一種制備植物促根劑的方法
【專利摘要】一種制備植物促根劑的方法。屬于生物【技術領域】。香菇多糖對動植物具有多種有益作用。采用香菇子實體等來制備高活性菌絲、對菌絲進行誘變并依次通過酸性液體培養(yǎng)基、珍珠巖固體培養(yǎng)基初步篩選耐酸菌絲突變體；經(jīng)過多次酸性培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)和典型的拮抗測試復篩獲得耐酸突變體；耐酸突變體經(jīng)振蕩培養(yǎng)形成分散良好的細胞系；優(yōu)化培養(yǎng)工藝，在pH2.0-4.0的培養(yǎng)基中深層開放式培養(yǎng)；從發(fā)酵液收集濾液，經(jīng)熱水浸提→香菇粗多糖→Sevag法脫蛋白→H202脫色→透析脫鹽→DEAE-纖維素(DEAE-52)柱層析→Sephadex?G-100柱層析→純多糖(中性多糖、酸性多糖)；純多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生劑。這種方法可快速、低成本、大規(guī)模生產(chǎn)質量穩(wěn)定的香菇多糖。
【專利說明】一種制備植物促根劑的方法
【技術領域】
[0001]一種制備植物根系促生劑的方法。該方法屬于生物【技術領域】。采用這一技術，可以快速、大規(guī)模生產(chǎn)質量穩(wěn)定的香菇多糖、并降低其生產(chǎn)成本。生產(chǎn)的根系促生劑能有效促進植物根系的旺盛生長，而對植物的其他器官影響較小，并且不受該物質高濃度的抑制，明顯優(yōu)于其他植物激素或生長調節(jié)劑?？梢詮V泛應用于農林、食品和環(huán)境等領域。
【背景技術】
[0002]香菇多糖對動植物具有多種有益作用，一般采用從子實體中提取，生長周期長、分離成本高。因而，香菇多糖的生產(chǎn)和應用受到很大的限制。采用耐酸菌絲實施深層開放式培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)，以可以克服這些缺陷。

【發(fā)明內容】

[0003]采用香菇子實體等來制備高活性菌絲、對菌絲進行誘變并依次通過酸性液體培養(yǎng)基(pHl.0-4.0)、珍珠巖固體培養(yǎng)基初步篩選耐酸菌絲突變體；經(jīng)過多次酸性培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)和典型的拮抗測試復篩獲得耐酸突變體；耐酸突變體經(jīng)振蕩培養(yǎng)形成分散良好的細胞系；優(yōu)化培養(yǎng)工藝，在PH2.0-4.0的培養(yǎng)基中深層開放式培養(yǎng)；從發(fā)酵液收集濾液，經(jīng)熱水浸提一香菇粗多糖一Sevag法脫蛋白一H202脫色一透析脫鹽一DEAE-纖維素(DEAE-52)柱層析一Sephadex G-100柱層析一純多糖(中性多糖、酸性多糖)；純多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生劑。這種方法可快速、低成本、大規(guī)模生產(chǎn)質量穩(wěn)定的香菇多糖。
【具體實施方式】
[0004]I采用香菇子實體等來制備高活性菌絲
[0005]I)供試培養(yǎng)基
[0006](I)PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，加蒸餾水定容至1L，pH自然。選擇質量好的馬鈴薯洗凈后，去皮，挖去芽眼，削掉青綠部分。切成小塊(約1.0cmX 1.5cm至2.0cmX 3.0cm)。稱取馬鈴薯200g，加水約1L，溫火煮沸并保持30min，馬鈴薯塊變軟時用4層紗布過濾，濾汁內加入瓊脂和葡萄糖，在文火上使瓊脂融化，加水補足1L，分裝后加瓊脂經(jīng)120°C高壓濕熱滅菌20min。
