專利名稱：導(dǎo)入阿拉伯糖代謝途徑的產(chǎn)木糖醇微生物及使用所述微生物生產(chǎn)木糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及導(dǎo)入阿拉伯糖代謝途徑的產(chǎn)木糖醇微生物及使用所述微生物有效生產(chǎn)木糖醇的方法，更確切地說，本發(fā)明涉及導(dǎo)入阿拉伯糖代謝途徑以抑制妨礙木糖醇純化和結(jié)晶的阿拉伯糖醇的生成、同時使用阿拉伯糖用于細(xì)胞生長的產(chǎn)木糖醇微生物；以及使用所述微生物高生產(chǎn)率(high productivity)地生產(chǎn)木糖醇的方法。
背景技術(shù)：
木糖醇是具有高甜度的戊糖醇，因此，木糖醇已被廣泛地用作可代替糖的功能性甜味劑。木糖醇具有類似于糖的甜度，但其在人體內(nèi)的代謝過程與胰島素?zé)o關(guān)。因此，對于糖尿病患者，已將木糖醇用作糖的替代甜味劑。尤其是，木糖醇具有抑制變形鏈球菌(Streptococcus mutans)(致頻細(xì)菌)生長的活性，所以，木糖醇也被廣泛地用作防頻齒材 料。木糖醇是通過對含有大量木糖的半纖維素水解物(如玉米芯和甘蔗莖桿)進行化學(xué)還原而生產(chǎn)的。然而，這類化學(xué)方法不利于從其他戊糖和己糖(如阿拉伯糖和葡萄糖等)中分離并純化木糖，并且這類方法具有分離和純化成本高而木糖回收率低(50 60%)的缺點。此外，這類化學(xué)方法還以使用氫氣和鎳催化劑的高溫/高壓工序為特征，帶來高風(fēng)險和環(huán)境問題的難題。為克服上述常規(guī)化學(xué)方法的缺點或問題，已積極地開拓了生產(chǎn)木糖醇的生物學(xué)方法。不同于所述化學(xué)方法，該生物學(xué)方法甚至可利用低純度的木糖作為原材料，并且該工序本身可在室溫和常壓下完成，表明該生物學(xué)方法是環(huán)保的生產(chǎn)方法。為使用生物學(xué)方法以高生產(chǎn)率和高產(chǎn)率(high yield)地生產(chǎn)木糖醇，已對各種細(xì)菌、酵母、真菌、重組酵母等進行了研究(Winkelhausen, E.等，J. Ferment. Bioeng. 86 1-14,1998 ；Granstrom, T. B.等，AppI. Microbiol. Biotechnol. 74 :277-281, 2007)。然而，已證實細(xì)菌和重組酵母不適于木糖醇的工業(yè)生產(chǎn)，這是因為細(xì)菌和重組酵母的木糖代謝途徑太弱或者不是非常有效。另一方面,相比于其他微生物,在眾多的酵母/真菌中，假絲酵母(Candida sp.)菌株顯示出高的木糖利用能力，使得它們成為用于以高生產(chǎn)率和高產(chǎn)率進行木糖醇的生物學(xué)生產(chǎn)的有希望的候選菌株。根據(jù)在先的研究，假絲酵母菌株(如季也蒙假絲酵母(C. guillermondi)、近平滑假絲酵母(C. parapsilosis)和熱帶假絲酵母(C. tropicalis))能借助木糖還原酶將從細(xì)胞外部導(dǎo)入的木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，并且能借助木糖醇脫氫酶進一步將生產(chǎn)的木糖醇轉(zhuǎn)化為木酮糖。所述木酮糖可由木酮糖激酶進一步轉(zhuǎn)化為木酮糖-5-磷酸，并經(jīng)由戊糖磷酸途徑被消耗，以用于細(xì)胞生長和維持(Laplace, J. Μ.等，Appl. Microbiol. Biotechnol. ,36 158-162,1991 ；Hahn-Hagerdal, B.等，Enzyme Microb. Technol.，16 :933-943,1994)。此時，木糖還原酶使用NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)作為輔助因子，木糖醇脫氫酶使用NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)作為輔助因子。由木糖還原酶介導(dǎo)的從木糖轉(zhuǎn)化而成的木糖醇通過木糖醇脫氫酶再次轉(zhuǎn)化為木酮糖。此時，如果限制培養(yǎng)基中的供氧，使溶解氧的濃度為O. 5 % 2. O %，則誘發(fā)胞內(nèi)氧化還原作用失衡，這意味著木糖醇脫氫酶所需的輔助因子NAD+變得短缺，從而抑制木糖醇轉(zhuǎn)化為木酮糖。結(jié)果，木糖醇在細(xì)胞和培養(yǎng)基中積累，顯示以50-60%的產(chǎn)率由木糖生產(chǎn)木糖醇。即，在使用產(chǎn)木糖醇微生物生產(chǎn)木糖醇的常規(guī)方法中，通過限制供氧(限制通氣)調(diào)節(jié)溶解氧至低濃度的程度是必需的。所以，已積極地進行了研究，以通過限制通氣維持低的溶解氧濃度來有意誘導(dǎo)細(xì)胞中氧化還原電位的失衡，從而以高產(chǎn)率來提高木糖醇的生產(chǎn)率(Kim, S. Y.等，J. Ferment.Bioeng.，83 (3) :267-270,1997 ;韓國專利 No. 1996-030577)。韓國專利No. 10-0169061描述了使用富集的近平滑假絲酵母菌株并調(diào)節(jié)溶解氧的濃度為O. 8 I. 2%來生產(chǎn)木糖醇的方法。然而，當(dāng)通過使用大體積發(fā)酵罐以大的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)木糖醇時，實際上幾乎不可能將溶解氧的濃度調(diào)節(jié)至上述那么低，而且即使可能的話，產(chǎn)率也不可能超過50-60%。韓國專利No. 10-0259470描述了將培養(yǎng)基中的氧水平調(diào)節(jié) 至I % DOT (以％表示的基質(zhì)中的氧濃度)以下的攪拌速度。然而，在該方法中仍然存在著不便之處。韓國專利申請No. 