專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有神經(jīng)退行性疾病防治活性的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋微生物的應(yīng)用及神經(jīng)退行性疾病防治活性成分的研究，具體的說(shuō)是一種具有神經(jīng)退行性疾病防治活性的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌。
背景技術(shù)：
神經(jīng)退行性疾病是一種臨床上的多發(fā)病和常見(jiàn)病，包括阿爾茨采默病 (Alzheimer' s disease, AD)、中白金森病(Parkinson ‘ s disease, PD)、亨延頓舞蹈病 (Huntington' s disease, HD)等，主要癥狀包括進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能障礙、運(yùn)動(dòng)障礙等等。隨著人類(lèi)社會(huì)年齡結(jié)構(gòu)老齡化，神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率日趨升高，已成為僅次于心腦血管疾病和腫瘤的第三大世界性健康問(wèn)題。近年來(lái)人們對(duì)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了大量研究，且對(duì)發(fā)病機(jī)理提出了一些不同的假設(shè)，如關(guān)鍵蛋白的纏結(jié)及聚集、氧化應(yīng)激、生物金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體功能衰竭等。然而，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病原因及發(fā)生機(jī)制目前尚不十分明確。已有研究結(jié)果顯示，作為一大類(lèi)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊病(分子構(gòu)象病)，神經(jīng)退行性疾病相關(guān)關(guān)鍵蛋白的聚集沉淀在發(fā)病過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用，如AD的發(fā)病即與Α-beta (beta-amyloid)等關(guān)鍵蛋白的聚集、沉淀、以及寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性直接相關(guān)，A-beta蛋白的過(guò)量表達(dá)和聚集、 沉淀可以直接導(dǎo)致線粒體紊亂、氧化應(yīng)激、神經(jīng)突觸傳遞中斷、軸突運(yùn)輸中斷、膜完整性受損破裂等多種AD相關(guān)病理變化，而HD的發(fā)病與Poly Q的聚集直接相關(guān)等。因此，神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白的聚集沉淀已成為研究神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)理及神經(jīng)退行性疾病治療藥物和方法最重要的靶標(biāo)之一。雖然神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白通過(guò)β片狀折疊交聯(lián)聚集形成不溶性纖維，最終以塊狀高聚體形式出現(xiàn)并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。但最近研究結(jié)果證明，在形成不溶性纖維過(guò)程中產(chǎn)生的可溶性蛋白寡聚體才是真正體現(xiàn)其神經(jīng)毒性的物質(zhì)。因此，與研究纖維或塊狀高聚體的聚集抑制劑相比，探討如何篩選研究神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白寡聚體的聚集抑制劑對(duì)于神經(jīng)退行性疾病防治活性成分研究具有更重要的理論意義和價(jià)值。與神經(jīng)退行性疾病治病機(jī)理研究的逐漸深入相比，神經(jīng)退行性疾病防治藥物相關(guān)研究及應(yīng)用則明顯滯后，迄今為止臨床上尚無(wú)針對(duì)病因的特效治療藥物。現(xiàn)有藥物對(duì)神經(jīng)退行性疾病的病情只有一定的輔助效果，在一定程度上能夠延緩病情的惡化，但都不能逆轉(zhuǎn)病情，如抗AD藥物為例，現(xiàn)有乙酰膽堿酯酶抑制劑(IChEIs)如tacrine、donepezil, huperzine,ENA-713,fuperdin A等及近幾年用于臨床的非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑鹽酸美金剛(memantine)等藥物都僅有一定的輔助治療效果，很多情況下還會(huì)引起乙酰膽堿相關(guān)不良反應(yīng)。因此，研究發(fā)現(xiàn)新的、特殊生境神經(jīng)退行性疾病防治藥用資源并從中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、作用獨(dú)特的新型活性成分對(duì)于神經(jīng)退行性疾病先導(dǎo)藥物的研究極為重要，是解決神經(jīng)退行性疾病新藥研發(fā)的核心手段之一。紅樹(shù)林是介于海洋生態(tài)和陸地生態(tài)之間的一種非常特殊的生態(tài)區(qū)域。受紅樹(shù)林高
