專利名稱：枸杞類胡蘿卜素合成酶基因psy及包括該基因的質粒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體地說涉及一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY及含有該基因的質粒。
背景技術：
植物體內類胡蘿卜素均通過異戊二烯化合物或萜類化合物合成。代謝主鏈上有5種酶參與，分別是八氫番茄紅素合成酶(PSY)、八氫番茄紅素脫飽和酶(PDS)、ξ-胡蘿卜素脫飽和酶(ZDS)、番茄紅素β-環(huán)化酶(LycB)和番茄紅素ε-環(huán)化酶(LycE)。隨著分子生物學研究手段的發(fā)展，編碼這些酶的基因已從番茄、煙草、辣椒、擬南芥、玉米等植物中陸續(xù)分離鑒定。據報道枸杞中的總胡蘿卜素含量為2.9527mg·g-1，其含量之高為植物所罕見。目前有關枸杞類胡蘿卜素合成酶基因的克隆國內外還未見報道。主要技術文獻有陶俊，張上隆，徐昌杰，等。類胡蘿卜素合成的相關基因及基因工程.生物工程學報，2002，18(3)276～281；Cunningham F X，Gantt E.Genes and enzymes of carotenoid biosynthesisin plants.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1998，6(49)557～583；李忠，彭光華，張聲華.枸杞子中的類胡蘿卜素的組成及含量.植物資源與環(huán)境，1999，8(4)57～58等。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY編碼的多肽。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種包含一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY的重組質粒。
本發(fā)明的技術方案概述如下一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY，它具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY編碼的多肽，它具有序列表SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
一種包含權利要求1基因的重組質粒pGEM-lbPSY，是以序列表SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4為引物PCR擴增出的DNA序列，回收得到1292bpDNA，將其克隆到pGEM-T載體上，構建了重組質粒pGEM-lbPSY。
本發(fā)明參照其它植物的PSY基因序列設計引物，采用PCR技術從枸杞cDNA文庫中分離到PSY基因，將其克隆到T載體，并采用生物信息軟件對所獲得的PSYcDNA及其推導的氨基酸序列進行分析。
本發(fā)明成功的獲得枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY，為通過基因工程手段調控植物體內類胡蘿卜素的代謝和積累，創(chuàng)造類胡蘿卜素含量更高的品系，改良果蔬的營養(yǎng)品質，實現(xiàn)工廠化生產天然類胡蘿卜素奠定基礎。


圖1為以從枸杞cDNA文庫中提取到的λ噬菌體DNA為模板，SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4為引物的擴增產物凝膠電泳圖譜，圖中，1.Marker2000；2.PCR產物。
圖2為重組質粒pGEM-lbPSY的PCR擴增鑒定，圖中，1.2 pGEM-lbPSY的PCR結果；3.Marker2000。
圖3為重組質粒pGEM-lbPSY的酶切鑒定，圖中，1.2 pGEM-lbPSY的雙酶切結果；3.Marker2000。
圖4為枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY序列的開放讀碼框分析。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1PCR模板的制備枸杞cDNA文庫由本實驗室提供，采用液體培養(yǎng)法提取λ噬菌體DNA。
本領域的技術人員都可以在實驗室構建枸杞cDNA文庫。該文庫的構建步驟(1)總RNA提取及mRNA純化；(2)cDNA雙鏈的合成；(3)用連接酶將cDNA與接頭連接；(4)去除小片段及多余接頭；(5)將cDNA克隆到載體上；(6)噬菌體的包裝；(7)cDNA文庫質量檢測。
在cDNA文庫構建過程中，使用了mRNA分離試劑盒、cDNA合成試劑盒、LambdaDNA包裝試劑盒、載體λExCell等，這些試劑盒均已經商品化。