95-37516描述了通過使用近平滑假絲酵母轉(zhuǎn)化體菌株生產(chǎn)木糖醇的方法，該方法描述了通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的氧分壓實現(xiàn)木糖醇生產(chǎn)的優(yōu)化。韓國專利申請No. 95-13638描述了由所述轉(zhuǎn)化體菌株生產(chǎn)木糖醇的最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。然而，在這一方法中，甚至在最佳條件下木糖醇的產(chǎn)率也沒有超過70%。基于假絲酵母菌株中生產(chǎn)的木糖醇被木糖醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為木酮糖這一事實，本發(fā)明人等開發(fā)出了木糖醇脫氫酶活性完全失活的熱帶假絲酵母轉(zhuǎn)化體(韓國專利No. 10-0730315)。根據(jù)在先的方法，為了抑制將木糖醇轉(zhuǎn)化為木酮糖的木糖醇脫氫酶的活性，限制培養(yǎng)基中的通氣是誘導(dǎo)胞內(nèi)氧化還原電位失衡所必需的。然而，在木糖醇脫氫酶失活的轉(zhuǎn)化體中，由木酮糖產(chǎn)生的木糖醇不再用于細(xì)胞生長，表明不需要氧化還原電位失衡。通過這一方法，木糖能夠以97-98%的產(chǎn)率轉(zhuǎn)化為木糖醇。即使將從木糖到木糖醇的產(chǎn)率最大化，還存在著另一個待解決的問題，即用作木糖醇生產(chǎn)原材料的生物質(zhì)水解物不僅含有木糖,還含有極大量的阿拉伯糖。產(chǎn)木糖醇微生物中的木糖還原酶也作用于阿拉伯糖。所以，直接將生物質(zhì)水解物用作原材料時，還產(chǎn)生阿拉伯糖醇。阿拉伯糖醇是類似于木糖醇的戊糖醇，具有與木糖醇類似的分子結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)。因此，阿拉伯糖醇是不需要的副產(chǎn)物，它通過妨礙木糖醇的純化和結(jié)晶而降低木糖醇的生產(chǎn)速率。因而，當(dāng)將木糖/阿拉伯糖混合培養(yǎng)基用于木糖醇生產(chǎn)時，需要生產(chǎn)木糖醇而不生產(chǎn)阿拉伯糖醇的新技術(shù)。本發(fā)明人等進行了密碼子優(yōu)化，以在假絲酵母中有效表達阿拉伯糖代謝途徑所涉及的酶(如L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(araA)、L_核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖_5_磷酸4-表異構(gòu)酶(araD))。然后，將各基因插入含有甘油醛_3_磷酸脫氫酶啟動子和URA3選擇標(biāo)記的表達盒中。將制備的表達盒導(dǎo)入假絲酵母中。結(jié)果，本發(fā)明人等證實了通過抑制妨礙木糖醇純化和結(jié)晶的阿拉伯糖醇的生產(chǎn)，可高生產(chǎn)率地生產(chǎn)木糖醇，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)木糖醇微生物，所述產(chǎn)木糖醇微生物通過誘導(dǎo)阿拉伯糖代謝途徑來抑制阿拉伯糖醇生成、并使用阿拉伯糖用于細(xì)胞生長，從而促進木糖醇生產(chǎn)產(chǎn)率最大化。本發(fā)明的另一目的是提供所述產(chǎn)木糖醇微生物的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的又一目的是提供使用所述產(chǎn)木糖醇微生物在以葡萄糖或甘油作為碳源的培養(yǎng)基中高生產(chǎn)率地生產(chǎn)木糖醇的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，通過向假絲酵母菌株中導(dǎo)入含有阿拉伯糖代謝途徑相關(guān)基因的基因表達盒制備所述產(chǎn)木糖醇微生物。本發(fā)明還提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物的生產(chǎn)方法，通過向假絲酵母菌株中導(dǎo)入含有阿拉伯糖代謝途徑相關(guān)基因的基因表達盒制備所述產(chǎn)木糖醇微生物。本發(fā)明還提供了大量生產(chǎn)木糖醇的方法，所述方法包括以下步驟I)在含有生物質(zhì)水解物和碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)木糖醇微生物；2)由所培養(yǎng)的微生物生產(chǎn)木糖醇；以及3)從培養(yǎng)液中分離木糖醇。如上文所解釋的那樣，本發(fā)明涉及木糖醇的有效生產(chǎn)方法，所述方法的特征在于使用導(dǎo)入阿拉伯糖代謝途徑的產(chǎn)木糖醇微生物，從而抑制副產(chǎn)物阿拉伯糖醇、并在木糖/阿拉伯糖混合培養(yǎng)基中使用阿拉伯糖用于細(xì)胞代謝。本發(fā)明的這一方法通過抑制妨礙木糖醇純化和結(jié)晶的阿拉伯糖醇的生成，可被有效地用于高生產(chǎn)率地生產(chǎn)木糖醇。


參考附圖將更好地理解本發(fā)明優(yōu)選實施方式的應(yīng)用，其中圖I為表示產(chǎn)木糖醇微生物中的木糖和阿拉伯糖的代謝途徑的圖。圖2為表示CoAraA表達盒、CoAraB表達盒和CoAraD表達盒的遺傳圖譜的圖。
