專利名稱：：具有增強分解纖維素活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸的制作方法關于受到聯(lián)邦政府資助的研究與開發(fā)的發(fā)明權利的聲明本發(fā)明是在受到政府資助的由能源部簽訂的主要合同DE-AC36-98GO10337的NREL轉包合同NO.ZCO-30017-02下做出的。政府擁有本發(fā)明的一些權利。
背景技術：
：發(fā)明領域本發(fā)明涉及具有增強分解纖維素活性的分離多肽和編碼所述多肽的分離多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞以及生產和使用所述多肽的方法。相關領域的描述纖維素是單糖葡萄糖通過β-1，4-連接鍵共價鍵合的聚合物。許多微生物產生水解β-連接葡聚糖的酶。這些酶包括內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內切葡聚糖酶在任意位置消化纖維素聚合物，使其易受纖維二糖水解酶的攻擊。纖維二糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序釋放纖維二糖分子。纖維二糖是葡萄糖的水溶性β-1，4-連接二聚體。β-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將纖維素原料轉變成乙醇具有如下優(yōu)點，即易于獲得大量原料、避免燃燒或填埋物質、以及乙醇燃料的清潔性?，F(xiàn)在認為木材、農業(yè)殘余物、草本作物、和城市固體廢物是生產乙醇的原料。這些物質主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。一旦將纖維素轉變成葡萄糖，就容易通過酵母將葡萄糖發(fā)酵成乙醇。在本領域中提高纖維素原料的轉化將是有利的。本發(fā)明的一個目的是提供具有增強分解纖維素活性的分離多肽和編碼所述多肽的分離核酸序列以提高纖維素原料的轉化。發(fā)明概述本發(fā)明涉及選自下列的具有增強分解纖維素活性的分離多肽(a)具有如下氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與SEQIDNO2第23至250位氨基酸具有至少70％的同一性；(b)由如下核酸序列編碼的多肽，該核酸序列在中等嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交；和(c)在SEQIDNO2第23至250位氨基酸中含有一個或多個氨基酸的保守缺失、插入、和/或替代的變體。本發(fā)明還涉及選自下列的編碼具有增強分解纖維素活性的多肽的分離多核苷酸(a)編碼具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，該氨基酸序列與SEQIDNO2第23至250位氨基酸具有至少70％的同一性；(b)與SEQIDNO1第67至805位核苷酸具有至少70％同一性的多核苷酸；和(c)在至少中等嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體、和重組宿主細胞。本發(fā)明還涉及生產這些具有增強分解纖維素活性的多肽的方法，包括(a)在有助于產生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含如下核酸構建體的重組宿主細胞，該核酸構建體包含編碼所述多肽的多核苷酸；并(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，其中所述基因可操作連接由SEQIDNO1第1至66位核苷酸組成的編碼信號肽的核苷酸序列，其中所述基因對于所述核苷酸序列而言是外源的。本發(fā)明還涉及降解或者轉化纖維素材料的方法，包括在存在有效量的具有增強分解纖維素活性的多肽時，用有效量的分解纖維素的蛋白質處理纖維素材料，其中與不存在該具有增強分解纖維素活性的多肽時相比，該具有增強分解纖維素活性的多肽的存在增加纖維素材料的降解。本發(fā)明還涉及生產有機物質的方法，包括(a)在存在有效量的具有增強分解纖維素活性的多肽時，用有效量的分解纖維素的蛋白質糖化纖維素材料，其中與不存在該具有增強分解纖維素活性的多肽時相比，該具有增強分解纖維素活性的多肽的存在增加纖維素材料的降解；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物對步驟(a)的己糖化纖維素材料進行發(fā)酵；并(c)由發(fā)酵回收有機物質。附圖簡述圖1顯示了橙色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的增強分解纖維素活性的基因組DNA序列和推導的氨基酸序列(分別為SEQIDNO1和2)。預測的內含子以斜體表示。預測的信號肽(SignalP)標以下劃線。編碼序列為799bp，包括終止密碼子且間含一個56bp的內含子。預測的成熟多肽含有228個氨基酸。圖2顯示了pAILo1的限制性圖譜。圖3顯示了pBANe10的限制性圖譜。圖4顯示了pAILo2的限制性圖譜。圖5顯示了pDZA2的限制性圖譜。定義增強分解纖維素活性(cellulolyticenhancingactivity)術語“增強分解纖維素活性”在本文中定義為這樣的生物活性，其促進具有纖維素分解活性的蛋白質水解纖維素材料-。對本發(fā)明來說，增強分解纖維素活性是通過在如下條件下測量分解纖維素的蛋白質水解纖維素材料產生的還原糖的增量而測定的在存在和不存在0.01-2.5mg增強分解纖維素活性/gPCS中的纖維素時，2.5mg分解纖維素的蛋白質/gPCS于50℃保溫5-7天，與用沒有增強分解纖維素活性的等量總蛋白質加載(5.01-7.5mg分解纖維素的蛋白質/gPCS中的纖維素)進行的對照水解進行比較。在一個優(yōu)選的方面，使用從NovozymesA/S(Bagsv_rd，丹麥)獲得的、由表達米曲霉(Aspergillusoryzae)β-葡糖苷酶的瑞氏木霉(Trichodrmareesei)發(fā)酵得到的、下稱Tr/AoBG(WO02/095014)的纖維素酶制備物的纖維素酶蛋白質加載作為分解纖維素活性的來源。本發(fā)明的多肽具有由SEQIDNO2第23至250位氨基酸所示氨基酸序列組成的多肽的至少20％、優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、甚至更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％、且甚至最優(yōu)選至少100％的增強分解纖維素活性。纖維素材料(cellulosicmaterial)術語“纖維素材料”在本文中定義為任何含有纖維素的材料。通常在例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸或者樹的葉、枝、和木質發(fā)現(xiàn)有纖維素。纖維素材料還可以是，但不限于，草本植物材料、農業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙、以及紙漿和造紙廠殘余物。應當理解本文的纖維素可以是木質纖維素的形式，即在混合基質中含有木質素、纖維素、和半纖維素的植物細胞壁材料。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是稻草。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是紙和紙漿加工廢料。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是木本或草本植物。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是甘蔗渣?？梢允褂帽绢I域已知的常規(guī)方法來利用纖維素材料，進行或者可進行預處理。例如，物理預處理技術可包括各種類型的碾磨、照射、蒸/蒸汽噴發(fā)(steamexplosion)、和濕熱分解作用(hydrothermolysis)；化學預處理技術可包括用稀酸、堿、有機溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳、和pH控制的濕熱分解作用；及生物預處理技術可包括應用溶解木質素的微生物(參見例如Hsu，T-A.，1996，Pretreatmentofbiomass，在《HandbookonBioethanolProductionandUtilization》中，Wyman，C.E.編，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass，Adv.Appl.Microbiol.39295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomassareview，在《EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction》，Himmel，M.E.、Baker，J.O.和Overend，R.P.編，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety，Washington，DC，chapter15；Gong，C.S.、Cao，N.J.、Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，在《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》，Scheper，T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany，65207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，F(xiàn)ermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction，Enz.Microb.Tech.18312-331；及Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，ProductionofethanolfromlignocellulosicmaterialsStateoftheart，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.4263-95)。纖維素分解活性術語“纖維素分解活性”在本文中定義為水解纖維素材料的生物學活性。對本發(fā)明來說，纖維素分解活性是通過在如下條件下測量分解纖維素的混合物水解纖維素材料的增量而測定的1-10mg分解纖維素的蛋白質/gPCS中的纖維素于50℃保溫5-7天，與未添加分解纖維素的蛋白質的對照水解進行比較。在一個優(yōu)選的方面，使用從NovozymesA/S(Bagsv_rd，丹麥)獲得的、由表達米曲霉β-葡糖苷酶的瑞氏木霉發(fā)酵得到的、下稱Tr/AoBG(WO02/095014)的載有纖維素酶蛋白質的纖維素酶制備物作為分解纖維素活性的來源。經(jīng)過預處理的玉米秸桿術語“經(jīng)過預處理的玉米秸桿”或“PCS”在本文中定義為通過用加熱和稀酸處理玉米秸桿得到的纖維素材料。對本發(fā)明來說，PCS是通過實施例9描述的方法或其改變時間、溫度和酸量的變體方法制備的。糖苷水解酶家族61(family61glycosidehydrolase)術語“糖苷水解酶61家族”或“GH61家族”在本文中定義為根據(jù)B.Henrissat，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities，Biochem.J.280309-316及HenrissatB.和BairochA.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases，Biochem.J.316695-696歸入糖苷水解酶61家族的多肽。目前，Henrissat將GH61家族列入未分類的，指示屬于這個家族的多肽的某些性質，諸如機制、催化性親核體/堿、催化性質子供體、和三維結構是未知的。分離的多肽術語“分離的多肽”在用于本文時指根據(jù)SDS-PAGE的測定，至少20％純、優(yōu)選至少40％純、更優(yōu)選至少60％純、還更優(yōu)選至少80％純、最優(yōu)選至少90％純、且甚至最優(yōu)選至少95％純的多肽?；旧霞兊亩嚯?substantiallypurepolypeptide)術語“基本上純的多肽”在本文中指以重量計含有至多10％、優(yōu)選至多8％、更優(yōu)選至多6％、更優(yōu)選至多5％、更優(yōu)選至多4％、更優(yōu)選至多3％、甚至更優(yōu)選至多2％、最優(yōu)選至多1％、且甚至最優(yōu)選至多0.5％與該多肽天然相伴隨的其它多肽物質的多肽制備物。因此，優(yōu)選的是，基本上純的多肽以重量計制備物中存在的全部多肽物質是至少92％純的、優(yōu)選至少94％純的、更優(yōu)選至少95％純的、更優(yōu)選至少96％純的、更優(yōu)選至少96％的純的、更優(yōu)選至少97％純的、更優(yōu)選至少98％純的、甚至更優(yōu)選至少99％純的、最優(yōu)選至少99.5％純的、且甚至最優(yōu)選100％純的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選的是多肽是“本質上(essentially)純的形式”，即多肽制備物本質上不含與該多肽天然相伴隨的其它多肽物質。例如，這可通過采用眾所周知的重組方法或采用經(jīng)典的純化方法制備多肽來實現(xiàn)。在本文中，術語“基本上純的多肽”與術語“分離的多肽”和“分離形式的多肽”含義相同。同一性(identity)本文用參數(shù)“同一性”來描述兩種氨基酸序列之間或兩種核苷酸序列之間的相關性。對本發(fā)明來說，兩種氨基酸序列之間的同一性程度可使用ParacelBioViewWorkbench軟件(Paracel，Pasadena，CA)及blosum62矩陣通過blastp算法(Higgins，1989，CABIOS5151-153)來測定。