3度鹽責(zé)化、土壤的缺氧、高光輻射及周期性的海水浸淹等獨(dú)特生長(zhǎng)環(huán)境的影響，極為豐富又極具特色的紅樹(shù)林微生物資源已成為最獨(dú)特的海洋藥用資源之一。自1993年從太平洋紫杉(短葉紅豆杉)中分離得到能夠產(chǎn)生新型活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌Taxamyces andrenae后， 紅樹(shù)林植物內(nèi)生真菌活性物質(zhì)的研究引起了人們的極大興趣。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)在紅樹(shù)內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中分離鑒定了多個(gè)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、新穎的化合物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等活性。其中從Kandelia candel樹(shù)皮內(nèi)生真菌菌體中分離鑒定的sporothrins A和 Xylaria sp.代謝產(chǎn)物Xyloketal A-D對(duì)乙酰膽堿酯酶有較強(qiáng)的抑制作用。這就進(jìn)一步證明紅樹(shù)內(nèi)生真菌及其代謝物作為神經(jīng)退行性疾病防治新藥研究的資源具有極大的開(kāi)發(fā)前
旦
ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種從紅樹(shù)植物黃水皮的根莖部樹(shù)皮中分離的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌，該紅樹(shù)內(nèi)生真菌菌體提取物具有神經(jīng)退行性疾病防治活性，在 A-beta蛋白聚集的E. coli細(xì)胞模型中顯示出很好的抗A-beta蛋白聚集活性。本發(fā)明所述的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定，命名為=Phomopsis occulta，隱藏?cái)M莖點(diǎn)霉QOl 1)微鑒字第019號(hào))，其于2011年2月23日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)， 保藏編號(hào)為CCTCCM2011044。本申請(qǐng)對(duì)其命名為SN3-2。本發(fā)明所述的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌的固體培養(yǎng)特征為PDA固體培養(yǎng)基，25°C暗室培養(yǎng)6天，菌落為白色毛狀，邊緣整齊，成熟時(shí)有青灰色小點(diǎn)；菌絲匍匐狀生長(zhǎng)，分隔，孢子內(nèi)生。該菌具有較強(qiáng)的耐鹽性在不含有NaCl的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在含有1M、2M、 3M NaCl的高鹽度PDA培養(yǎng)基上均長(zhǎng)勢(shì)良好，說(shuō)明該菌具有很強(qiáng)的耐鹽性；但該菌不具有嗜鹽性，因?yàn)樵诓缓琋aCl PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好。該菌還具有較強(qiáng)的耐滲性本發(fā)明所述的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌在含有2M、3M山梨糖醇(sorbitol)的PDA固體高滲培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)均非常好，且對(duì)不同濃度山梨糖醇PDA培養(yǎng)基的長(zhǎng)勢(shì)基本一致，這說(shuō)明該菌具有較強(qiáng)的山梨糖醇耐滲性。本發(fā)明所述的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2在真菌基礎(chǔ)培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好在不含有NaCl和分別含有1M、2M、3M NaCl的液體培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)良好；該菌在含不同NaCl濃度的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的速度不同，隨著NaCl濃度的增大，菌的生長(zhǎng)速度持續(xù)降低，但菌落形態(tài)、菌絲和分生孢子等一致。本發(fā)明海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌的18srDNA的堿基序列如SEQ ID NO=I所示。從紅樹(shù)根莖部的樹(shù)皮中分離海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌的方法1、將采集到的紅樹(shù)枝條表面洗凈，帶入無(wú)菌室。將枝條表面用火焰滅菌IOs 15s。用無(wú)菌刀將其剪成3cm km的小段，75%酒精消毒10min，0. 1 %的升汞浸泡:3min。 用無(wú)菌水洗滌5遍。另設(shè)對(duì)照組(以最后洗滌的無(wú)菌水作為對(duì)照)。將枝條小段分別接種于含有濃度IM和3M的NaCl的PDA固體培養(yǎng)基平皿上(每種材料3皿，每皿3段枝條)，放置于25°C恒溫箱中培養(yǎng)；2、待長(zhǎng)出菌落后，按無(wú)菌操作程序挑出菌絲的尖端，接種于PDA固體培養(yǎng)基平皿上，進(jìn)行菌種的分離純化，得到紅樹(shù)內(nèi)生真菌。3、將純種菌株接入沙氏試管斜面保存。每3個(gè)月 4個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。從本發(fā)明所述海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌中分離基因組DNA的方法本發(fā)明所述的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2次生代謝產(chǎn)物及菌體提取物具有顯著的神經(jīng)退行性疾病防治活性。以體外A-beta 42聚集模型、Poly Q模型等進(jìn)行神經(jīng)退行性疾病關(guān)鍵蛋白聚集抑制活性篩選和研究發(fā)現(xiàn)，該菌菌體提取物具有很強(qiáng)的A-beta、 Poly Q聚集抑制作用，顯示出較強(qiáng)的神經(jīng)退行性疾病防治活性。本發(fā)明所述的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2菌體提取物中的抗A-beta聚集有效成分具有較好的水溶性，在水溶液、有機(jī)溶液、中性條件、弱酸堿條件下都比較穩(wěn)定，在 70°C處理120min后任然保留95%以上的活性。本發(fā)明所述的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2具有較強(qiáng)的抗AD活性，其次生代謝產(chǎn)物中含有大量以A-beta聚集為靶點(diǎn)的抗聚集類(lèi)抗AD活性物質(zhì)，具備從中發(fā)現(xiàn)新型抗AD 先導(dǎo)藥物的巨大潛力，將為新型抗AD藥物的研究提供支持。本發(fā)明對(duì)AD特效藥物的研究及我國(guó)南海紅樹(shù)資源的深度開(kāi)發(fā)具有極為重要的意義和價(jià)值。