具體實施例方式下文將對本發(fā)明進行詳細(xì)描述。本發(fā)明提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，通過向假絲酵母菌株中導(dǎo)入含有阿拉伯糖代謝途徑相關(guān)基因的基因表達盒制備所述產(chǎn)木糖醇微生物。本發(fā)明還提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，通過向假絲酵母菌株中導(dǎo)入下述I)-3)的基因表達盒制備所述產(chǎn)木糖醇微生物I)由啟動子、編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒；2)由啟動子、編碼L-核酮糖激酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒；以及3)由啟動子、編碼L-核酮糖-5-磷酸4-表異構(gòu)酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒。上文所述的啟動子優(yōu)選具有SEQ. ID. NO 1所表示的核苷酸序列，上文所述的編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的多核苷酸優(yōu)選具有SEQ. ID. NO 7所表不的核苷酸序列，上文所述的編碼L-核酮糖激酶的多核苷酸優(yōu)選具有SEQ. ID. NO :8所表示的核苷酸序列，上文所述的編碼L-核酮糖-5-磷酸4-表異構(gòu)酶的多核苷酸優(yōu)選具有SEQ. ID. NO :9所表不的核苷酸序列，上文所述的終止子優(yōu)選具有SEQ. ID. NO 2所表示的核苷酸序列，但并不總限于此。、
本發(fā)明還提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，所述微生物于2010年9月8日保藏于韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所(Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology, KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC),保藏號為KCTC II76IBP?？赏ㄟ^以下步驟制備所述阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物PBDAU、LBDAU或EBDAU :構(gòu)建由啟動子、多核苷酸和終止子組成的基因表達盒，所述啟動子具有SEQ.ID. NO :1所表示的核苷酸序列，所述多核苷酸具有SEQ. ID. NO :7所表示的核苷酸序列，所述終止子具有SEQ. ID. NO 2所表示的核苷酸序列；構(gòu)建由啟動子、多核苷酸和終止子組成的基因表達盒，所述啟動子具有SEQ. ID. NO 1所表示的核苷酸序列，所述多核苷酸具有SEQ.ID. NO 8所表示的核苷酸序列，所述終止子具有SEQ. ID. NO 2所表示的核苷酸序列；構(gòu)建由啟動子、多核苷酸和終止子組成的基因表達盒，所述啟動子具有SEQ. ID. NO 1所表示的 核苷酸序列，所述多核苷酸具有SEQ. ID. NO 9所表示的核苷酸序列，所述終止子具有SEQ.ID. NO :2所表示的核苷酸序列；并將所述基因表達盒導(dǎo)入假絲酵母菌株中，但并不總限于此。本文所述的假絲酵母菌株優(yōu)選選自于由季也蒙假絲酵母(C. guillermondi)、近平滑假絲酵母(C. parapsilosis)和熱帶假絲酵母(C. tropicalis)所組成的組,但并不總限于此。所述熱帶假絲酵母優(yōu)選為木糖醇脫氫酶失活的熱帶假絲酵母，但并不總限于此。所述木糖醇脫氫酶失活的熱帶假絲酵母為以保藏號KCTC 11137BP保藏的微生物，但并不總限于此。木糖醇脫氫酶完全失活的熱帶假絲酵母對包含于用作木糖醇生產(chǎn)原材料的生物質(zhì)水解物中的阿拉伯糖具有活性。所述熱帶假絲酵母不具有使用阿拉伯糖為碳源的代謝途徑。因此，阿拉伯糖一旦進入細(xì)胞中，就被木糖還原酶的非特異性活性轉(zhuǎn)化為阿拉伯糖醇，但是不能被進一步代謝和排到細(xì)胞外。所以，如果直接將生物質(zhì)水解物用作基質(zhì)，將生成阿拉伯糖醇。阿拉伯糖醇是類似于木糖醇的戊糖醇，并具有與木糖醇類似的分子結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)。所以，阿拉伯糖醇是不需要的副產(chǎn)物，它通過妨礙木糖醇的純化和結(jié)晶而降低木糖醇的生產(chǎn)產(chǎn)率。因此，需要開發(fā)使用木糖/阿拉伯糖混合培養(yǎng)基而不生成阿拉伯糖醇的新的木糖醇生產(chǎn)方法。本發(fā)明人等向熱帶假絲酵母BSXDH-3中導(dǎo)入了細(xì)菌的阿拉伯糖代謝途徑[L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(araA)、L_核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖_5_磷酸4_表異構(gòu)酶(araD)],通過所述代謝途徑可將阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為木酮糖-5-磷酸，木酮糖-5-磷酸可通過戊糖磷酸途徑和糖酵解途徑用于細(xì)胞代謝。為證實產(chǎn)木糖醇微生物(PBDAU、LBDAU和EBDAU)的阿拉伯糖代謝途徑是否能夠抑制妨礙木糖醇純化和結(jié)晶的阿拉伯糖醇的生成，在阿拉伯糖基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)所構(gòu)建的微生物，隨后研究了阿拉伯糖消耗速率和阿拉伯糖醇生成速率以及隨時間的細(xì)胞干重(參見表I、表2和表3)。結(jié)果，證實了野生型熱帶假絲酵母(對照)不能在僅含有阿拉伯糖作為碳源的基本培養(yǎng)基中生長，而產(chǎn)木糖醇微生物L(fēng)BDAU可在60h內(nèi)生長出多達I. 6g/L細(xì)胞干重、同時消耗4. 3g/L阿拉伯糖。與此同時，還證實了木糖醇脫氫酶失活的BSXDH-3在僅含有阿拉伯糖作為碳源的基本培養(yǎng)基中不生長，其中的阿拉伯糖沒有被消耗并且沒有產(chǎn)生阿拉伯糖醇。還證實了產(chǎn)木糖醇微生物PBDAU可在60h內(nèi)生長出多達2. lg/L細(xì)胞干重同時消耗5. 4g/L阿拉伯糖，其中阿拉伯糖沒有被轉(zhuǎn)化成阿拉伯糖醇，而是用于細(xì)胞代謝。