采用缺口罰分，存在10和延伸10，作為配對比對(pairwisealignment)參數(shù)。對本發(fā)明來說，兩種核苷酸序列之間的同一性程度使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)及同一性表和后面的多重比對參數(shù)通過Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80726-730)來測定缺口罰分10和缺口長度罰分10。配對比對參數(shù)Ktuple＝3，缺口罰分＝3，和窗口(windows)＝20。多肽片段術語“多肽片段”在本文中定義為從SEQIDNO2第23至250位氨基酸或其同源序列的氨基和/或羧基末端刪除了一個或多個氨基酸的多肽，其中所述片段具有增強分解纖維素活性。優(yōu)選的是，SEQIDNO2第23至250位氨基酸的片段含有至少175個氨基酸殘基、更優(yōu)選至少190個氨基酸殘基、且最優(yōu)選至少205個氨基酸殘基。子序列術語“子序列”在本文中定義為由SEQIDNO1第67至805位核苷酸的5′和/或3′末端刪除了一個或多個核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列，其中子序列編碼具有增強分解纖維素活性的多肽片段。優(yōu)選的是，SEQIDNO1第67至805位核苷酸的子序列含有至少525個核苷酸、更優(yōu)選至少570個核苷酸、且最優(yōu)選至少615個核苷酸。等位變體術語“等位變體”在本文中指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或多種可選形式中的任一種。等位變異由突變天然引起，并可導致種群內多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?所編碼多肽沒有變化)，或者可編碼氨基酸序列改變的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術語“分離的多核苷酸”在用于本文時指根據(jù)瓊脂糖電泳的測定，至少20％純的、優(yōu)選至少40％純的、更優(yōu)選至少60％純的、甚至更優(yōu)選至少80％純的、最優(yōu)選至少90％純的、且甚至最優(yōu)選至少95％純的多核苷酸?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g語“基本上純的多核苷酸”在用于本文時指不含其它外來或不需要的核苷酸且以適于在基因工程蛋白質生產系統(tǒng)內使用的形式存在的多核苷酸制備物。因此，基本上純的多核苷酸以重量計含有至多10％、優(yōu)選至多8％、更優(yōu)選至多6％、更優(yōu)選至多5％、更優(yōu)選至多4％、更優(yōu)選至多3％、甚至更優(yōu)選至多2％、最優(yōu)選至多1％、且甚至最優(yōu)選至多0.5％與該多核苷酸天然相伴隨的其它多核苷酸物質。然而，基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5′和3′非翻譯區(qū)，諸如啟動子和終止子。優(yōu)選的是，基本上純的多核苷酸以重量計是至少90％純的、優(yōu)選至少92％純的、更優(yōu)選至少94％純的、更優(yōu)選至少95％純的、更優(yōu)選至少96％純的、更優(yōu)選至少97％純的、甚至更優(yōu)選至少98％純的、最優(yōu)選至少99％純的、且甚至最優(yōu)選至少99.5％純的。優(yōu)選的是，本發(fā)明的多核苷酸是基本上純的形式。具體而言，優(yōu)選的是，本文公開的多核苷酸是“本質上純的形式”，即多核苷酸制備物本質上不含與該多核苷酸天然相伴隨的其它多核苷酸物質。在本文中，術語“基本上純的多核苷酸”與術語“分離的多核苷酸”和“分離形式的多核苷酸”含義相同。多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源或其任意組合。cDNA術語“cDNA”在本文中定義為可通過逆轉錄由真核細胞獲得的成熟的、經(jīng)過剪接的mRNA分子而制備的DNA分子。cDNA缺乏通常在相應基因組DNA中存在的內含子序列。最初的初級RNA轉錄本是mRNA的前體，它在成為成熟的、經(jīng)過剪接的mRNA之前要經(jīng)過一系列加工步驟。這些步驟包括通過稱為剪接的過程除去內含子序列。因此，由mRNA衍生的cDNA缺乏任何內含子序列。核酸構建體術語“核酸構建體”在用于本文時指單鏈或雙鏈的核酸分子，它是由天然存在的基因分離的，或是經(jīng)過修飾而以自然界中不存在的方式含有核酸區(qū)段。當核酸構建體含有表達本發(fā)明編碼序列所需要的控制序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”含義相同?？刂菩蛄行g語“控制序列”在本文中定義為包括對表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸所必需的或有利的所有成分。每種控制序列對編碼多肽的核苷酸序列來說可以是天然的或外來的，或者每種控制序列相對彼此也可以是天然的或外來的。這些控制序列包括，但不限于，前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽(propeptide)序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。至少，控制序列包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。為了引入特異的限制性位點以便于控制序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)連接，控制序列可以帶有接頭(linkers)。可操作連接術語“可操作連接”在本文中指這樣一種構造，其中控制序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得控制序列指導多肽編碼序列的表達。編碼序列在用于本文時，術語“編碼序列”意指直接規(guī)定其蛋白質產物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界一般由開放讀碼框確定，它通常起始于ATG起始密碼子或備選起始密碼子諸如GTG和TTG，并終止于終止密碼子諸如TAA、TAG和TGA。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。表達術語“表達”包括多肽產生涉及的所有步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。表達載體術語“表達載體”在本文中定義為如下線狀或環(huán)狀DNA分子，它包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，且其與有助于其表達的其它核苷酸可操作連接。宿主細胞術語“宿主細胞”在用于本文時包括易于用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構建體或表達載體轉化、轉染、轉導、等等的任何細胞類型。修飾術語“修飾”在本文中意指對包含SEQIDNO2第23至250位氨基酸或其同源序列或由其組成的多肽的任何化學修飾以及對編碼該多肽的DNA的基因操作。修飾可以是一個或多個氨基酸的替代、刪除和/或插入，以及一個或多個氨基酸側鏈的替換。人工變體在用于本文時，術語“人工變體”意指具有增強分解纖維素活性的多肽，它是由表達經(jīng)修飾的核苷酸序列SEQIDNO1或其同源序列或其成熟編碼區(qū)的生物體產生的。經(jīng)修飾的核苷酸序列可通過人工干預對SEQIDNO1中所公開的核苷酸序列或其同源序列或其成熟編碼區(qū)進行修飾來獲得。具有增強分解纖維素活性的多肽在第一個方面，本發(fā)明涉及具有如下氨基酸序列的具有增強分解纖維素活性的分離多肽，該氨基酸序列與SEQIDNO2第23至250位氨基酸(即成熟多肽)具有至少70％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％、且甚至最優(yōu)選至少97％、98％或99％的同一性程度(下文的“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，同源多肽的氨基酸序列與SEQIDNO2第23至250位氨基酸相差10個氨基酸、優(yōu)選5個氨基酸、更優(yōu)選4個氨基酸、甚至更優(yōu)選3個氨基酸、最優(yōu)選2個氨基酸、且甚至最優(yōu)選1個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含氨基酸序列SEQIDNO2或其等位變體；或其具有增強分解纖維素活性的片段。在一個優(yōu)選的方面，多肽包含氨基酸序列SEQIDNO2。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2第23至250位氨基酸或其等位變體；或其具有增強分解纖維素活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2第23至250位氨基酸。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由氨基酸序列SEQIDNO2或其等位變體；或其具有增強分解纖維素活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由氨基酸序列SEQIDNO2組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2第23至250位氨基酸或其等位變體；或其具有增強分解纖維素活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2第23至250位氨基酸組成。在第二個方面，本發(fā)明涉及由如下多核苷酸編碼的具有增強分解纖維素活性的分離多肽，該多核苷酸在很低嚴緊條件、優(yōu)選低嚴緊條件、更優(yōu)選中等嚴緊條件、更優(yōu)選中等-高嚴緊條件、甚至更優(yōu)選高嚴緊度條件、且最優(yōu)選很高嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸；(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列；(iii)，(i)或(ii)的子序列，或(iv)，(i)、(ii)或(iii)的互補鏈發(fā)生雜交(J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，《MolecularCloning，ALaboratoryManual》，第2版，ColdSpringHarbor，NewYork)。SEQIDNO1的子序列含有至少100個連續(xù)核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。另外，子序列可編碼具有增強分解纖維素活性的多肽片段。根據(jù)本領域眾所周知的方法，可使用核苷酸序列SEQIDNO1或其子序列以及氨基酸序列SEQIDNO2或其片段來設計核酸探針，用于從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有增強分解纖維素活性的多肽的DNA。具體而言，遵循標準Southern印跡程序，可將這些探針用于與目的屬或種的基因組或cDNA進行雜交，從而鑒定和分離其中的相應基因。這些探針可以比完整序列短得多，但是長度應當是至少14個、優(yōu)選至少25個、更優(yōu)選至少35個、且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選的是，核酸探針的長度是至少100個核苷酸。例如，核酸探針的長度可以是至少200個核苷酸、優(yōu)選至少300個核苷酸、更優(yōu)選至少400個核苷酸、或最優(yōu)選至少500個核苷酸?？墒褂蒙踔粮L的探針，例如長度是至少550核苷酸、至少優(yōu)選至少600個核苷酸、更優(yōu)選至少650個核苷酸、或最優(yōu)選至少700個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針都可使用。通常將探針進行標記，用于檢測相應的基因(例如用32P、3H、35S、生物素、或親和素)。本發(fā)明涵蓋這些探針。因此，可從這樣的其它生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針發(fā)生雜交且編碼具有增強分解纖維素活性的多肽的DNA。來自這樣的其它生物體的基因組或其它DNA可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術來分離?？蓪碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉移并固定在硝酸纖維素或其它適宜載體材料上。為了鑒定與SEQIDNO1或其子序列同源的克隆或DNA，將載體材料用于Southern印跡。對本發(fā)明而言，雜交是指在很低至很高的嚴緊條件下將核苷酸序列與經(jīng)標記的核酸探針進行雜交，其中核酸探針對應于SEQIDNO1所示核苷酸序列、SEQIDNO1所含cDNA序列、其互補鏈、或其子序列。在這些條件下與核酸探針發(fā)生雜交的分子可用X射線膠片檢測。在一個優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼多肽SEQIDNO2或其子序列的核酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO1。