[0007](2)液體種子培養(yǎng)基(w / V):馬鈴薯20%，葡萄糖2 %，酵母浸粉0.5%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%,初始 ρΗ6.0。
[0008](3)搖瓶基礎培養(yǎng)基(w / V):葡萄糖2 %，酵母浸粉0.5 %，KH2PO40.2 %，MgSO40.1%，初始 ρΗ2.5。
[0009]2)香菇菌絲培養(yǎng)
[0010]⑴菌種活化
[0011]將保存于試管斜面培養(yǎng)基上的香菇菌種用接種鏟切出0.5cmX0.5cm大小的菌塊接種于倒平板的PDA培養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)6d。
[0012](2)液體種子培養(yǎng)
[0013]將已活化的斜面菌種切割成0.5cmX0.5cm大小菌塊，接種于液體種子培養(yǎng)基中，每個250mL三角瓶接5塊菌塊，10個大小均一的玻璃珠，培養(yǎng)基裝液量IOOmL,于25°C，150r / min培養(yǎng)6d,制備成發(fā)酵種子液。
[0014](3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
[0015]將搖瓶菌種在25°C靜置24h后，用勻漿器將其勻漿。250mL三角瓶裝培養(yǎng)基IOOmL,液體菌種接種量為10%，于25°C，150r / min培養(yǎng)12d。 [0016]3)菌種分離及純化
[0017]香菇菌種分離就是把香菇菌絲體從混雜的微生物環(huán)境中單獨分離出來，并進行純培養(yǎng)?？刹捎面咦臃蛛x法和組織分離法。
[0018]孢子分離得到的菌絲具菌齡短，生活力強等優(yōu)點，并具有雙親遺傳特性，是選育高新菌株和雜交育種的材料，但由于其染菌率過高，因而，目前香菇生產(chǎn)上最常使用的I種分離方法為組織分離法。即就是利用香菇子實體組織，分離培養(yǎng)出香菇的純菌種。具體做法為選擇個體典型，朵多，蓋厚無病蟲危害，最好是用未成熟的菌蕾作為分離材料。用75%酒精沖洗種菇表面進行消毒，再用無菌水沖洗干凈，無菌濾紙吸干。用消過毒的刀片在菇柄中部縱切一刀，用手掰開菌蓋，在菌蓋與菌柄交界處取米粒大小的小塊組織，移接到PDA斜面培養(yǎng)基上，加上棉塞，在25 °C條件下培養(yǎng)。
[0019]菌種的純化及擴大培養(yǎng):菌種分離培養(yǎng)3d~4d后,選取菌絲萌發(fā)早,長勢旺的菌落，轉管擴大培養(yǎng)。經(jīng)擴大培養(yǎng)菌種一般在8d~12d可長滿管。香燕菌種肉眼觀察PDA斜面上菌絲生長潔白，羽毛狀沿著培養(yǎng)基表面延伸，至此得到試管菌種(即母種)。
[0020]4)耐酸性香菇誘變菌絲篩選
[0021](I)紫外輻照處理
[0022]在培養(yǎng)了 6d的香菇菌絲中，挑選萌發(fā)快，擴散快，潔白粗壯的菌絲，用打孔器在菌絲的尖端組織處，取出數(shù)個菌絲塊，然后用接種鏟轉接于另一塊經(jīng)滅菌的PDA平板培養(yǎng)基中心，于25°C恒溫培養(yǎng)2d后，進行香菇菌絲的紫外誘變。
[0023]誘變前，開啟紫外燈20~30min，使波長穩(wěn)定，恒溫箱25°C培養(yǎng)。將菌株分為9組(3次重復)，設紫外線照射0.5、l、5、10、15、20、25、30min和出發(fā)菌株(CK)。長在固體培養(yǎng)基上的菌絲在25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取出，選擇長勢一致的菌絲立即進行輻照處理。選用紫外線燈20W，輻射強度90 μ W / cm2，照射距離30cm，常規(guī)方法照射。處理后用黑布包裹，置于恒溫箱25°C下繼續(xù)培養(yǎng)。用十字交叉法測菌絲日均長速，并觀察記錄菌絲長勢。
[0024](2)誘變菌絲拮抗性試驗