證實了另一對照野生型近平滑假絲酵母在僅包含阿拉伯糖作為碳源的基本培養(yǎng)基中不生長，而產(chǎn)木糖醇微生物EBDAU被證實在60h內(nèi)生長出多達1.4g/L細(xì)胞干重同時消耗4. lg/L阿拉伯糖，其中阿拉伯糖沒有被轉(zhuǎn)化為阿拉伯糖醇，而是用于細(xì)胞代謝。因此，證實了本發(fā)明的導(dǎo)入了阿拉伯糖代謝途徑的產(chǎn)木糖醇微生物通過抑制阿拉伯糖醇的生成，可被有效地用于高生產(chǎn)率地生產(chǎn)木糖醇。本發(fā)明還提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物的生產(chǎn)方法，通過向假絲酵母菌株中導(dǎo)入含有阿拉伯糖代謝途徑相關(guān)基因的基因表達盒制備所述產(chǎn)木糖醇微生物。 本發(fā)明還提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，通過向假絲酵母菌株中導(dǎo)入下述I)-3)的基因表達盒制備所述產(chǎn)木糖醇微生物I)由啟動子、編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒；2)由啟動子、編碼L-核酮糖激酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒；以及3)由啟動子、編碼L-核酮糖-5-磷酸4-表異構(gòu)酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒。上文所述的啟動子優(yōu)選具有SEQ. ID. NO 1所表示的核苷酸序列，上文所述的編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的多核苷酸優(yōu)選具有SEQ. ID. NO 7所表不的核苷酸序列，上文所述的編碼L-核酮糖激酶的多核苷酸優(yōu)選具有SEQ. ID. NO :8所表示的核苷酸序列，上文所述的編碼L-核酮糖-5-磷酸4-表異構(gòu)酶的多核苷酸優(yōu)選具有SEQ. ID. NO :9所表不的核苷酸序列，上文所述的終止子優(yōu)選具有SEQ. ID. NO 2所表示的核苷酸序列，但并不總限于此。本發(fā)明還提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物的生產(chǎn)方法，所述微生物于2010年9月8日保藏于韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏號為KCTCl 1761BP。本文所述的假絲酵母菌株優(yōu)選選自于由季也蒙假絲酵母(C. guillermondi)、近平滑假絲酵母(C. parapsilosis)和熱帶假絲酵母(C. tropicalis)所組成的組,但并不總限于此。所述熱帶假絲酵母優(yōu)選為木糖醇脫氫酶失活的熱帶假絲酵母，但并不總限于此。所述木糖醇脫氫酶失活的熱帶假絲酵母為以保藏號KCTC 11137BP保藏的微生物，但并不總限于此。本發(fā)明人等進行了密碼子優(yōu)化，以在假絲酵母中有效地表達阿拉伯糖代謝途徑所涉及的酶(如L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖_5_磷酸4_表異構(gòu)酶(araD)等)。然后，將各基因插入含有甘油醛_3_磷酸脫氫酶啟動子和URA3選擇標(biāo)記的表達盒中。將制備的表達盒導(dǎo)入假絲酵母中。結(jié)果，本發(fā)明人等證實了通過抑制妨礙木糖醇純化和結(jié)晶的阿拉伯糖醇的生產(chǎn)，可高生產(chǎn)率地生產(chǎn)木糖醇，從而完成了本發(fā)明。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，為優(yōu)化得到SEQ. ID. NO :7、SEQ. ID. NO 8和SEQ.ID. NO :9所表示的密碼子,基于密碼子使用數(shù)據(jù)庫(Codon Usage Database, http://www.kazusa. or. jp/codon/index, html)的數(shù)據(jù)，用假絲酵母的偏愛密碼子替換地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)L_阿拉伯糖異構(gòu)酶(araA)、大腸桿菌L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-表異構(gòu)酶(araD)的密碼子，從而合成了 CoAraA (SEQ. ID. NO 7)、CoAraB (SEQ. ID. NO 8)和 CoAraD (SEQ. ID. NO 9) (GENEART,德國)。將這些優(yōu)化的基因克隆入含有甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子、URA3選擇標(biāo)記和用于去除選擇標(biāo)記的重復(fù)序列(glu基因或arg基因)的表達盒中，從而構(gòu)建了 PGtrpfs2_CoAraA、PAHfs-CoAraB和PAHfS2-CoAraD。將這些構(gòu)建的表達盒導(dǎo)入假絲酵母菌株中。結(jié)果，得到了熱帶假絲酵母PBDAU轉(zhuǎn)化體、熱帶假絲酵母LBDAU轉(zhuǎn)化體和近平滑假絲酵母EBDAU轉(zhuǎn)化體，每個轉(zhuǎn)化體均表達 CoAraA、CoAraB 和 CoAraD。本發(fā)明還提供了通過使用PBDAU、LBDAU或EBDAU轉(zhuǎn)化體在以葡萄糖或甘油作為碳源的培養(yǎng)基中高生產(chǎn)率地生產(chǎn)木糖醇的方法。尤其是，本發(fā)明的木糖醇生產(chǎn)方法優(yōu)選通過以下步驟進行，但并不總限于此