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質粒pDZA2-7中的核酸序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中，其中所述核酸序列編碼具有增強分解纖維素活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質粒pDZA2-7中的成熟多肽編碼區(qū)，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。對于長度為至少100個核苷酸的長探針來說，很低至很高的嚴謹條件定義為遵循標準Southern印跡程序，于42℃，在5XSSPE、0.3％SDS、200μg/ml經(jīng)剪切且經(jīng)變性的鮭精DNA、和用于很低和低嚴謹度的25％甲酰胺、用于中等和中等-高嚴謹度的35％甲酰胺、或用于高和很高嚴謹度的50％甲酰胺中進行最佳12-24小時的預雜交和雜交。對于長度為至少100個核苷酸的長探針來說，最后優(yōu)選于至少45℃(很低嚴謹度)、更優(yōu)選于至少50℃(低嚴謹度)、更優(yōu)選于至少55℃(中等嚴謹度)、更優(yōu)選于至少60℃(中等-高嚴謹度)、甚至更優(yōu)選于至少65℃(高嚴謹度)、且最優(yōu)選于至少70℃(很高嚴謹度)將載體材料用2×SSC、0.2％SDS清洗3次，每次15分鐘。對于長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針來說，嚴謹條件定義為遵循標準Southern印跡程序，于比根據(jù)Bolton和McCarthy(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)的計算方法計算得到的Tm值低大約5℃至大約10℃的溫度，在0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5％NP-40、1XDenhardt氏溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉、0.1mMATP、和0.2mg/ml酵母RNA中進行最佳12至24小時的預雜交、雜交、和雜交后清洗。對于長度為大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針來說，于比Tm計算值低大約5℃至10℃的溫度將載體材料用6XSCC加0.1％SDS清洗1次15分鐘，然后用6XSSC清洗兩次，每次15分鐘。在第三個方面，本發(fā)明涉及包含SEQIDNO2或其同源序列或其成熟多肽的一個或多個氨基酸的保守取代、刪除、和/或插入的人工變體。優(yōu)選的是，氨基酸改變的性質較小，也就是說不會明顯影響蛋白質折疊和/或活性的保守氨基酸替代；一般是1個至大約30個氨基酸的小段刪除；小段氨基或羧基末端延伸，諸如氨基末端的甲硫氨酸殘基；可達大約20-25個殘基的小段接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能而易于純化的小段延伸，諸如多組氨酸序列段、抗原性表位、或結合域。保守取代的例子在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)各組內。通常不改變特異活性的氨基酸替代是本領域已知的，例如H.Neurath和R.L.Hill在《TheProteins》中所述(1979，AcademicPress，NewYork)。最常發(fā)生的替代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。除20種標準氨基酸之外，也可用非標準氨基酸(諸如4-羥基脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸、和α-甲基絲氨酸)來替代野生型多肽的氨基酸殘基?？捎糜邢迶?shù)目的非保守氨基酸、并非由遺傳密碼編碼的氨基酸、和非天然氨基酸來替代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|合成后受到修飾，和/或在它們的側鏈上具有與標準氨基酸不同的化學結構?？苫瘜W合成非天然氨基酸，優(yōu)選的是可通過商業(yè)途徑購買，包括哌啶酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3，3-二甲基脯氨酸?；蛘?，氨基酸改變的本質是改變多肽的物理化學特性。例如，氨基酸改變可提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最佳pH等等?？筛鶕?jù)本領域已知程序來確定親本多肽中的關鍵氨基酸，諸如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(alanine-scanningmutagenesis)(Cunningham和Wells，1989，Science2441081-1085)。在后一種技術中，在分子中的每個殘基處引入單一的丙氨酸突變，并對得到的突變分子測試生物學活性(即增強分解纖維素活性)以鑒定對分子活性至關重要的氨基酸殘基。也可參見Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.2714699-4708。也可結合假定接觸位點氨基酸的突變，通過諸如核磁共振、結晶學、電子衍射、或光親和標記等技術的測定，對結構進行物理學分析，從而確定酶的活性位點或其他生物學相互作用。例如參見deVos等人，1992，Science255306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.224899-904；Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBSLett.30959-64。也可從與本發(fā)明多肽相關的多肽的同一性分析來推斷關鍵氨基酸的身份?？捎靡阎恼T變、重組、和/或改組(shuffing)方法來進行單一或多個氨基酸替代并檢測，隨后進行相關篩選程序，諸如Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science24153-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA862152-2156；WO95/17413；或WO95/22625所公開的。可使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如Lowman等人，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利號5,223,409；WO92/06204)、和定區(qū)誘變(region-directedmutagenesis)(Derbyshire等人，1986，Gene46145；Ner等人，1988，DNA7127)?？蓪⒄T變/改組方法與高通量、自動篩選方法相結合，用于檢測由宿主細胞表達的克隆的、經(jīng)誘變的多肽的活性(Ness等人，1999，NatureBiotechnology17893-896)?？墒褂帽绢I域的標準方法從宿主細胞回收編碼活性多肽的經(jīng)誘變DNA分子并快速測序。這些方法可快速測定目的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并可應用于結構未知的多肽。SEQIDNO2第23至250位氨基酸中氨基酸替代、缺失、和/或插入的總數(shù)為10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、甚至更優(yōu)選3、最優(yōu)選2、且甚至最優(yōu)選1。具有增強分解纖維素活性的多肽的來源可從任何屬的微生物中獲得本發(fā)明的多肽。對本發(fā)明來說，術語“從...獲得”在本文與指定的來源聯(lián)用時，應當意指由核苷酸序列編碼的多肽是由該來源產生的，或是來自于該來源的核苷酸序列已經(jīng)插入其中的菌株產生的。在一個優(yōu)選的方面，從指定來源獲得的多肽分泌到細胞外。本發(fā)明的多肽可以是細菌多肽。例如，多肽可以是革蘭氏陽性細菌的多肽，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)的多肽，例如嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculana)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagukans)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的多肽；或鏈霉菌屬(Streptomyces)的多肽，例如淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomycesmurinus)的多肽；或革蘭氏陰性細菌的多肽，例如大腸桿菌(E.coli)或假單胞菌(Pseudomonassp.)的多肽。本發(fā)明的多肽還可以是真菌多肽，且更優(yōu)選酵母多肽，諸如假絲酵母屬(Candida)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia屬的多肽；或更優(yōu)選絲狀真菌的多肽，諸如Acremonium屬、曲霉屬(Aspergilus)、短柄霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptocoecus)、Filibasidium屬、鐮孢屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、Magnaporthe屬、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix屬、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces屬、裂褶菌屬(Schizophyllum)、Talaromyces屬、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium屬、或木霉屬(Trichoderma)的多肽。在一個優(yōu)選的方面，多肽是卡爾斯伯糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道拉斯糖酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗糖酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地糖酵母(Saccharomycesnorbensis)、或卵形糖酵母(Saccharomycesoviformis)的具有增強分解纖維素活性的多肽。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergilllusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、棉色二孢(Diplodiagossyppina)、桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、谷孢鐮孢(Fusariumcereals)、Fusariumcrookwellense、黃色鐮孢(Fusariumculmorum)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusariumgraminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporium)、合歡木鐮孢(Fusariumnegundi)、尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)、網(wǎng)狀鐮孢(Fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(Fusariumsarcochroum)、擬枝孢鐮孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusariumsulphureum)、近念珠狀鐮孢(Fusariumtorulosum)、單端孢鐮孢(Fusariumtrichothecioides)、有毒鐮孢(Fusariumvenenatum)、Humicolainsolens、Humicolalanuginosa、Magnaporthegrisea、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、產紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Phanerochaetechrysosporium、淡黑假黑盤菌(Pseudoplectanianigrella)、橙色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、瑞氏木霉(Trichodermareesei)、綠色木霉(Trichodermaviride)、或Trichophaeasaccata的多肽。在一個更優(yōu)選的方面，多肽是橙色嗜熱子囊菌的多肽，例如具有氨基酸序列SEQIDNO2的多肽。應當理解，對于上述物種，不管已知的種名是什么，本發(fā)明既包括完全階段(perfectstate)和不完全階段(imperfectstate)，還包括其它分類學等價物，例如無性型。本領域技術人員能容易的識別適當?shù)葍r物的身份。這些物種的菌株可容易的在許多培養(yǎng)物保藏機構為公眾所得到，諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)、德國微生物和培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSM)、荷蘭培養(yǎng)物保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)、和美國農業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物保藏中心北部研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollectionNorthernRegionalResearchCenter，NRRL)。