實施例2PCR體外擴增根據番茄、辣椒、擬南芥、玉米等植物PSY基因的保守序列設計一對引物引物1(正向SEQ ID No.3)GAA TTC ATG TCT ATT TGT ACG CTA TGG GTT GTT；引物2(反向、SEQ ID No.4)GC GGC CGC TCA TGT TTG GGG TAT CAT AAA AGA，在25μL反應體系中，加入10×PCRBuffer(Mg2+15mmol·L-1)3.0μL，dNTP(各2.5mmol·L-1)2.5μL，引物1(20μmol·L-1)和引物2(20μmol·L-1)各1.5μL，TaqDNA聚合酶(5U·μL-1)0.5μL，模板DNA 1.5ng。反應條件94℃ 3min→(94℃ 1min→55℃ 1min→72℃ 2min)35→72℃ 10min。擴增反應在德國UNOII Biometra DNA擴增儀上進行。反應結束后在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢查。(見圖1)實施例3擴增產物的克隆與DNA序列測定采用北京鼎國生物技術發(fā)展中心的DNA片段回收試劑盒回收PCR擴增產物。回收產物與pCEM-T載體進行連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選。隨機挑取白色菌落，用堿裂解法小量提取質粒DNA，并進行PCR和雙酶切(SacI，NcoI)鑒定。由華大基因上海鼎安生物科技有限公司用DNA熒光自動序列分析儀進行序列測定。
實施例4PSY基因的序列分析重組質粒pGEM-lbPSY的DNA序列分析結果表明，分離克隆的PSY基因cDNA全長1292bp，閱讀框位于7～1284bp之間，共編碼425個氨基酸。與其他植物PSY基因核苷酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，與番茄(A21360)、辣椒(X68017)、擬南芥(L25812)、玉米(U32636)、黃水仙(X78814)、甜瓜(Z37543)的同源性分別為78％，80％，77％，75％，79％，80％。另外，該基因所編碼的氨基酸序列與其他植物PSY基因的氨基酸同源性高達70％～80％，肽鏈長度相仿，由410～425個氨基酸組成。
實施例5PSY基因所編碼的蛋白質特性分析用Antheprot軟件對PSY基因編碼蛋白質的基本特性和氨基酸組成進行分析。結果為，分子量(Molecular Weight)是48 327，等電點(Isoelectric Point)為8.825。在pH 7.0時，電荷為6.983。
表1 PSY基因編碼的蛋白質氨基酸組成Table.1 The amino acid components by PSY

SEQ ID No.1gaattcatgt ctatttgtac gctatgggtt gtttcgccga gttctgaagt tttgagtggcaatgttttct tggagccaat tcgagaaagt taccattttt cggataaaag tttaatgtacaatggaagag ttaagaaaag tagacaccaa aggcgtagat cacgttatgg ggttggagatttgagttcat tttgcttgag agagtctgga ttagagaccc cgggaagaag attatcggtatcctccagta ttatagctac cccggcagga gaaatgacga tgacatcaga gcaaaaggtttatgatgtcg ttttaaagca agcagctttg attaatagac agttgaggtc tagagaaaatttggaggtga aaccggacat tattttgcca ggaaacgcga acgtgttgaa tgaagcttatgatcggtgtc gagaagtatg tgctgaatat gccaagtcat tctactgggg aacccagctcatgacaccgg agaggcgttt agctatctgg gcgatatatg tatggtgtag gaggacagatgagcttgttg atgggcctaa cgcgtcacac ataaatccaa ccgcgttaga taggtgggaagcaagattag aagatgtttt caaagggcaa ccttttgata tgcttgatgc tgctttatctgataccatta ccaagtatcc tgtggacatc cagccattta gagatatgat agaaggaatgcggatggatc tgaagaaatc gagatacaag aatttcgatg agctgtatct ttactgctattatgtggctg gtacagttgg cttgatgagt gtaccagtaa tgggcattgc acctgaatctaaggcaacaa cagaaagtgt gtataatgca gctttatctt tggggatcgc gaaccagctgactaacattc taagggatgt tggagaagat gcaagaagag ggagagtgta cctacctcaagatgaattag cacaagcagg tttatcagat gaggacattt ttgctggaaa agttacagacaaatggagga tttttatgaa gaagcaaatc aaaagggcta gaaaattcta tgatgatgcagagaaaggag tccccgaact cagctccgcg agcagattgc ctgtgtgggc agcgttgcttttttatagaa aaatattgga tgagatagaa gcaaatgact acaacaattt cacaaaaagggcttatgtaa acaaggcaaa gaagctatta gctatgcctg tagcatgtgc caagtctctctcttttatga taccccaaac atgagcggcc gcSEQ ID No.2MetSerIleCysThr LeuTrpValValSer ProSerSerGluVal LeuSerGlyAsnVal151015 20PheLeuGluProIle ArgGluSerTyrHis PheSerAspLysSer LeuMetTyrAsnGly25 30 3540ArgValLysLysSer ArgHisGlnArgArg ArgSerArgTyrGly ValGlyAspLeuSer45 50 55 60SerPheCysLeuArg GluSerGlyLeuGlu ThrProGlyArgArg LeuSerValSerSer65 70 75 80SerIleIleAlaThr ProAlaGlyGluMet ThrMetThrSerGlu GlnLysValTyrAsp85 90 95 100ValValLeuLysGln AlaAlaLeuIleAsn ArgGlnLeuArgSer ArgGluAsnLeuGlu105 110 115 120