I)在含有生物質(zhì)水解物和碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體；2)由所培養(yǎng)的微生物生產(chǎn)木糖醇；以及3)從培養(yǎng)液中分離木糖醇。在上述方法中，步驟I)的生物質(zhì)水解物優(yōu)選為選自于由玉米芯水解物、甘蔗水解物、椰子副產(chǎn)物和樺樹水解物所組成的組中的一種，但并不總限于此，可使用任何含有木糖的生物質(zhì)。在上述方法中，步驟I)的碳源優(yōu)選為葡萄糖或甘油，但并不總限于此，可使用任何可用于微生物培養(yǎng)的碳源。為研究PBDAU、LBDAU或EBDAU的木糖醇生產(chǎn)率，本發(fā)明人等測定了木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇隨時間的濃度(參見表4、表5、表6、表7、表8、表9和表10)。結(jié)果，證實PBDAU的木糖醇生產(chǎn)率為O. 63g/L/h，BSXDH-3 (對照)的木糖醇生產(chǎn)率為O. 55g/L/h。所以，PBDAU的木糖醇生產(chǎn)率比對照BSXDH-3的生產(chǎn)率高15%。BSXDH-3在60h內(nèi)產(chǎn)生了11. 4g/L阿拉伯糖醇；PBDAU不產(chǎn)生副產(chǎn)物阿拉伯糖醇，而是僅產(chǎn)生木糖醇。關(guān)于LBDAU的木糖醇生產(chǎn)率，野生型菌株顯示了 0.51g/L/h的木糖醇生產(chǎn)率，而LBDAU示出了 O. 59g/L/h的生產(chǎn)率。所以，證實LBDAU的木糖醇生產(chǎn)率比野生型菌株的生產(chǎn)率高15%。野生型菌株在60h內(nèi)產(chǎn)生了 10. 3g/L阿拉伯糖醇；LBDAU不產(chǎn)生副產(chǎn)物阿拉伯糖醇，而是僅產(chǎn)生木糖醇。關(guān)于EBDAU的木糖醇生產(chǎn)率，野生型菌株顯示了 O. 44g/L/h的木糖醇生產(chǎn)率，而EBDAU示出了 O. 49g/L/h的生產(chǎn)率。因此，證實EBDAU的木糖醇生產(chǎn)率比野生型菌株的生產(chǎn)率高12%。野生型菌株在60h內(nèi)產(chǎn)生了 9. 8g/L阿拉伯糖醇；EBDAU不產(chǎn)生副產(chǎn)物阿拉伯糖醇，而是僅產(chǎn)生木糖醇。此外，當(dāng)在發(fā)酵罐中利用PBDAU由生物質(zhì)水解物大規(guī)模生產(chǎn)木糖醇時，BSXDH-3的木糖醇生產(chǎn)率為2. 16g/L/h，而PBDAU的木糖醇生產(chǎn)率為2. 28g/L/h。BSXDH-3在72h內(nèi)產(chǎn)生了 6. 4g/L阿拉伯糖醇；PBDAU根本不產(chǎn)生副產(chǎn)物阿拉伯糖醇，而是僅僅產(chǎn)生木糖醇。因此，證實了本發(fā)明的導(dǎo)入了阿拉伯糖代謝途徑的產(chǎn)木糖醇微生物通過抑制阿拉伯糖醇的生成，可被有效地用于高生產(chǎn)率地生產(chǎn)木糖醇。也證實了本發(fā)明所述方法通過抑制阿拉伯糖醇的生成，甚至在將生物質(zhì)水解物用于大量生產(chǎn)木糖醇時也可用于高生產(chǎn)率、高濃度地生產(chǎn)木糖醇。實施例
通過如下的實施例、實驗實施例和制造實施例對本發(fā)明中實用的和目前優(yōu)選的實施方式進行說明。但是，將要明白的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了本發(fā)明所公開的內(nèi)容后，可在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進行修改和改進。實施例I :甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子和終止子的克隆為了克隆熱帶假絲酵母的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子和終止子，使用熱帶假絲酵母基因組DNA和下述引物對進行PCR。結(jié)果，得到了 1455bp的啟動子序列(SEQ.ID. NO 1)和 309bp 的終止子序列(SEQ. ID. NO :1)。啟動子PCR[94 °C 30s, (94 °C 30s ；55 °C lmin，72 °C Imin 30s) 30 個循環(huán)；72 °C 7min]PGAP-F(BglII) :5' -agatctaacgtggtatggttgtaagaaac-3 ' (SEQ. ID. NO 3);以 及PGAP-R(XbaI_BamHI) :5 1 -ggatccgcgtctagatgtttaaattctttaattg-3 1 (SEQ.ID. NO 4)。終止子PCR[94°C 30s ； (94。。30s, 55°C lmin, 72°C lmin) 30 個循環(huán)；72°C 7min]TGAP-F(XbaI_Xho) :5 1 -tctagattgctcgagctatccaacaaactctag-3 1 (SEQ.ID. NO 5);以及TGAP-R(BamHI) :5' -ggatcctctggtttagaagtagggactgtatg-31 (SEQ. ID. NO :6)。實施例2 :araA、araB和araD的密碼子優(yōu)化基于密碼子使用數(shù)據(jù)庫(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)的數(shù)據(jù)，用熱帶假絲酵母的偏愛密碼子替換地衣芽孢桿菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(araA)、大腸桿菌L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖_5_磷酸4_表異構(gòu)酶(araD)的密碼子。結(jié)果,合成了由SEQ. ID. NO 7所表示的核苷酸序列組成的CoAraA、由SEQ. ID. NO 8所表示的核苷酸序列組成的CoAraB和由SEQ. ID. NO 9所表示的核苷酸序列組成的CoAraD (GENEART，德國)。