此外，利用上述探針可從其它來源，包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等)分離的微生物中鑒定和獲得這些多肽。從自然生境中分離微生物的技術在本領域技術是眾所周知的。然后可通過類似的篩選這樣一種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得多核苷酸。一旦用探針檢測出編碼多肽的多核苷酸序列，就可通過本領域普通技術人員所熟知的技術(例如參見Sambrook等人，1989，同上)分離或克隆此多核苷酸。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。可通過將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)融合來產生融合的多肽。用于產生融合多肽的技術在本領域是已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列使得它們處于同一讀碼框中且融合多肽的表達受相同啟動子和終止子的控制。多核苷酸本發(fā)明還涉及具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列為SEQIDNO1所示。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列是質粒pDZA2-7中所含的序列，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。在另一個優(yōu)選的方面，核苷酸序列是SEQIDNO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個更優(yōu)選的方面，核苷酸序列是質粒pDZA2-7中所含的成熟多肽編碼區(qū)，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。本發(fā)明還涵蓋編碼具有氨基酸序列SEQIDNO2的多肽或其成熟多肽的核苷酸序列，它與SEQIDNO1因遺傳密碼的簡并性而不同。本發(fā)明還涉及編碼具有增強分解纖維素活性的SEQIDNO2之片段的SEQIDNO1之子序列。本發(fā)明還涉及在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一處突變的突變多核苷酸，其中突變核苷酸序列編碼由SEQIDNO2第23至250位氨基酸組成的多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術在本領域是已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或者兩者的組合。例如，通過利用眾所周知的聚合酶鏈式反應(PCR)或用抗體篩選表達文庫以檢測出具有共同結構特征的克隆DNA片段，可以實現(xiàn)從這些基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸序列。例如參見Innis等人，1990，《PCRAGuidetoMethodsandApplication》，AcademicPress，NewYork。還可以使用其它核酸擴增程序，諸如連接酶鏈式反應(LCR)、連接激活轉錄(LAT)、和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)?？蓮乃箧邭倬昊蛘吡硗獾幕蛳嚓P的生物體克隆多核苷酸，因此它可以是例如核苷酸序列中多肽編碼區(qū)的等位或種間變體。本發(fā)明還涉及具有如下核苷酸序列的編碼活性多肽的多核苷酸，該核苷酸序列與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列(即第67至805位核苷酸)具有至少70％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％、且甚至最優(yōu)選至少97％、98％或99％的同一性程度。為了合成與本發(fā)明多肽基本上類似的多肽，可能必需修飾編碼多肽的核苷酸序列。術語與多肽“基本上類似”是指多肽的非天然存在形式。這些多肽可能因某些改造而區(qū)別于從其天然來源分離的多肽，例如在比活、熱穩(wěn)定性、最佳pH等方面不同的人工變體?？梢栽赟EQIDNO1多肽編碼區(qū)所呈現(xiàn)的核苷酸序列基礎上構建變體序列，例如其子序列，和/或通過引入不會導致由核苷酸序列編碼的多肽具有另一種氨基酸序列、而是使之符合意圖用來生產酶的宿主生物體的密碼子使用率的核苷酸替代，或通過引入可導致不同氨基酸序列的核苷酸替代。對于核苷酸替代的一般說明可參見例如Ford等人，1991，ProteinExpressionandPurification295-107。對本領域技術人員而言，顯而易見的是這些種替代可在分子功能的關鍵區(qū)域之外進行并且仍然可得到活性多肽?？筛鶕?jù)本領域的已知程序來鑒別對于由本發(fā)明的分離多核苷酸所編碼的多肽的活性來說至關重要的因此優(yōu)選不進行替代的氨基酸殘基，諸如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(例如參見Cunningham和Wells，1989，Science2441081-1085)。在后一種技術中，在分子中每一帶正電荷殘基處引入突變，然后對得到的突變分子測試增強分解纖維素活性以鑒定對分子活性至關重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可通過三維結構分析來確定，其中三維結構可由諸如核磁共振分析、晶體學、或光親和標記等技術來測定(例如參見deVos等人，1992，Science255306-312；Smith等人，1992，JournalofMolecularBiology224899-904；Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBSLetters30959-64)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離多核苷酸，它在很低嚴緊條件、優(yōu)選低嚴緊條件、更優(yōu)選中等嚴緊條件、更優(yōu)選中等-高嚴緊條件、甚至更優(yōu)選高嚴緊度條件、且最優(yōu)選很高嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈；或其等位變體和子序列發(fā)生雜交(Sambrook等人，1989，同上)，正如本文所定義的。本發(fā)明還涉及通過如下獲得的編碼具有增強分解纖維素活性的多肽的分離多核苷酸，即(a)在很低、低、中等、中等-高、高、或很高嚴緊條件下將DNA群體與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈進行雜交；并(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸。在一個優(yōu)選的方面，DNA群體在低嚴緊條件下進行雜交。在一個更優(yōu)選的方面，DNA群體是在中等嚴緊條件下進行雜交。在一個甚至更優(yōu)選的方面，DNA群體在中等-高嚴緊條件下進行雜交。在一個最優(yōu)選的方面，DNA群體在高嚴緊條件下進行雜交。核酸構建體本發(fā)明還涉及包含與一種或多種控制序列可操作連接的本發(fā)明的分離多核苷酸的核酸構建體，所述控制序列在適當宿主細胞中在與控制序列相容的條件下指導編碼序列的表達?？衫枚喾N方法操作編碼本發(fā)明多肽的分離多核苷酸以提供多肽的表達。根據(jù)表達載體的不同，可能希望或必需在將多核苷酸序列插入載體之前對其進行操作。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是為本領域眾所周知的?？刂菩蛄锌梢允沁m當?shù)膯幼有蛄?，即受到宿主細胞識別來表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。啟動子序列包含調節(jié)多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選宿主細胞中表現(xiàn)出轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的、和雜合的啟動子，而且可從編碼與宿主細胞同源或異源的細胞外或細胞內多肽的基因中獲得。用于指導本發(fā)明核酸構建體轉錄的適當啟動子的實例，尤其是在細菌宿主細胞中，是從大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、和原核生物的β-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA753727-3731)中獲得的啟動子，以及tac啟動子(DeBoer等人，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA8021-25)。還有“Usefulproteinsfromrecombinantbacteria”，ScientificAmerican，1980，24274-94及Sambrook等人，1989，同上中描述的其它啟動子。用于在絲狀真菌宿主細胞中指導本發(fā)明核酸構建體轉錄的適當啟動子的實例是從米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶、有毒鐮孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、有毒鐮孢Daria(WO00/56900)、有毒鐮孢Quinn(WO00/56900)、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、瑞氏木霉β-葡糖苷酶、瑞氏木霉纖維二糖水解酶I、瑞氏木霉纖維二糖水解酶II、瑞氏木霉內切葡聚糖酶I、瑞氏木霉內切葡聚糖酶II、瑞氏木霉內切葡聚糖酶III、瑞氏木霉內切葡聚糖酶IV、瑞氏木霉內切葡聚糖酶V、瑞氏木霉木聚糖酶I、瑞氏木霉木聚糖酶II、瑞氏木霉β-木糖苷酶基因中獲得的啟動子，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構酶基因的雜合啟動子)；及其突變的、截短的、和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子是從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)、和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因中所獲得的。還有Romanos等人，1992，Yeast8423-488中描述了用于酵母宿主細胞的其它有用啟動子?？刂菩蛄幸部梢允沁m當?shù)霓D錄終止子序列，即由宿主細胞識別來終止轉錄的序列。終止子序列可操作連接于編碼多肽的核苷酸序列的3′端。在所選擇的宿主細胞中起作用的任何終止子都可用于本發(fā)明。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸(anthranilate)合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因中獲得的。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子是從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)、和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因中獲得的。還有Romanos等人，1992，同上中描述的用于酵母宿主細胞的其它有用終止子。控制序列還可以是適當?shù)那皩蛄?，即對宿主細胞翻譯很重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作連接于編碼多肽的核苷酸序列的5′端。在所選擇的宿主細胞中起作用的任何前導序列都可用于本發(fā)明。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列是從米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉磷酸丙糖異構酶基因中獲得的。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的前導序列是從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子、和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因中獲得的?？刂菩蛄羞€可以是聚腺苷酸化序列，即可操作連接于核苷酸序列3′端的序列，當轉錄時可由宿主細胞識別為將聚腺苷殘基添加到轉錄的mRNA上的信號。在所選擇的宿主細胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本發(fā)明。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因獲得的。Guo和Sherman等人，1995，MolecularCellularBiology155983-5990中描述了對酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列?？