要干擾素γ)。
實施例13抗體免疫1)直徑0.05μm的聚苯乙烯珠結(jié)合到OVA在單次皮內(nèi)(ID)注射后誘導(dǎo)了高滴度的IgG抗體(圖15A)。
2)除了高IgG水平，沒有出現(xiàn)可測定的IgE水平。因此，這個疫苗形式上證明沒有誘導(dǎo)潛在的有害的IgE應(yīng)答(因為它們參與過敏)的危險。
實施例14通過不同途徑施用并誘導(dǎo)IgG與IgA抗體為了確定將疫苗施用于人的有用途徑，如上面描述的皮內(nèi)給藥、小鼠被通過腹膜內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)和直腸內(nèi)給予VSSP結(jié)合的OVA(100ug/小鼠)。在單次接種30天后測定每組中的3-4只小鼠。與皮內(nèi)相似，ELISPOT檢測到了所有途徑均誘導(dǎo)了對于SIINFEKL或OVA的分泌γ干擾素的T細(xì)胞(1/50,000到1/2,000脾細(xì)胞)。令人驚訝的是，與用皮內(nèi)注射的最初觀察到的誘導(dǎo)了高水平的IgG但是很少或沒有IgA相反，這些途徑給予的VSSP-OVA誘導(dǎo)了血清IgA應(yīng)答，直腸內(nèi)和鼻內(nèi)途徑?jīng)]有誘導(dǎo)可檢測的IgG(滴度小于1/100)(表1)。因此，通過直腸內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)和皮下途徑，VSSP能用于誘導(dǎo)對疾病的保護(hù)性免疫，其中IgA扮演著保護(hù)作用，如粘膜感染(如肺內(nèi)，宮頸或腸道)。
表1
在兩次劑量后的不同尋常的高IgG應(yīng)答用VSSP-OVA(100μg/小鼠，14天間隔)接種兩次，引起了如ELISA所檢測到的令人驚異的滴度超過1/500,000的高水平血清Ig和IgG抗體生成。用乳腺癌抗原nm23和瘧疾抗原MSP4/5結(jié)合到VSSP接種后，所得到的特異性IgG抗體的結(jié)果與此相似。
實施例15持久的免疫應(yīng)答VSSP-OVA引起的應(yīng)答出乎意料的長久。圖16顯示在單次皮內(nèi)接種(100μg/小鼠)1年后仍存在ELISA可測定的強(qiáng)OVA特異性IgG抗體(組A)和干擾素γELISPOT可測定的應(yīng)答于SIINFEKL的CD8T細(xì)胞(組B)。組B還表明為了得到理想的免疫原性，抗原必須是共價結(jié)合在實心顆粒上。
實施例16異源性初始/追加接種在未用，或用來自完全Freund佐劑的MUC1的肽cp13-32(cp13)，結(jié)合有MUC1的甘露聚糖(重組MUC1-GST融合蛋白)(M-FP)或0.1μmVSSP-MUCI(重組MUC1-GST融合蛋白)(VSSP)初始接種的動物上追加接種牛痘-MUC1。圖17顯示比較于那些單獨接受牛痘-MUC1的動物(未處理/V比較VSSP/V)，對于MUC1的肽13-32區(qū)段的應(yīng)答在VSSP-MUC1初始，牛痘-MUC1追加組中增強(qiáng)。因此VSSP抗原對于用于異源性初始-追加免疫方案是適合使用的。
實施例17VSSP實心核心的材料構(gòu)成本發(fā)明者的假設(shè)是0.04-0.05μm大小的實心核心是VSSP免疫原性的首要決定因素，推測在這個大小范圍內(nèi)由除聚苯乙烯外的其他材料構(gòu)成的顆粒也將是高度免疫原性的。因此，她比較了給小鼠單次皮內(nèi)接種由聚苯乙烯(PS)或玻璃(G1或G2)構(gòu)成的0.05μm的顆粒的免疫原性，所述顆粒用相同的化學(xué)操作(G1)結(jié)合到OVA或用戊二醛(G2)結(jié)合。圖18表明聚苯乙烯和玻璃構(gòu)成的VSSP都有相似的高的免疫原性，包括ELISPOT檢測到的、對SIINFEKL產(chǎn)生干擾素γ的T細(xì)胞的高前體頻率。因此，對于蛋白結(jié)合的VSSP的實心核心能用玻璃和聚苯乙烯提供，預(yù)測其他用于實心核心的材料也是有功能的，例如PLG。