實施例3 =CoAraA表達盒、CoAraB表達盒和CoAraD表達盒及表達菌株的構(gòu)建將實施例2中合成的優(yōu)化基因克隆入含有甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子和用于去除選擇標(biāo)記的重復(fù)序列(glu基因或arg基因)的表達盒中。結(jié)果，得到了PGtrpfs2-CoAraA, PAHfs-CoAraB 和 PAHfs2_CoAraD (圖 2)。<3-1>木糖脫氫酶表達被抑制的轉(zhuǎn)化的熱帶假絲酵母的構(gòu)建使用熱帶假絲酵母基因組DNA作為模板，用下述引物進行PCR[94°C lmin ；(94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s) 25個循環(huán)；72°C 3min]，以擴增熱帶假絲酵母木糖醇脫氫酶基因。將擴增的熱帶假絲酵母木糖醇脫氫酶基因克隆入PGEM-T easy載體(ΒΙ0ΝΕΧ，韓國)，隨后在該木糖醇脫氫酶基因中部引入BamHI位點。在導(dǎo)入的BamHI的區(qū)域上導(dǎo)入ura3基因，從而制備出轉(zhuǎn)化載體pXYL2-Ura3 (4. 7kb)。引物F:5' -aatggtcttgggtcacgaatcc-3' (SEQ. ID. NO 10)引物R :5' -gctctgaccaagtcgtaggcttc-3' (SEQ. ID. NO 11)將制備的載體pXYL2_Ura3導(dǎo)入熱帶假絲酵母中，將所述熱帶假絲酵母涂抹在無尿嘧啶固體選擇培養(yǎng)基[酵母氮源(無氨基酸)6. 7g/L,葡萄糖20g/L和瓊脂粉15g/L]上，隨后在30°C培養(yǎng)2天。然后，將該固體培養(yǎng)基上形成的菌落分別接種于含有木糖的固體培養(yǎng)基[酵母氮源(無氨基酸)6. 7g/L、木糖20g/L和瓊脂粉15g/L]和含有葡萄糖的固體培養(yǎng)基[酵母氮源(無氨基酸)6. 7g/L、葡萄糖20g/L和瓊脂粉15g/L]上，隨后在30°C培養(yǎng)2天。挑選在含有木糖的固體培養(yǎng)基中不能生長但在含有葡萄糖的固體培養(yǎng)基上可生長的菌株。結(jié)果，得到了木糖醇脫氫酶失活的熱帶假絲酵母。<3-2>尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型近平滑假絲酵母的構(gòu)建為使用URA3基因作為菌株構(gòu)建的選擇標(biāo)記，用誘導(dǎo)突變的烷化劑甲磺酸乙酯(EMS)處理近平滑假絲酵母，從而構(gòu)建出尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型近平滑假絲酵母。將近平滑假絲酵母接種于4ml YM培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麥芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，隨后于30°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)12h。將該培養(yǎng)液接種入 50ml YM培養(yǎng)基中，隨后于30°C、200rpm下振蕩培養(yǎng)12h，然后將30ml該培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50ml的管中，隨后用 30ml 基本緩沖液 A(minimal A buffer) (K2HPO4 10. 5g/L，ΚΗ2Ρ044· 5g/L，(NH4)2SO4 I. Og/L和檸檬酸鈉0. 5g/L)漂洗兩次。將得到的細(xì)胞重懸于15ml基本緩沖液A中，向其中添加450μ1 EMS0當(dāng)于30°C、200rpm下進行振蕩培養(yǎng)時，誘導(dǎo)反應(yīng)90min。將該細(xì)胞用5ml基本緩沖液A漂洗兩次，然后將得到的細(xì)胞重懸于Iml基本緩沖液A中。將該細(xì)胞涂抹在5-F0A固體培養(yǎng)基(酵母氮源6. 7g/L，葡萄糖20g/L，5-FOAO. 8g/L，尿嘧啶O. Ig/L和瓊脂粉15g/L)上，隨后于30°C下培養(yǎng)2天。在該固體培養(yǎng)基上形成的菌落為URA3失活的菌株，表明構(gòu)建出了尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的近平滑假絲酵母。<3-3>由野生型熱帶假絲酵母構(gòu)建CoAraA、CoAraB和CoAraD的表達菌株將上述構(gòu)建的PGtrpfs2_CoAraA表達盒導(dǎo)入野生型熱帶假絲酵母中，將所述熱帶假絲酵母涂抹在無尿嘧啶固體選擇培養(yǎng)基(酵母氮源6. 7g/L，葡萄糖20g/L和瓊脂粉15g/L)上，隨后于30°C下培養(yǎng)2天。在該固體培養(yǎng)基上形成的菌落是導(dǎo)入了所述表達盒的菌株。將所述菌落接種入4ml YM培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麥芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，隨后于30°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)12h。然后，將該培養(yǎng)液涂抹在5-F0A固體培養(yǎng)基(酵母氮源6. 7g/L，葡萄糖20g/L，5-FOAO. 8g/L，尿嘧啶O. lg/L和瓊脂粉15g/L)上，隨后于30°C下培養(yǎng)2天。在所述固體培養(yǎng)基上形成的菌落是導(dǎo)入的URA3基因被移除的菌株，然后逐步導(dǎo)入 PAHfs-CoAraB 和 PAHfs2_CoAraD，從而構(gòu)建出表達 CoAraA、CoAraB 和 CoAraD 的熱帶假絲酵母LBDAU轉(zhuǎn)化體。