刂菩蛄羞€可以是信號肽編碼區(qū)，它編碼的氨基酸序列連接于多肽的氨基末端并指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5′端可固有的包含信號肽編碼區(qū)，它在翻譯讀碼框中與編碼分泌多肽的編碼區(qū)段天然連接?；蛘撸幋a序列的5′端可以包含對編碼序列是外來的信號肽編碼區(qū)。如果編碼序列天然不含信號肽編碼區(qū)，則可能需要外來的信號肽編碼區(qū)?；蛘?，外來的信號肽編碼區(qū)可簡單的替換天然信號肽編碼區(qū)以便增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選擇宿主細胞分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。用于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從芽孢桿菌NCIB11837的生麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌的β-內酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的中性蛋白酶類(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌的prsA基因獲得的信號肽編碼區(qū)。還有Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137中描述的其它信號肽。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicolainsolens纖維素酶、Humicolainsolens內切葡聚糖酶V、和Humicolalanuginosa脂肪酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)。在一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)是編碼SEQIDNO2第1至22位氨基酸的SEQIDNO1第1至66位核苷酸。對于酵母宿主細胞有用的信號肽是從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得的。還有Romanos等人，1992，同上中描述了的其它有用的信號肽編碼區(qū)。控制序列還可以是前肽(propeptide)編碼區(qū)，它編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide)(或有時候稱作酶原(zymogen))。多肽原一般是沒有活性的，且可通過前肽的催化或自催化切割從多肽原轉變成成熟有活性的多肽。前肽編碼區(qū)可從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜熱毀絲霉漆酶(WO95/33836)的基因獲得。當信號肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端時，前肽區(qū)位于靠近多肽氨基末端的位置，而信號肽區(qū)位于靠近前肽區(qū)的氨基末端位置。還可能需要加上調節(jié)序列以使多肽的表達可以相對于宿主細胞的生長進行調節(jié)。調節(jié)系統(tǒng)的實例是能響應化學或物理刺激(包括調節(jié)化合物的存在)而引起基因表達的開啟或關閉的那些。在原核系統(tǒng)中，調節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調節(jié)序列。調節(jié)序列的其它實例是允許基因擴增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些包括在氨甲喋呤存在時擴增的二氫葉酸還原酶基因，以及有重金屬存在時擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的核苷酸序列將與調節(jié)序列可操作連接。表達載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子、及轉錄和翻譯終止信號的重組表達載體。可以將本文所述的各種核酸和控制序列連接起來以產生重組表達載體，此重組表達載體可包括一個或多個便利的限制性位點使得在這些位點可插入或替換編碼多肽的核苷酸序列。或者，本發(fā)明的核苷酸序列可通過將核苷酸序列或含有序列的核酸構建體插入適當?shù)谋磉_載體進行表達。構建表達載體時，將編碼序列置于載體中以使編碼序列與適當?shù)谋磉_控制序列可操作連接。重組表達載體可以是可方便的接受重組DNA操作并能引起核苷酸序列表達的任何載體(例如質?；虿《?。載體的選擇一般取決于載體與引入此載體的宿主細胞之間的相容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的質粒。載體可以是自主復制載體，即載體可以染色體外實體的形式存在，其復制獨立于染色體的復制，例如質粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可包含任何用于確保自我復制的手段。或者，載體可以是這樣的一種載體，它在導入宿主細胞后，整合到基因組中并與整合的染色體一起復制。此外，可使用單一載體或質粒，或是一起含有待引入宿主細胞基因組的全部DNA的兩種或多種載體或質粒，或者轉座子。本發(fā)明載體優(yōu)選包含一種或多種選擇標記，所述選擇標記允許易于選擇轉化的、轉染的、轉導的等細胞。選擇標記是一種基因，其產物有助于產生抗微生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型變成原養(yǎng)型等等。細菌選擇標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗性諸如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標記。適于酵母宿主細胞的標記有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。在絲狀宿主細胞中使用的選擇標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D移酶)、bar(膦絲菌素乙酰基轉移酶)、hph(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉移酶(sulfateadenyltransferase))、和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)及其等價物。優(yōu)選用于曲霉屬細胞的是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細胞基因組中或者允許載體在細胞中不依賴于基因組自主復制的元件。對整合到宿主細胞基因組來說，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸序列或任何其它載體元件通過同源或非同源重組整合到基因組中?；蛘?，載體可包含附加的核苷酸序列用于指導通過同源重組在染色體精確位置整合進入宿主細胞基因組中。為了提高在精確位置整合的可能性，整合元件應優(yōu)選包含足夠數(shù)目的與對應靶序列具有高度同一性的核酸，諸如100-10,000個堿基對、優(yōu)選400-10,000個堿基對、且最優(yōu)選800-10,000個堿基對，從而提高同源重組的幾率。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核苷酸序列。另一方面，載體可通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。對自主復制來說，載體還可包含能使載體在所討論的宿主細胞中自主復制的復制起點。復制起點可以是在細胞中起作用的調節(jié)自主復制的任何質粒復制因子。術語“復制起點”或“質粒復制子”在本文中定義為能使質?；蜉d體在體內復制的核苷酸序列。細菌復制起點的實例是使得在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，以及使得在芽孢桿菌中復制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復制起點。用于酵母宿主細胞的復制起點的實例是2μm復制起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合、及ARS4和CEN6的組合?？捎糜诮z狀真菌細胞的復制起點的實例有AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene9861-67；Cullen等人，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分離和包含該基因的質粒或載體的構建可根據(jù)WO00/24883中所公開的方法來完成。可將本發(fā)明多核苷酸一個以上的拷貝插入宿主細胞中以提高基因產物的產量。提高多核苷酸拷貝數(shù)可通過將序列的至少一個附加拷貝整合進宿主細胞基因組中或通過將可擴增的選擇標記基因加入多核苷酸來獲得，在其中包含選擇標記基因的擴增拷貝的細胞，以及因此多核苷酸的附加拷貝可在存在適當?shù)倪x擇劑時通過培養(yǎng)此細胞選擇得出。用于連接上述元件以構建本發(fā)明重組表達載體的方法是本領域技術人員所熟知的(例如參見Sambrook等人，1989，同上)。宿主細胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的重組宿主細胞，它們可有利的用于多肽的重組生產。如前所述，可將包含本發(fā)明多核苷酸的載體引入宿主細胞以使載體保持為染色體的整合體或作為自主復制的染色體外載體。術語“宿主細胞”包括所有那些由于在復制期間出現(xiàn)的突變而不同于親本細胞的親本細胞的后代。宿主細胞的選擇在很大程度上依賴于編碼多肽的基因和它的來源。宿主細胞可以是單細胞微生物，例如原核生物，或非單細胞微生物，例如真核生物。有用的單細胞微生物是細菌細胞，諸如革蘭氏陽性細菌，包括但不限于芽孢桿菌屬細胞，例如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillusclausii、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬細胞，例如淺青紫鏈霉菌和鼠灰鏈霉菌，或者革蘭氏陰性細菌，諸如大腸桿菌和假單胞菌。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、或枯草桿菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬細胞是嗜堿的芽孢桿菌。將載體導入細菌宿主細胞可通過例如原生質體轉化(參見例如Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168111-115)、利用感受態(tài)細胞(參見例如Young和Spizizen，1961，JournalalofBacteriology81823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56209-221)、電穿孔(參見例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques6742-751)、或接合(參見例如Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology1695771-5278)來實現(xiàn)。宿主細胞還可以是真核細胞，諸如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞?！罢婢痹谟糜诒疚臅r包括子囊菌門(Acomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等人，在《AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi》，第八版，1995，CABInternational，UniversityPress，Cambridge，UK中所定義的)，以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995，同上第171頁中所引用的)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同上)。在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞?！敖湍浮痹谟糜诒疚臅r包括產子囊酵母(內孢霉目Endomycetales)、產擔孢子酵母、和屬于不完全真菌的酵母(芽生菌綱Blastomycetes)。由于酵母的分類今后還會變化，對于本發(fā)明來說，酵母應該是如在《BiologyandActivitiesofYeast》(Skinner，F(xiàn).A.、Passmore，S.M.和Davenport，R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所定義的。在一個更優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、或Yarrowia屬細胞。在一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾斯伯糖酵母、釀酒酵母、糖化糖酵母、道拉斯糖酵母、克魯弗糖酵母、諾第糖酵母、或卵形糖酵母細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是Yarrowialipolytica細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門亞門的所有絲狀體(如Hawksworth等人，1995，同上中所定義的)。