圖IA和圖IB分別為本發(fā)明所述海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2的菌落形態(tài)圖和顯微結(jié)構(gòu)圖，顯微放大倍數(shù)為1000。圖2是為本發(fā)明所述海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2和部分相關(guān)海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌的基因組DNA核酸瓊脂糖電泳圖，M 分子量為15000bp的核酸Marker，5為SN3-2 基因組DNA，1-4和6分別是部分相關(guān)海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌的基因組DNA。圖3為本發(fā)明所述海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2的菌體提取物體外A_beta42 聚集模型研究結(jié)果。圖4為本發(fā)明所述海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2的菌體提取物體外Poly Q聚集模型研究結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明整體思路包括以下幾點(diǎn)從紅樹(shù)枝條中分離海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌；從海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌中分離基因組DNA;從海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌基因組中克隆 ISSrDNA序列；對(duì)分離得到的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌進(jìn)行耐鹽性、嗜鹽性和耐滲性進(jìn)行分析；提取海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌次生代謝物，檢測(cè)其抗A-beta聚集活性；以上各點(diǎn)皆為單獨(dú)實(shí)施例，以下將結(jié)合具體實(shí)施例做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1從紅樹(shù)樹(shù)皮中分離海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌深圳海域紅樹(shù)植物水黃皮采集的水黃皮靠近根部水面上方樹(shù)皮樣品，在實(shí)驗(yàn)室中按照以下條件篩選和培養(yǎng)，即可以得到本專(zhuān)利所述的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2。(一 )培養(yǎng)基及配制(I)PDA固體培養(yǎng)基馬鈴薯200g洗凈去皮，加水800ml，煮沸30min，六層紗布過(guò)濾；濾液加入瓊脂15g，加入葡萄糖20g、青霉素終濃度為80u/ml、鏈霉素終濃度為36u/ml。 0. lMPa，121°C滅菌30min，葡萄糖、青霉素、鏈霉素通過(guò)過(guò)濾的方式滅菌。
青霉素規(guī)格1600u/mg，5g裝。配制方法稱(chēng)取500mg溶入IOml水中，配制成青霉素母液，過(guò)濾后保存。配制培養(yǎng)基時(shí)每升培養(yǎng)基中加入Iml青霉素母液。青霉素終濃度為 80u/ml。硫酸鏈霉規(guī)格為720u/mg，IOg裝。配制方法稱(chēng)取500mg溶入IOml水中，配制成
硫酸鏈霉素母液，過(guò)濾后保存。配制培養(yǎng)基時(shí)每升培養(yǎng)基中加入Iml硫酸鏈霉素母液。硫酸鏈霉素終濃度為36u/ml。(2) PDA固體含鹽培養(yǎng)基在PDA固體培養(yǎng)基中加入NaCl，得到含有NaCl濃度為IM 和3M的PDA固體含鹽培養(yǎng)基。(3) PDA固體高滲培養(yǎng)基在PDA固體培養(yǎng)基中加入D-sorbitol，得到含sorbitol 濃度為2M，3M，4M的PDA固體高滲培養(yǎng)基。(4)真菌基礎(chǔ)培養(yǎng)液蛋白胨(ρ印tone) 0.3%,硫酸銨0.2%，酵母膏0.05%，磷酸二氫鉀0. 4%，氯化鈣0. 03%，七水硫酸鎂0. 03%，葡萄糖10g/L，分別加入不同量的NaCl， 使其N(xiāo)aCl含量分別為0-3M。0. IMPa, 121°C滅菌30min。(5)MS 培養(yǎng)基大量元素母液(20XlL) :33g NH4NO3, 38g KNO3,8. 8g CaCl2 · 2H20，7. 4g MgSO4 · 7Η20，3· 4g ΚΗ2Ρ04。微量元素母液(200X 1L) :4. 46g MnSO4 · H20，1. 72g ZnSO4 · 7H20，0. 005g CoCl2 · 6H20，0. 005g CuSO4 · 5H20,1. 24g H3BO3,0. 05g Na2MO4 · 2H20，0. 166g KI。鐵鹽母液(200X，1L) :5. 74g FeS04 · 7Η20，7· 46g EDTA0有機(jī)物母液QOOX 1L) :0. 2g煙酸，0. 2g鹽酸吡哆醇(VB6)，0. 04g鹽酸硫胺素，40g 肌醇，0. 