ValLysProAspIle IleLeuProGlyAsn AlaAsnValLeuAsn GluAlaTyrAspArg125 130 135 140CysArgGluValCys AlaGluTyrAlaLys SerPheTyrTrpGly ThrGlnLeuMetThr145 150 155 160ProGluArgArgLeu AlaIleTrpAlaIle TyrValTrpCysArg ArgThrAspGluLeu165 170 175 180ValAspGlyProAsn AlaSerHisIleAsn ProThrAlaLeuAsp ArgTrpGluAlaArg185 190 195 200LeuGluAspValPhe LysGlyGlnProPhe AspMetLeuAspAla AlaLeuSerAspThr205 210 215 220IleThrLysTyrPro ValAspIleGlnPro PheArgAspMetIle GluGlyMetArgMet225 230 235 240AspLeuLysLysSer ArgTyrLysAsnPhe AspGluLeuTyrLeu TyrCysTyrTyrVal245 250 255 260AlaGlyThrValGly LeuMetSerValPro ValMetGlyIleAla ProGluSerLysAla265 270 275 280ThrThrGluSerVal TyrAsnAlaAlaLeu SerLeuGlyIleAla AsnGlnLeuThrAsn285 290 295 300IleLeuArgAspVal GlyGluAspAlaArg ArgGlyArgValTyr LeuProGlnAspGlu305 310 315 320LeuAlaGlnAlaGly LeuSerAspGluAsp IlePheAlaGlyLys ValThrAspLysTrp325 330 335 340ArgIlePheMetLys LysGlnIleLysArg AlaArgLysPheTyr AspAspAlaGluLys345 350 355 360GlyValProGluLeu SerSerAlaSerArg LeuProValTrpAla AlaLeuLeuPheTyr365 370 375 380ArgLysIleLeuAsp GluIleGluAlaAsn AspTyrAsnAsnPhe ThrLysArgAlaTyr385 390 395 400ValAsnLysAlaLys LysLeuLeuAlaMet ProValAlaCysAla LysSerLeuSerPhe405 410 415 420MetIleProGlnThr425SEQ ID No.3gaattcatgt ctatttgtac gctatgggtt gtt 33SEQ ID No.4gcggccgctc atgtttgggg tatcataaaa ga 3權利要求
1.一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY，其特征是它具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
2.一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY編碼的多肽，其特征是它具有序列表SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
3.一種包含權利要求1基因的重組質粒pGEM-lbPSY，其特征是以序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.4為引物PCR擴增出的DNA序列，回收得到1292bpDNA，將其克隆到pGEM-T載體上，構建了重組質粒pGEM-lbPSY。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY及包括該基因的質粒，枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY具有序列表SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，本發(fā)明的枸杞類胡蘿卜素合成酶基因PSY為通過基因工程手段調控植物體內類胡蘿卜素的代謝和積累，創(chuàng)造類胡蘿卜素含量更高的品系，改良果蔬的營養(yǎng)品質，實現(xiàn)工廠化生產天然類胡蘿卜素奠定基礎。
文檔編號C12N9/00GK1884547SQ20061001448
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月29日 優(yōu)先權日2006年6月29日
發(fā)明者季靜, 王罡, 鄭陽霞 申請人:天津大學