絲狀真菌通常是以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、及其他復合多糖組成的菌絲壁為特征。營養(yǎng)生長表現(xiàn)為菌絲伸長，碳代謝是專性需氧的。相反，酵母諸如釀酒酵母的營養(yǎng)生長表現(xiàn)為單細胞菌體的出芽而碳代謝可以是發(fā)酵性的。在一個甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是Acremonium屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管菌屬(Bjerkandera)、Ceriporiopsis屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球酵母屬、Filibasidium屬、鐮孢屬、腐質霉屬、Magnaporthe屬、毛霉屬、毀絲霉屬、Neocallimastix屬、脈孢霉菌、擬青霉屬、青霉屬、Phanerochaete屬、射脈菌屬(Phlebia)、Piromyces屬、側耳菌屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、Talaromyces屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬、栓菌屬(Trametes)、或木霉屬的細胞。在一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、谷孢鐮孢、Fusariumcrookwellense、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、網(wǎng)狀鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬枝孢鐮孢、硫色鐮孢、近念珠狀鐮孢、單端孢鐮孢、或有毒鐮孢細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、Ceriporiopsisaneirina、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、Ceriporiopsissubvermispora、灰色鬼傘、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、Humicolainsolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產紫青霉、Phanerochaetechrysosporium、輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、Pleurotuseryngii、Thielaviaterrestris、Trametesvillosa、Trametesversicolor、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、瑞氏木霉、或綠色木霉細胞。真菌細胞可以本身已知的方式通過涉及原生質體形成、原生質體轉化、和細胞壁再生的過程進行轉化。EP238023和Yelton等人，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述了適合曲霉屬和木霉屬宿主細胞轉化的過程。Malardier等人，1989，Gene78147-159和WO96/00787中描述了適合轉化鐮孢屬物種的方法。可利用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.編的《GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology》，MethodsinEnzymology，Vol.194，pp182-187，AcademicPress公司，NewYork；Ito等人，1983，JournalofBacteriology153163；及Hinnen等人，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA751920中所描述的程序轉化酵母。生產方法本發(fā)明還涉及生產本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產生所述多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞能夠在其野生型產生多肽；并(b)回收所述多肽。優(yōu)選的是，所述細胞是嗜熱子囊菌屬細胞，更優(yōu)選的是橙色嗜熱子囊菌。本發(fā)明還涉及生產本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞；并(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及生產本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含如下突變核苷酸序列的宿主細胞，所述突變核苷酸序列在SEQIDNO1的成熟多肽編碼區(qū)中具有至少一處突變，其中突變核苷酸序列編碼由SEQIDNO2第23至250位氨基酸組成的多肽，并(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的生產方法中，利用本領域眾所周知的方法在適于產生所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，細胞培養(yǎng)可在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中在適當?shù)呐囵B(yǎng)基和可使所述多肽表達和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、分批的、補料-分批、或固態(tài)發(fā)酵)來進行。培養(yǎng)可通過本領域已知的程序在含有碳和氮源以及無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行。適宜的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應商獲得，或者可根據(jù)已公布的配方來制備(例如參見美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。如果多肽分泌到培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，那么可從細胞裂解物中進行回收?？衫帽疚拿枋龅姆椒▉頇z測具有增強分解纖維素活性的多肽。所得多肽可通過本領域已知的方法回收。例如，多肽可通過常規(guī)流程從培養(yǎng)基中回收，包括但不限于離心、過濾、萃取、噴射-干燥、蒸發(fā)、或沉淀。本發(fā)明的多肽可通過本領域已知的多種程序純化，包括但不限于層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦、和大小排阻)、電泳(例如制備性等電聚焦)、差異溶解(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(例如參見《ProteinPurification》，J.-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers，NewYork，1989)，以獲得基本上純的多肽。植物本發(fā)明還涉及經(jīng)編碼本發(fā)明具有增強分解纖維素活性的多肽的核苷酸序列轉化而以可回收量表達和產生多肽的轉基因植物、植株部分、或植物細胞。所述多肽可從植物或植株部分回收?；蛘?，將含有重組多肽的植物或植株部分就此用于改善食物或飼料的質量，例如提高營養(yǎng)價值、可口性和流變性、或破壞抗營養(yǎng)因子。轉基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例有草(grasses)，例如草地草(藍草，早熟禾屬(Poa))；草料草，諸如羊矛屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；溫帶草，例如剪股穎屬(Agrostis)；和谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。雙子葉植物的實例有煙草，豆科作物諸如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、菜豆、和大豆，和十字花科植物(十字花科Brassicaceae)，諸如花椰菜、油菜籽、和親緣很近的模式生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植株部分的實例有莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、和塊莖，以及構成這些部分的單獨組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、脈管組織、分生組織。特殊的植物細胞小室，諸如葉綠體、質外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體、和細胞質也認為是植株部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，也認為是植株部分。類似的，植株部分，諸如有利于本發(fā)明應用的特定的分離組織和細胞也認為是植株部分，例如胚、胚乳、糊粉、和種皮。這些植物、植株部分、和植物細胞的后代也包括在本發(fā)明范圍之內。表達本發(fā)明多肽的轉基因植物或植物細胞的構建可根據(jù)本領域已知的方法進行。簡而言之，植物或植物細胞的構建可通過將一種或多種編碼本發(fā)明多肽的表達構建體摻入植物宿主基因組中并將所得的經(jīng)修飾植物或植物細胞繁殖成轉基因植物或植物細胞來進行。表達構建體方便的是核酸構建體，它含有編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸且該多核苷酸可操作連接在所選定的植物或植株部分中表達此核苷酸序列所需的適當調控序列。而且，表達構建體可包含用于鑒定整合了此表達構建體的宿主細胞的選擇標記，和將此構建體導入所討論的植物所需要的DNA序列(后者取決于所用導入DNA的方法)。例如，根據(jù)希望在何時、在何處、和怎樣表達多肽來選擇調控序列，諸如啟動子和終止子序列和任選的信號或轉運序列。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成性的或可誘導的，或者是發(fā)育、階段、或組織特異的，基因產物可以是靶向特定組織或植株部分諸如種子或葉。調控序列有例如Tague等人，1988，PlantPhysiology86506所述。對于組成性表達，可使用35S-CaMV、玉蜀黍泛蛋白1、和水稻肌動白1啟動子(Franck等人，1980，Cell21285-294；Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18675-689；Zhang等人，1991，PlantCell31155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissues)諸如種子、馬鈴薯塊莖、和果實(Edwards和Coruzzi，1990，AnnRevGenet24275-303)，或來自于代謝庫(metabolicsinktissues)組織諸如分生組織(Ito等人，1994，PlantMolBiol24863-878)，種子特異性啟動子諸如來自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或清蛋白啟動子(Wu等人，1998，PlantandCellPhysiology39885-889)，來自蠶豆(Viciafaba)豆球蛋白B4和未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等人，1998，JournalofPlantPhysiology152708-711)，來自種子油體(seedoilbody)蛋白的啟動子(Chen等人，1998，PlantandCellPhysiology39935-941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或者本領域已知的任何其它種子特異啟動子，例如WO91/14772中所述。此外，啟動子可以是葉特異性啟動子，諸如來自水稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等人，1993，PlantPhysiology102991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology2685-93)，或來自水稻的aldP基因啟動子(Kagaya等人，1995，MolecularandGeneralGenetics248668-674)，或者傷口誘導性啟動子諸如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等人，1993，PlantMolecularBiology22573-588)。同樣，啟動子可通過非生物處理例如溫度、干旱、或鹽度變化來誘導，或通過外源施加能激活啟動子的物質，例如乙醇、雌激素、植物激素諸如乙烯、脫落酸和赤霉酸以及重金屬來誘導。還可使用啟動子增強子元件，從而在植物中獲得本發(fā)明多肽的更高表達。例如，啟動子增強子元件可以是位于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內含子。例如Xu等人，1993，同上中公開了利用水稻肌動蛋白1基因的第一個內含子來增強表達。選擇標記基因和表達構建體的任何其它部分可選自本領域可利用的那些范圍?？