<3-4>由移除了木糖醇脫氫酶的熱帶假絲酵母構(gòu)建CoAraA、CoAraB和CoAraD的表達菌株將上述構(gòu)建的PGtrpfs2_CoAraA表達盒導(dǎo)入木糖醇脫氫酶失活的熱帶假絲酵母BSXDH-3 (保藏號KCTC 11137BP)中，將所述熱帶假絲酵母涂抹在無尿嘧啶固體選擇培養(yǎng)基(酵母氮源6.7g/L，葡萄糖20g/L和瓊脂粉15g/L)上，隨后于30°C下培養(yǎng)2天。在該固體培養(yǎng)基上形成的菌落是導(dǎo)入了所述表達盒的菌株。將所述菌落接種入4ml YM培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麥芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，隨后于30°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)12h。然后，將該培養(yǎng)液涂抹在5-F0A固體培養(yǎng)基(酵母氮源6. 7g/L，葡萄糖20g/L, 5-F0A O. 8g/L，尿嘧啶O. lg/L和瓊脂粉15g/L)上，隨后于30°C下培養(yǎng)2天。在所述固體培養(yǎng)基上形成的菌落是導(dǎo)入的URA3基因被移除的菌株，然后逐步導(dǎo)入 PAHfs-CoAraB 和 PAHfs2_CoAraD，從而構(gòu)建出表達 CoAraA、CoAraB 和 CoAraD 的熱帶假絲酵母PBDAU轉(zhuǎn)化體。<3-5>由近平滑假絲酵母構(gòu)建CoAraA、CoAraB和CoAraD的表達菌株將上述構(gòu)建的PGtrpf s2_CoAraA表達盒導(dǎo)入URA3失活的近平滑假絲酵母中，將所述近平滑假絲酵母涂抹在無尿嘧啶固體選擇培養(yǎng)基(酵母氮源6. 7g/L，葡萄糖20g/L和瓊脂粉15g/L)上，隨后于30°C下培養(yǎng)2天。在該固體培養(yǎng)基上形成的菌落是導(dǎo)入了所述表達盒的菌株。將所述菌落接種入4ml YM培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麥芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，隨后于30°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)12h。然后，將該培養(yǎng)液涂抹在5-F0A固體培養(yǎng)基(酵母氮源6. 7g/L，葡萄糖20g/L，5-F0A O. 8g/L，尿嘧啶O. lg/L和瓊脂粉15g/L)上，隨后于30°C下培養(yǎng)2天。在所述固體培養(yǎng)基上形成的菌落是導(dǎo)入的URA3基因被移除的菌株，然后 逐步導(dǎo)入 PAHfs-CoAraB 和 PAHfs2_CoAraD，從而構(gòu)建出表達 CoAraA、CoAraB 和 CoAraD 的近平滑假絲酵母EBDAU轉(zhuǎn)化體。實施例4 :對導(dǎo)入的阿拉伯糖代謝途徑的運行的證實為證實導(dǎo)入實施例3中構(gòu)建的熱帶假絲酵母PBDAU、熱帶假絲酵母LBDAU和近平滑假絲酵母EBDAU中的阿拉伯糖代謝途徑是否可適當(dāng)?shù)剡\行，在阿拉伯糖基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株。<4-1>對導(dǎo)入野生型熱帶假絲酵母LBDAU中的阿拉伯糖代謝途徑的運行的證實將LBDAU接種于4ml YM培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麥芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，隨后于30°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)12h。然后，將該培養(yǎng)液接種入50ml阿拉伯糖基本培養(yǎng)基(阿拉伯糖20g/L，酵母氮源6. 7g/L和瓊脂粉15g/L)中，隨后于30°C、200rpm下振蕩培養(yǎng)60h。使用分光光度計測定0D_，通過預(yù)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線表示所得到的值，通過所述標(biāo)準(zhǔn)曲線測定隨時間的細(xì)胞干重。還測定了隨時間的阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的濃度，所述測量方法如下離心樣品,用O. 2 μ m濾器過濾上清液。然后，用HPLC系統(tǒng)分析該濾液[Sugar-PakI柱、HPLC泵、折射率檢測器(Waters，美國)、流動相水O. 5ml/min、溫度90°C ]。表1阿拉伯糖基本培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長、阿拉伯糖消耗和阿拉伯糖醇生產(chǎn)
權(quán)利要求
1.阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，通過向假絲酵母(Candidasp.)菌株中導(dǎo)入含有阿拉伯糖代謝途徑相關(guān)基因的基因表達盒制備所述產(chǎn)木糖醇微生物。
2.如權(quán)利要求I所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，其中，所述基因表達盒為下述1)-3)的基因表達盒中的一種 . 1)由啟動子、編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒； . 2)由啟動子、編碼L-核酮糖激酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒；以及 . 3)由啟動子、編碼L-核酮糖-5-磷酸4-表異構(gòu)酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒。