8g甘氨酸。 MS生根培養(yǎng)基(IL) :50ml大量元素(20 X)，5ml微量元素(200 X)，5ml有機(jī)元素 Q00X)，5ml 鐵鹽 Q00X)，30g 蔗糖，NAA(0. ang/L)，IOg 瓊脂粉，pH 6.0，高壓滅菌。( 二 )具體分離方法從深圳海域紅樹(shù)植物水黃皮中采集水黃皮靠近根部水面上方樹(shù)皮作為分離材料， 將采集到的材料表面洗凈，帶入無(wú)菌室。將枝條表面用火焰滅菌IOs 15s。用無(wú)菌刀將其剪成3cm km的小段，75%酒精消毒10min，0. 的升汞浸泡:3min。用無(wú)菌水洗滌5遍。 另設(shè)對(duì)照組(以最后洗滌的無(wú)菌水作為對(duì)照)。將枝條小段分別接種于含有濃度IM和3M 的NaCl的PDA固體培養(yǎng)基平皿上(每種材料3皿，每皿3段枝條)，放置于25°C恒溫箱中培養(yǎng)；待長(zhǎng)出菌落后，按無(wú)菌操作程序挑出菌絲的尖端，接種于PDA固體培養(yǎng)基平皿上，進(jìn)行菌種的分離純化，得到海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌，命名為Phomopsis occulta,隱藏?cái)M莖點(diǎn)霉，本申請(qǐng)簡(jiǎn)稱(chēng)為SN3-2。將純種菌株接入沙氏試管斜面保存。每3個(gè)月 4個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。SN3-2為擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)，25°C暗室，培養(yǎng)7天，觀察其形態(tài)特征和顯微特征，描述詳見(jiàn)表1和圖1A、圖1B。表1本發(fā)明所述海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2的培養(yǎng)特征菌林PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落特征菌絲和分生孢子特征SN3-2菌落為白色毛狀，邊緣整齊，成熟時(shí)有青灰色小點(diǎn)。菌絲匍匐生長(zhǎng)，分隔，孢子內(nèi)生。實(shí)施例2海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌耐鹽性、嗜鹽性和耐滲性分析將分離到的海洋紅樹(shù)耐鹽內(nèi)生真菌菌種分別接種到含NaCl濃度為1M，2M，3M的 PDA固體高鹽培養(yǎng)基，在25°C暗室培養(yǎng)，7天后記錄其生長(zhǎng)狀況，見(jiàn)表2。表2海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌對(duì)NaCl的耐鹽度鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種具有神經(jīng)退行性疾病防治活性的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌，其保藏編號(hào)為 CCTCC M2011044。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有神經(jīng)退行性疾病防治活性的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌，其特征在于其18srDNA的堿基序列如SEQ ID NO 1所示。
3.從紅樹(shù)樹(shù)皮中分離海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌的方法，包括以下步驟1)取紅樹(shù)樹(shù)皮，洗凈，帶入無(wú)菌室滅菌；2)將滅菌紅樹(shù)樹(shù)皮分別接種于含有濃度IM和3M的NaCl的PDA固體培養(yǎng)基平皿上，放置于25°C恒溫箱中培養(yǎng)；3)待長(zhǎng)出菌落后，按無(wú)菌操作程序挑出菌絲的尖端，接種于PDA固體培養(yǎng)基平皿上，進(jìn)行菌種的分離純化，得到海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從紅樹(shù)樹(shù)皮中分離海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌的方法，其特征在于所述紅樹(shù)樹(shù)皮為靠近根部水面上方的樹(shù)皮。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的從紅樹(shù)樹(shù)皮中分離海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌的方法，其特征在于所述紅樹(shù)樹(shù)皮經(jīng)表面滅菌后用滅菌后，無(wú)菌刀將其剪成3cm km的小段，再用酒精和升汞浸泡滅菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種從紅樹(shù)樹(shù)皮中分離的具有神經(jīng)退行性疾病防治活性的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌，其保藏編號(hào)為CCTCC M2011044。本發(fā)明所述的海洋紅樹(shù)耐鹽性?xún)?nèi)生真菌SN3-2次生代謝產(chǎn)物及菌體提取物具有顯著的抗AD活性。以E.coli細(xì)胞模型進(jìn)行抗A-beta聚集活性篩選和研究，該菌菌體提取物具有很強(qiáng)的A-beta聚集的抑制作用；以體外A-beta聚集模型進(jìn)行抗A-beta聚集活性測(cè)試，該菌菌體提取物具有較強(qiáng)的抗聚集活性。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102408998SQ20111017776
公開(kāi)日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者劉昀, 吳海強(qiáng), 鄒永東, 鄭易之, 黃健子 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)