筛鶕?jù)本領域已知的常規(guī)技術將核酸構建體摻入植物基因組中，包括土壤桿菌介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、生物射彈轉化(biolistictransformation)、和電穿孔(Gasser等人，1990，Science2441293；Potrykus，1990，Bio/Technology8535；Shimamoto等人，1989，Nature338274)。目前，根瘤農桿菌(Agrobacterium.tumefaciens)介導的基因轉移是用于產生轉基因雙子葉植物的首選方法(其綜述可參見Hooykas和Schilperoort，1992，PlantMolecularBiology1915-38)，而且也可用于轉化單子葉植物，盡管這些植物常使用其它轉化方法。目前，選擇用于產生轉基因單子葉植物的方法是粒子轟擊(以轉化用DNA包被的金或鎢微粒)胚的愈傷組織或發(fā)育中的胚(Christou，1992，PlantJournal2275-281；Shimamoto，1994，CurrentOpinionBiotechnology5158-162；Vasil等人，1992，Bio/Technology10667-674)。如Omirulleh等人，1993，PlantMolecularBiology21415-428中所描述的，單子葉植物轉化的替代方法是基于原生質體轉化來進行的。在轉化后，根據(jù)本領域熟知的方法選出已摻入了表達構建體的轉化體，并使其再生成為完整植株。通常轉化程序設計成在再生期間或在后代中選擇性清除選擇基因，例如通過兩種不同T-DNA構建體的共轉化或通過特異重組酶進行的選擇基因的位點特異切除來進行。本發(fā)明還涉及生產本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產生所述多肽的條件下，培養(yǎng)含有如下多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有增強分解纖維素活性的多肽；并(b)回收所述多肽。增強分解纖維素活性的消除或降低本發(fā)明還涉及生產親本細胞突變體的方法，包括破壞或刪除編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列或其部分，這導致突變體細胞產生的多肽比在相同條件下培養(yǎng)的親本細胞少。可使用本
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眾所周知的方法通過降低或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達來構建突變體細胞，例如使用插入、破壞、替換、或刪除。在一個優(yōu)選的方面，將核苷酸序列失活。例如，要修飾或失活的核苷酸序列可以是編碼區(qū)或對或其活性必需的部分，或編碼區(qū)表達所需要的調控元件。這種調控或控制序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即足以影響核苷酸序列表達的部分?？尚揎椀钠渌刂菩蛄邪ǖ幌抻谇皩蛄小⒕巯佘账峄蛄?、前肽序列、信號肽序列、轉錄終止子、和轉錄激活因子。核苷酸序列的修飾或失活可通過將親本細胞誘變，并選擇所述核苷酸序列的表達降低或消除的突變細胞來進行。所述誘變可以是特異的或隨機的，例如通過使用適宜的物理或化學誘變劑、通過使用適宜的寡核苷酸、或通過對DNA序列PCR產生誘變來進行。此外，誘變可通過使用這些誘變劑的任意組合來進行。適于本發(fā)明目的的物理或化學的誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸、和核苷酸類似物。在使用這些試劑時，誘變一般是這樣進行的在適宜條件下，在存在所選的誘變處理試劑下保溫用于誘變的親本細胞，并篩選和/或選擇展示基因表達降低或不表達的突變細胞來。核苷酸序列的修飾或失活可通過在基因中或在其轉錄或翻譯所需要的調控元件中引入、替換、或消除一個或多個核苷酸來進行。例如，可插入或消除核苷酸從而形成終止密碼子的引入、起始密碼子的消除、或開放讀碼框的改變。這些修飾或滅活可根據(jù)本領域已知的方法通過定點誘變或PCR產生誘變來完成。雖然，原則上，修飾可在體內進行，即直接在表達要修飾的核苷酸序列的細胞上進行，優(yōu)選的是如下面實例中所示在體外進行修飾。適宜的消除或降低細胞核苷酸序列表達的方法的實例是以基因替換、基因刪除、或基因破壞技術為基礎的。例如，在基因破壞方法中，將相當于內源核苷酸序列的核酸在體外進行誘變以產生缺陷的核酸序列，然后將其轉化到親本細胞中以產生缺陷基因。通過同源重組，缺陷的核酸序列替換內源核苷酸序列。所希望的是，缺陷的核苷酸序列還編碼可用于選擇核苷酸序列已經(jīng)修飾或破壞了的轉化體的標記。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，諸如用本文所述選擇標記來破壞核苷酸序列?；蛘撸塑账嵝蛄械男揎椈蚴Щ羁赏ㄟ^已建立的反義或RNAi技術使用與核苷酸序列互補的序列來進行。更具體的說，細胞核苷酸序列的表達可通過引入與基因核苷酸序列互補的序列來降低或消除，其中該引入的序列可在細胞中轉錄并能與細胞中所產生的mRNA發(fā)生雜交。在允許互補的反義核苷酸序列與mRNA發(fā)生雜交的條件下，所翻譯蛋白質的量由此降低或消除。本發(fā)明此外涉及在編碼所述多肽的多核苷酸序列或其控制序列中包含破壞或刪除的親本細胞的突變細胞，這導致突變細胞產生的所述多肽比親本細胞少或不產生多肽。這樣構建的多肽缺陷的突變細胞作為宿主細胞用于天然和/或異源蛋白質的表達特別有用。因此，本發(fā)明還涉及生產天然或異源蛋白質的方法，包括(a)在有助于產生蛋白質的條件下培養(yǎng)突變細胞；并(b)回收所述多肽。術語“異源蛋白質”在本文中定義為對宿主細胞來說不是天然的蛋白質，經(jīng)過修飾改變了天然序列的天然蛋白質，或是經(jīng)過重組DNA技術處理宿主細胞從而使其表達發(fā)生了量變的天然蛋白質。在另一個方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵生成本發(fā)明多肽和目的蛋白質產物二者的細胞來生產本質上沒有增強分解纖維素活性的蛋白質產物的方法，其中在發(fā)酵完成之前、當中、或之后通過往發(fā)酵液中加入有效量的可抑制增強分解纖維素活性的試劑，并從發(fā)酵液中回收目的產物，以及任選進行回收產物的進一步純化。在另一個方面，本發(fā)明涉及通過下列步驟來生產本質上沒有增強分解纖維素活性的蛋白質產物的方法，在允許產物表達的條件下培養(yǎng)細胞，并使所得培養(yǎng)液進行pH和溫度聯(lián)合處理以便顯著地降低增強分解纖維素活性，并從培養(yǎng)液中回收產物?；蛘撸琾H和溫度聯(lián)合處理可在從培養(yǎng)液中回收的酶制備物上進行。任選地，pH和溫度聯(lián)合處理增強可與分解纖維素抑制劑處理結合。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，可能消除至少60％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少85％、仍更優(yōu)選至少95％、且最優(yōu)選至少99％的增強分解纖維素活性。通過使用這種方法可實現(xiàn)完全消除增強分解纖維素活性。pH和溫度聯(lián)合處理優(yōu)選在pH為4-5和溫度為80-90℃進行足夠的一段時間以達到預期的效果?？墒褂帽绢I域已知的方法進行培養(yǎng)和目的產物的純化。本發(fā)明用于生產本質上不含增強分解纖維素的產物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質，諸如酶的生產中特別令人感興趣。例如，酶可選自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶、或植物細胞壁降解酶。這些酶的實例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-或β-葡糖苷酶、鹵代過氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。增強分解纖維素缺陷的細胞還可用于表達具有藥學價值的異源蛋白質，諸如激素、生長因子、受體等等。應理解的是術語“真核多肽”不僅包括天然多肽，還包括經(jīng)過氨基酸替代、刪除或添加的修飾或是用以提高活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等等其它類似修飾的多肽，例如酶。在另一個方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法生產的本質上沒有增強分解纖維素活性的蛋白質產物。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽的組合物。優(yōu)選的是，組合物富集了這類多肽。術語“富集”是指組合物的增強分解纖維素活性已經(jīng)被提高，例如富集因子為至少1.1。所述組合物可包含本發(fā)明的多肽作為主要組分，例如單一組分組合物?；蛘?，組合物還可含有一種或多種酶活性，諸如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵代過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。通過屬于下列屬的微生物可產生附加的酶，例如曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、谷孢鐮孢、Fusariumcrookwellense、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、網(wǎng)狀鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、近念珠狀鐮孢、單端孢鐮孢、或有毒鐮孢；腐質霉屬，優(yōu)選Humicolainsolens或Humicolalanuginosa；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、瑞氏木霉、或綠色木霉?？筛鶕?jù)本領域已知的方法來制備多肽組合物，并且它可以是液體或干燥組合物。例如，多肽組合物可以是顆?；蛭⒘５男问健？梢员绢I域已知的方法穩(wěn)定包含在組合物中的多肽。下文給出了本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途的實施例。本發(fā)明多肽組合物的劑量和使用組合物的其它條件可根據(jù)本領域已知的方法來確定。生物材料降解或轉化為單糖、二糖、和多糖本發(fā)明還涉及降解或轉化纖維素材料的方法，包括在存在有效量的具有增強分解纖維素活性的多肽時，用有效量的分解纖維素的蛋白質處理纖維素材料，其中所述具有增強分解纖維素活性的多肽的存在與不存在所述具有增強分解纖維素活性的多肽時相比增加了纖維素材料的降解。本發(fā)明的多肽和宿主細胞可用于從生物質生產單糖、二糖、和多醣，作為化學或發(fā)酵原料，用于生產乙醇、塑料、或其它產品或中間體。具體而言，通過纖維素或半纖維素的部分或完全溶解，本發(fā)明的多肽和宿主細胞可用于提高加工殘余物(干酒糟、釀酒的酒糟、甘蔗渣等等)的價值。如下所述，在分解纖維素的蛋白質促進纖維素材料加工成葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、和阿拉伯糖的過程中，也產生了它們的聚合物或由其衍生的產物。該多肽可以是含有或不合細胞的粗制發(fā)酵液的形式，或者是半純化或者純化的酶制備物的形式。該增強分解纖維素的蛋白質可以是單組分制備物，例如家族61蛋白質，多組分蛋白質制備物，例如許多家族61蛋白質，或者多組分和單組分蛋白質制備物的組合。增強分解纖維素的蛋白質可在酸性、中性、或堿性pH范圍內提高分解纖維素的蛋白質的活性。或者，本發(fā)明的宿主細胞可在生物材料的發(fā)酵過程中用作該多肽的來源。宿主細胞還可以含有天然的或異源的編碼分解纖維素的蛋白質以及對加工生物材料有用的其它酶的基因。生物材料可包括但不限于木材資源、城市固體廢物、廢紙、農作物、和農作物殘余物(參見例如Wiselogel等人，1995，在《HandbookonBioethanol》中，CharlesE.Wyman編，pp.105-118，Taylor&Francis，WashingtonD.C.；Wyman，1994，BioresourceTechnology503-16；Lynd，1990，AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25695-719；Mosier等人，1999，RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics，在《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》中，T.Scheper主編，Vol.65，pp.23-40，Springer-Verlag，NewYork)。生物質原生(primary)細胞壁中的主要多糖是纖維素，第二豐富的是半纖維素，而第三是果膠。細胞停止生長后產生的次生(secondary)細胞壁也含有多糖，而且它通過與半纖維素共價交聯(lián)的聚合木質素得到強化。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，因此為線狀的β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包含多種化合物，諸如具有多種取代基的復雜分支結構的木聚糖、木糖葡聚糖、阿糖木聚糖、和甘露聚糖。雖然纖維素通常是多形的，但在植物組織中發(fā)現(xiàn)的纖維素主要是以平行葡聚糖鏈的不溶性晶體基質的形式存在。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵結合，這有助于穩(wěn)定細胞壁基質。