3.如權(quán)利要求I所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，其中，所述假絲酵母菌株優(yōu)選選自于由季也蒙假絲酵母(C. guillermondi)、近平滑假絲酵母(C. parapsilosis)和熱帶假絲酵母(C. tropicalis)所組成的組。
4.如權(quán)利要求I所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，其中，所述假絲酵母菌株典型地為木糖醇脫氫酶失活的熱帶假絲酵母。
5.如權(quán)利要求I所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，其中，所述產(chǎn)木糖醇微生物為以保藏號KCTC 11761BP保藏的產(chǎn)木糖醇微生物。
6.如權(quán)利要求4所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物，其中，所述熱帶假絲酵母菌株為以保藏號KCTC 11137BP保藏的熱帶假絲酵母菌株。
7.阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物的生產(chǎn)方法，通過向假絲酵母菌株中導(dǎo)入含有阿拉伯糖代謝途徑相關(guān)基因的基因表達盒制備所述產(chǎn)木糖醇微生物。
8.如權(quán)利要求7所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物的生產(chǎn)方法，所述生產(chǎn)方法包括將下述I)-3)的基因表達盒導(dǎo)入假絲酵母菌株中的步驟 .1)由啟動子、編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒； . 2)由啟動子、編碼L-核酮糖激酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒；以及 . 3)由啟動子、編碼L-核酮糖-5-磷酸4-表異構(gòu)酶的多核苷酸和終止子組成的基因表達盒。
9.如權(quán)利要求7所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物的生產(chǎn)方法，其中，所述假絲酵母菌株優(yōu)選選自于由季也蒙假絲酵母、近平滑假絲酵母和熱帶假絲酵母所組成的組。
10.如權(quán)利要求7所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物的生產(chǎn)方法，其中，所述假絲酵母菌株典型地為木糖醇脫氫酶失活的熱帶假絲酵母。
11.如權(quán)利要求7所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物的生產(chǎn)方法，其中，所述產(chǎn)木糖醇微生物為以保藏號KCTC 11761BP保藏的產(chǎn)木糖醇微生物。
12.如權(quán)利要求10所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的產(chǎn)木糖醇微生物的生產(chǎn)方法，其中，所述熱帶假絲酵母菌株為以保藏號KCTC 11137BP保藏的熱帶假絲酵母菌株。
13.大量生產(chǎn)木糖醇的方法，所述方法包括以下步驟 .1)在含有生物質(zhì)水解物和碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求I所述的產(chǎn)木糖醇微生物； . 2)由所培養(yǎng)的微生物生產(chǎn)木糖醇；以及 . 3)從培養(yǎng)液中分離木糖醇。
14.如權(quán)利要求13所述的大量生產(chǎn)木糖醇的方法，其中，步驟I)的所述生物質(zhì)水解物優(yōu)選選自于由玉米芯水解物、甘蔗水解物、椰子副產(chǎn)物和樺樹水解物所組成的組。
15.如權(quán)利要求13所述的大量生產(chǎn)木糖醇的方法，其中，步驟I)的所述碳源優(yōu)選選自于由葡萄糖、甘油、糖蜜、玉米淀粉水解物(hydrol)、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、纖維二糖及它們的混合物所組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及在木糖/阿拉伯糖混合培養(yǎng)基中使用產(chǎn)木糖醇微生物有效生產(chǎn)木糖醇的方法，所述產(chǎn)木糖醇微生物中通過導(dǎo)入阿拉伯糖代謝途徑抑制了副產(chǎn)物阿拉伯糖醇的生產(chǎn)，并僅使用阿拉伯糖用于細(xì)胞代謝。更確切地，為了在熱帶假絲酵母中有效地表達L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-表異構(gòu)酶(araD)，對密碼子進行了優(yōu)化。然后，將各基因插入含有甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子和URA3選擇標(biāo)記的基因表達盒中，將該基因表達盒導(dǎo)入假絲酵母微生物中。結(jié)果，可抑制妨礙木糖醇純化和結(jié)晶的副產(chǎn)物阿拉伯糖醇，使得本發(fā)明的木糖醇生產(chǎn)方法更加有效。本發(fā)明的導(dǎo)入了阿拉伯糖代謝途徑的產(chǎn)木糖醇微生物通過抑制阿拉伯糖醇的生成，可有效地用于以高生產(chǎn)率生產(chǎn)木糖醇。
文檔編號C12P7/18GK102712894SQ201180003995
公開日2012年10月3日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月6日
發(fā)明者全宇榮, 尹炳勛, 沈宇用, 金政會 申請人:韓國科學(xué)技術(shù)院