實施例18抗原和VSSP的結(jié)合結(jié)果顯示將抗原和0.05μm的顆粒混合使之比抗原本身具有更多的免疫原性，但是共價結(jié)合對于理想的免疫原性是必要的。因此用于將抗原結(jié)合到VSSP的化學(xué)操作理論上是免疫原性的決定因素。特別的，顆粒的整體電荷將促進(jìn)與特異血清或其他內(nèi)源蛋白的反應(yīng)。這些反過來理論上能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的攝取和引起高免疫原性。為了對此進(jìn)行測定，小鼠用具有不同表面電荷的50nm(也就是0.05μm)的顆粒接種。OVA-VSSP有整體負(fù)電荷歸結(jié)于使用了羧化修飾的納米顆粒和在OVA與甘氨酸結(jié)合后對活性羧酸基團(tuán)的猝滅(甘氨酸，圖19)。通過與氨基乙醇猝滅反應(yīng)，除結(jié)合后的OVA的凈電荷以外的電荷能被中和(乙醇，圖19)。通過乙二胺的猝滅引進(jìn)了陽性電荷(胺，圖19)。通過氨基乙醛二甲基乙縮醛(醛，圖19)的猝滅引入潛在有用的醛基團(tuán)。所有對結(jié)合方案的三種修飾形成高免疫原性的顆粒，與甘氨酸和醛比較，胺和乙醇修飾是稍小的免疫原性。由于在顆粒中引入相反的電荷仍產(chǎn)生相同的免疫原性，因此不大可能由非特異性吸附血清蛋白產(chǎn)生免疫原性。另外，可以采用一些對于結(jié)合過程作出的選擇性修飾和改變電荷，且不改變免疫原性。
討論考慮到上面的結(jié)果，本發(fā)明的組合物提供了一種進(jìn)一步提高或改良用于不同的感染，癌或其他疾病的疫苗或接種策略的方法。
VSSP的理想大小和大多數(shù)已知病毒相同(30-150nm)。使用VSSP具有生物學(xué)的重要意義是具有吸引力的設(shè)想。從上述觀察，本發(fā)明者相信免疫系統(tǒng)可以被啟動去完全應(yīng)答于VSSP大小范圍內(nèi)的顆粒。在本發(fā)明之前，不知道或不了解免疫應(yīng)答的刺激很大程度上依賴于那些在病毒范圍內(nèi)的免疫刺激物的大小，尤其當(dāng)來自其他病原體如細(xì)菌，真菌的抗原決定簇是非常的大。的確，通過這途徑的靶抗原不可思議地引發(fā)了廣泛的(包括免疫系統(tǒng)的體液和細(xì)胞兩方面)和強(qiáng)烈的應(yīng)答(誘導(dǎo)快速持久的高效應(yīng)T細(xì)胞前體頻率)，提示免疫系統(tǒng)可以被啟動完全應(yīng)答于病毒大小的顆粒。以往利用VLP(也就是沒有連接于顆粒的純抗原)包括HepB表面蛋白或酵母菌逆轉(zhuǎn)錄蛋白(Ty)的研究也已經(jīng)顯示單次接種劑量誘導(dǎo)了廣泛和持久的免疫，盡管應(yīng)答是比用VSSP低10-100倍[1，2，3，19，20]。然而已經(jīng)假設(shè)除了大小外的其他的特性，如其脂質(zhì)或甘露聚糖成分，或膜結(jié)合蛋白形成了VLP誘導(dǎo)I型限制性T細(xì)胞應(yīng)答的能力[1]。不希望被理論所限制，本發(fā)明者認(rèn)為在體內(nèi)通過VSSP將有效的靶抗原合并于抗原呈遞細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞，之后通過VSSP上的蛋白裂解造成的抗原緩慢潛在的釋放可能形成特別有力的免疫原。
在OVA模型中單次接種劑量保護(hù)性對抗了隨后的腫瘤細(xì)胞的挑戰(zhàn)的能力證實了利用VSSP做為新疫苗。本發(fā)明者也已經(jīng)觀察到對乳腺癌表達(dá)抗原，粘蛋白1(MUC1)的廣泛和強(qiáng)烈的免疫原性和保護(hù)。在它們的動物研究中利用的注射的皮內(nèi)途徑在人類中可以容易實現(xiàn)。VSSP因此可以提供了一種特別具有吸引力并簡單的人類疫苗發(fā)展的策略，尤其對那些體液和細(xì)胞免疫參與產(chǎn)生保護(hù)的疾病，如瘧疾、癌和病毒疾病，特別的，AIDS和肝炎[10，12，21，25-28]。靶向于I型呈遞途徑的重組抗原也提供了誘導(dǎo)針對多種抗原決定簇的T細(xì)胞應(yīng)答的可能性，因此將擴(kuò)展這些疫苗在MHC多變的靶向人群中的使用。