[0025]將經(jīng)過輻照處理的菌絲在25°C恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)3~4d左右，觀察菌絲恢復生長情況，選擇菌絲長速、色澤變化或菌絲形態(tài)變化的菌株進行拮抗試驗，挑取經(jīng)過不同輻照處理的菌絲接種于空白培養(yǎng)基的一端，另一端接種對照菌絲，置于25°C恒溫箱中培養(yǎng)6d，觀察拮抗線產(chǎn)生情況。
[0026]用紫外線照射處理后有明顯變化的菌絲和對照菌株的菌絲各一塊，同時接入同一培養(yǎng)皿PDA培養(yǎng)基兩端，相距Icm左右，如中央產(chǎn)生了明顯拮抗線的，說明了菌株已產(chǎn)生了變異，不產(chǎn)生拮抗線的則表明菌株沒有發(fā)生變異。[0027](3)耐酸性誘變菌株篩選
[0028]耐酸香菇菌株的初篩:分別將篩選后的變異菌株及出發(fā)菌株同時接種到液體種子培養(yǎng)基中，每個處理設置3次重復，(觀察菌絲在？!1=4.0、3.0、2.0、1.5、1.0下)于25°C，150r / min恒溫培養(yǎng)8d后的生長情況，進行香菇耐酸性菌株的初選。
[0029]耐酸香菇菌株的復篩:將初步篩選出的耐酸性菌株分別接種到選擇性培養(yǎng)基上，在pH=4.0,3.0,2.0、1.5、1.0下于25°C恒溫繼續(xù)培養(yǎng)，進行香菇耐酸性菌株的復篩。
[0030]選擇性培養(yǎng)基組成與液體種子培養(yǎng)基組成相同，初篩的耐酸性香菇菌絲種子液及出發(fā)菌株種子液，分別每次取100 μ L，接種到含有IOg無菌珍珠巖的選擇性平板培養(yǎng)基上，在平板的五個不同位置接種，每個菌株設5個重復，定期觀察。
[0031]經(jīng)過誘變、珍珠巖固體培養(yǎng)基篩選、拮抗反應和測定液體培養(yǎng)下菌絲生物量、胞外多糖含量等，初步確定了三個耐酸突變體Atm-O1、02和03。
[0032]在低pH培養(yǎng)基中對三個突變體分別培養(yǎng)12天，三個重復；測定的菌絲生物量、胞外多糖含量，結果表1。由表1可知，Atm-02表現(xiàn)最佳，所以，以此為材料進行以下實驗。
[0033]對培養(yǎng)的Atm-02定期取樣，測定的菌絲生物量、胞外多糖含量，結果表2。由表可知，菌絲在培養(yǎng)12天是菌絲生物量和胞外多糖均達到峰值，可以終止發(fā)酵。
[0034]表1起始pH對三個耐酸突變體的菌絲生物量和胞外多糖的影響
[0035]
【權利要求】
1.采用香菇子實體等來制備高活性菌絲、對菌絲進行誘變并依次通過PH1.0-4.0液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)、pHl.0-4.0培養(yǎng)液浸濕珍珠巖固體培養(yǎng)基培養(yǎng),初步篩選出耐酸菌絲體。
2.初選耐酸菌絲體經(jīng)過1-5次的pHl.0-4.0培養(yǎng)基的繼代培養(yǎng)和典型的拮抗測試，復篩出耐酸突變體；耐酸突變體經(jīng)振蕩培養(yǎng)形成分散良好的細胞系。
3.優(yōu)化培養(yǎng)工藝，在pH2.0-4.0的培養(yǎng)基中深層開放式培養(yǎng)耐酸突變體。
4.從發(fā)酵液中收集濾液，經(jīng)熱水浸提一香菇粗多糖一Sevag法脫蛋白一H2O2脫色一透析脫鹽一DEAE-纖維素(DEAE-52)柱層析一S^hadex G-100柱層析一純多糖(中性多糖、酸性多糖)； 純多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生劑。
【文檔編號】C12P19/04GK103535352SQ201310444657
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權日:2013年9月26日
【發(fā)明者】李興林, 韓廣建, 曹愛佳, 張國運, 曹雪飛, 趙娜, 韓楊, 賈士儒 申請人:天津科技大學