目前，有效的CTL刺激物激活DC是通過離體處理DC，但是這是昂貴的和相當(dāng)困難的。本發(fā)明提供了一種在體內(nèi)將抗原有效地傳遞給DC的不同方法，導(dǎo)致隨后的高數(shù)目的抗原特異性CD8T細(xì)胞和免疫保護(hù)的誘導(dǎo)。在0.04-0.05μm狹窄大小范圍內(nèi)的VSSP可誘導(dǎo)不可思議的高水平的CD8 T細(xì)胞的能力是抗原呈遞細(xì)胞或有效亞群的有效攝取的結(jié)果，靶向于I型加工途徑和/或直接的刺激APC功能。在淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)比較于其他大小，VSSP的攝取被增強(qiáng)了。這種增強(qiáng)歸功于增加的顆粒陽性的DEC205+細(xì)胞(一種DC的標(biāo)記物)的頻率。樹突狀細(xì)胞是一種強(qiáng)有力的抗原呈遞細(xì)胞，且CD60與CD80的表達(dá)進(jìn)一步確定可能有效的啟動CD8 T細(xì)胞的亞群。這些標(biāo)記物在高比例的VSSP陽性細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)。因此，在體內(nèi)在這個潛在的DC亞群攝取和選擇性定位VSSP可以解釋根據(jù)本發(fā)明的微顆粒的免疫原性。
本發(fā)明的VSSP的其他優(yōu)點包括誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，包括通過多種途徑注射后IgA的生成的能力，和它們對于初始/追加免疫策略的合適性。
進(jìn)一步的研究將包括利用VSSP確定使得它們引發(fā)獲得的獨特免疫應(yīng)答的生理機(jī)制。
需要理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離于本發(fā)明的核心概念下，可以獲得這里描述的本發(fā)明的其他不同的實施方案。
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權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含至少一種結(jié)合于微顆粒的抗原，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍。
2.一種疫苗組合物，其包含至少一種結(jié)合于微顆粒的抗原，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述微顆粒的大小基本上是均一的。
4.權(quán)利要求1到3中任一項的組合物，其中所述微顆粒包含一實心的核心。
5.權(quán)利要求1到4中任一項的組合物，其中所述微顆粒直徑是大約0.03-0.05μm。
6.權(quán)利要求1到5中任一項的組合物，其中所述微顆粒由乳膠、亞鐵分子、金、玻璃、磷酸鈣、聚苯乙烯、聚賴氨酸G或其他可生物降解的和生物相容性的聚合物構(gòu)成。
7.權(quán)利要求1到6中任一項的組合物，其中所述抗原被吸附于、結(jié)合于、或共價偶聯(lián)于所述微顆粒。
8.權(quán)利要求1到7中任一項的組合物，其中所述抗原可以是一種肽、蛋白質(zhì)、重組的肽或蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸或其他類型的分子或這些物質(zhì)的任意組合。
9.權(quán)利要求1到8中任一項的組合物，其中所述抗原來源于病原體、組織、細(xì)胞器或分子并選自花粉、丙型肝炎病毒、(HIV)核心、E1、E2和NS2蛋白、來自瘧原蟲屬如間日瘧原蟲和其他瘧原蟲屬的抗原，包括惡性瘧原蟲的環(huán)孢子蛋白(CS)和人惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲的TRAP、MSP-1、MSP-2、MSP-3、MSP-4、MSP-5、AMA-1、RESA、SALSA、STARP、LSA1和LSA3、HIV-gp120/160包膜糖蛋白、鏈球菌表面蛋白抗原、流感核蛋白、血凝素-神經(jīng)酰胺酶表面感染、TcpA菌毛蛋白亞基、VP1蛋白、LMCV核蛋白、碩大利什曼原蟲表面糖化蛋白(gp63)、百日咳博德特氏菌表面蛋白、狂犬病病毒G蛋白、鏈球菌M蛋白、葡萄球菌蛋白或幽門螺旋桿菌蛋白、合胞體病毒(RSV)F或G蛋白、Epstein Barr virus(EBV)gp340或核抗原3A、血凝素、博氏疏螺旋體外表面蛋白(Osp)A、結(jié)核分支桿菌38kD脂蛋白或30kD蛋白(Ag85)、10kD或65kD蛋白、腦膜炎奈瑟菌1型外蛋白、水痘帶狀皰疹I(lǐng)E62和gp1、風(fēng)疹病毒殼體蛋白、乙型肝炎病毒前-S1抗原、單純皰疹病毒I型糖化蛋白G或gpD或CP27、墨累灰牛流域腦炎病毒E糖蛋白、甲型肝炎病毒VP1、脊髓灰質(zhì)炎病毒殼體蛋白VP1、VP2、和VP3、沙眼衣原體表面蛋白、乙型肝炎病毒包膜前-S2抗原、人鼻病毒(HRV)殼體、人乳頭狀瘤病毒來自癌基因E6和E7的多肽、李斯特桿菌表面蛋白、水痘病毒殼體蛋白、牛痘病毒包膜蛋白、布氏桿菌表面蛋白、輪狀病毒、VP-3、VP-4、VP-5、VP-7和VP-8、所述一種或多種抗原的組合、所述抗原的長度上包含5個或更多氨基酸的氨基酸亞基或一個或多個所述亞基的組合。
10.權(quán)利要求1到8中任一項的組合物，其中所述抗原來源于腫瘤如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌或黑色素瘤。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述抗原是重組的肽或蛋白。
12.一種在研究對象上引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含給研究對象施用免疫有效量的、包含至少一種結(jié)合于微顆粒的抗原的組合物，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫應(yīng)答選自CD8細(xì)胞應(yīng)答和抗體應(yīng)答，其中所述抗體是IgG、IgM或IgA。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫應(yīng)答是樹突狀細(xì)胞的增殖和/或擴(kuò)增。
15.一種通過單劑量引發(fā)針對一種抗原的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含單次給研究對象施用免疫有效量的、包含至少一種結(jié)合于微顆粒的抗原的組合物，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍，并且所述免疫應(yīng)答包含樹突狀細(xì)胞的刺激和/或增殖。
16.一種為了引發(fā)免疫應(yīng)答而在體內(nèi)將抗原轉(zhuǎn)運(yùn)至樹突狀細(xì)胞的方法，所述方法包含給研究對象施用免疫有效量的、包含至少一種結(jié)合于微顆粒的抗原的組合物，其中所述微顆粒具有和病毒一樣的大小范圍。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述免疫應(yīng)答包含引發(fā)機(jī)制為MHC I型的抗原呈遞，其中所述抗原被內(nèi)凹或網(wǎng)格蛋白小凹攝取用于通過Rab4非依賴性和TAP依賴性的過程進(jìn)行進(jìn)一步加工。
18.一種產(chǎn)生免疫原性微顆粒/抗原組合物的方法，其包含將和病毒一樣大小范圍的微顆粒與一種或多種抗原進(jìn)行接觸以使得所述微顆粒和抗原相結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種免疫原性的組合物，其包含至少一種結(jié)合于微顆粒(microparticle)的抗原，其中所述微顆粒有著和病毒一樣的大小范圍。另外，本發(fā)明也提供了疫苗組合物和在研究對象上引發(fā)免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號A61P31/04GK1630531SQ01815645
公開日2005年6月22日 申請日期2001年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月14日
發(fā)明者瑪格達(dá)萊娜·普萊班斯基 申請人:奧斯汀研究院