在本發(fā)明的方法中，分解纖維素的蛋白質可以是參與將纖維素材料加工成葡萄糖或將半纖維素加工成木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖、它們的聚合物、或由其衍生的產物的任何蛋白質，正如下文所述。分解纖維素的蛋白質可以是單組分制備物，例如纖維素酶，多組分制備物，例如下文定義的內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖水解酶、β-葡萄糖苷酶，或多組分和單組分蛋白質制備物的組合。分解纖維素的蛋白質可在酸性、中性或堿性pH范圍內具有活性，即水解纖維素。分解纖維素的蛋白質可以是真菌或細菌來源，可以從已知能夠產生纖維素分解酶的微生物中獲得或分離和純化，例如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質霉屬、鬼傘屬、梭孢殼屬、鐮孢屬、毀絲霉屬、Acremonium屬、頭孢屬(Cephalosporium)、柱頂孢屬(Scytalidium)、青霉屬或曲霉屬的物種(參見例如EP458162)，尤其是那些由選自如下物種的菌株產生的那些Humicolainsolens(重新分類為嗜熱柱頂孢(Scytalidiumthermophilum)，參見例如美國專利號4,435,307)、灰蓋鬼傘、尖孢鐮孢、嗜熱毀絲霉、Meripilusgiganteus、土生梭孢殼(Thielaviaterrestris)、Acremoniumsp.、Acremoniumpersicinum、Acremoniumacremonium、Acremoniumbrachypenium、Acremoniumdichromosporum、Acremoniumobclavatum、Acremoniumpinkertoniae、Acremoniumroseogriseum、Acremoniumincoloratum和Acremoniumfuratum；優(yōu)選來自如下物種HumicolainsolensDSM1800、尖孢鐮孢DSM2672、嗜熱毀絲霉CBS117.65、頭孢RYM-202、Acremoniumsp.CBS478.94、Acremoniumsp.CBS265.95、AcremoniumpersicinumCBS169.65、AcremoniumacremoniumAHU9519、頭孢CBS535.71、AcremoniumbrachypeniumCBS866.73、AcremoniumdichromosporumCBS683.73、AcremoniumobclavatumCBS311.74、AcremoniumpinkertoniaeCBS157.70、AcremoniumroseogriseumCBS134.56、AcremoniumincoloratumCBS146.62和AcremoniumfuratumCBS299.70H。分解纖維素的蛋白質也可由木霉屬(特別是綠色木霉、瑞氏木霉和康寧木霉)、嗜堿性芽孢桿菌(參見例如美國專利號3,844,890和EP458162)和鏈霉菌屬(參見例如EP458162)獲得。還包括化學修飾或蛋白質工程突變體。尤其合適的分解纖維素的蛋白質是堿性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的實例有EP495,257、EP531,372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其它實例有諸如WO94/07998、EP531,315、美國專利號4,435,307、美國專利號5,457,046、美國專利號5,648,263、美國專利號5,686,593、美國專利號5,691,178、美國專利號5,763,254、美國專利號5,776,757、WO89/09259、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些纖維素酶變體。本發(fā)明方法中使用的分解纖維素的蛋白質和增強分解纖維素的蛋白質可通過使用本領域已知的程序將上文所述微生物菌株在含有合適的碳源和氮源和無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行發(fā)酵來生產(參見例如Bennett，J.W.和LaSure，L.編，《MoreGeneManipulationsinFungi》，AcademicPress，CA，1991)。合適的培養(yǎng)基可從供應商處獲得，或者可根據(jù)發(fā)表的組成(例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)來制備。適于生長和生產分解纖維素的蛋白質的溫度范圍和其它條件是本領域已知的(參見例如Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，《BiochemicalEngineeringFundamentals》，McGraw-HillBookCompany，NY，1986)。發(fā)酵可以是培養(yǎng)細胞而導致分解纖維素的蛋白質或增強分解纖維素的蛋白質表達或分離的任何方法。因此，可將發(fā)酵理解為包括搖瓶培養(yǎng)、在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中在合適的培養(yǎng)基中和在允許分解纖維素的蛋白質或增強分解纖維素的蛋白質表達或分離的條件下進行的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料-分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產生的所得分解纖維素的蛋白質或增強分解纖維素的蛋白質可從發(fā)酵培養(yǎng)基中通過常規(guī)程序回收，包括但不限于離心、過濾、噴霧-干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后可通過多種層析，例如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等將回收的蛋白質進一步純化。分解纖維素的蛋白質可水解或水解羧甲基纖維素(CMC)，由此降低保溫混合物的粘度。所得粘度降低可通過振動粘度計(vibrationviscosimeter)(例如來自法國Sofraser的MIVI3000)來測定。依照纖維素酶粘度單位(CEVU)測量的纖維素酶活性的測定通過測量樣品降低羧甲基纖維素(CMC)溶液粘度的能力來定量樣品中存在的催化活性的量。該測定法以適于分解纖維素的蛋白質和底物的溫度和pH進行。對于CelluzymeTM(NovozymesA/S，Bagsv_rd，丹麥)，測定法于40℃在0.1M磷酸鹽pH9.0緩沖液中以CMC作為底物(33.3g/L羧甲基纖維素Hercules7LFD)和大約3.3-4.2CEVU/ml的酶濃度進行30分鐘。相對于公告的酶標準物，諸如CelluzymeTMStandard17-1194(來自NovozymesA/S)，計算CEVU活性。適用于本發(fā)明的分解纖維素的制備物的實例包括例如CELLUCLASTTM(可從NovozymesA/S獲得)和NOVOZYMTM188(可從NovozymesA/S獲得)。包含可使用的纖維素酶的其它商品化制備物包括CELLUZYMETM、CEREFLOTM和ULTRAFLOTM(NovozymesA/S)、LAMINEXTM和SPEZYMETMCP(GenencorInt.)及ROHAMENTTM7069W(R_hmGmbH)。纖維素酶以固體重量的大約0.001％至大約5.0％、更優(yōu)選固體重量的大約0.025％至大約4.0％、和最優(yōu)選固體重量的大約0.005％至大約2.0％的有效量加入。如上所述，用于本發(fā)明方法的分解纖維素的蛋白質或增強分解纖維素的蛋白質可以是單組分制備物，即本質上不含其它分解纖維素組分的組分。該單組分可以是重組組分，即通過克隆編碼該單組分的DNA序列隨后用該DNA序列轉化細胞并在宿主中表達而產生的(參見例如WO91/17243和WO91/17244)。單組分分解纖維素的蛋白質的其它實例包括但不限于JP-07203960-A和WO-9206209中公開的那些。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對于宿主來說是外源的)，但在某些條件下所述宿主也可以是同源宿主(酶對于宿主來說是天然的)。單組分分解纖維素的蛋白質還可以通過從發(fā)酵培養(yǎng)基中純化所述蛋白來制備?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明方法的單組分分解纖維素的蛋白質的實例包括但不限于內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。術語“內切葡聚糖酶”在本文中定義為內切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.No.3.2.1.4)，它催化纖維素、纖維素衍生物(諸如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)和地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷鍵，混合的β-1，3葡聚糖諸如谷類β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖，和含有纖維素組分的其它植物原料中的β-1，4鍵的內水解(endohydrolysis)。對本發(fā)明來說，內切葡聚糖酶活性根據(jù)Ghose，1987，PureandAppl.Chem.59257-268的程序，使用羧甲基纖維素(CMC)水解來測定。外切-1，4-β-D-葡聚糖酶包括纖維二糖水解酶和葡糖水解酶。術語“纖維二糖水解酶”在本文中定義為1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，它催化纖維素、纖維寡糖(cellooligosaccharides)、或含有β-1，4-連接葡萄糖的任何聚合物中的1，4-β-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原性或非還原性末端釋放纖維二糖。對本發(fā)明來說，纖維二糖水解酶活性根據(jù)Lever等人，1972，Anal.Biochem.47273-279和vanTilbeurgh等人，1982，F(xiàn)EBSLetters149152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens，1985，F(xiàn)EBSLetters187283-288描述的程序來測定。在本發(fā)明中，采用Lever等人的方法來評估玉米秸桿中的纖維素水解，而將vanTilbeurgh等人的方法用于測定對熒光二糖衍生物的纖維二糖水解酶活性。術語“葡糖水解酶”在本文中定義為1，4-β-D-葡聚糖葡糖水解酶(E.C.3.2.1.74)，它催化1，4-β-D-葡聚糖中1，4-鍵(O-糖基鍵)的水解，以除去連續(xù)的葡萄糖單元。對本發(fā)明來說，外切葡聚糖酶活性根據(jù)Himmel等人，1986，J.Biol.Chem.26112948-12955描述的方法來測定。術語“β-葡萄糖苷酶”在本文中定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，它催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解并釋放β-D-葡萄糖。對本發(fā)明來說，β-葡萄糖苷酶活性根據(jù)Venturi等人，2002，J.BasicMicrobiol.4255-66描述的基本程序來測定，只是如本文所述采用不同的條件。一個單位的β-葡萄糖苷酶活性定義為于50℃、pH5在100mM檸檬酸鈉、0.01％Tween-20中從作為底物的4mM對硝基苯基-β-D-吡喃型葡萄糖苷每分鐘產生1.0μtmole對硝基苯酚。用本發(fā)明的多肽結合分解纖維素的蛋白質來降解生物質底物的纖維素組分(參見例如Brigham等人，1995，在《HandbookonBioethanol》中，CharlesE.Wyman編，pp.119-141，Taylor&Francis，WashingtonD.C.；Lee，1997，JournalofBiotechnology561-24)。具有增強分解纖維素活性的多肽和分解纖維素的蛋白質的最佳用量取決于幾個因素，包括但不限于分解纖維素的蛋白質組分的混合物、纖維素底物、纖維素底物的濃度、纖維素底物的預處理、溫度、時間、pH、和發(fā)酵生物(例如同時進行糖化和發(fā)酵的酵母)的引入。術語“分解纖維素的蛋白質”(cellulolyticproteins)在本文中定義為在測試條件下證明能夠水解或轉化或降解纖維素的蛋白質或蛋白質混合物。其用量通常是通過普通的測定法諸如BCA(雙辛可寧酸(bicinchoninicacid)，P.K.Smith等人，1985，Anal.Biochem.15076)來測量的，而且優(yōu)選的添加量與水解的生物質的量成比例。在一個優(yōu)選的方面，每g纖維素材料中具有增強分解纖維素活性的多肽的量是每g纖維素材料大約0.01至大約2.0mg、優(yōu)選大約0.025至大約1.5mg、更優(yōu)選大約0.05至大約1.25mg、更優(yōu)選大約0.075至大約1.25mg、更優(yōu)選大約0.1至大約1.25mg、甚至更優(yōu)選大約0.15至大約1.25mg、且最優(yōu)選大約0.25至大約1.0mg。在另一個優(yōu)選的方面，每g纖維素材料中分解纖維素的蛋白質的量是每g纖維素材料大約0.5至大約50mg優(yōu)選大約0.5至大約40mg、更優(yōu)選大約0.5至大約25mg、更優(yōu)選大約0.75至大約20mg、更優(yōu)選大約0.75至大約15mg、甚至更優(yōu)選大約0.5至大約10mg、且最優(yōu)選大約2.5至大約10mg。在一個優(yōu)選的方面，每g分解纖維素的蛋白質中具有增強分解纖維素活性的多肽的量是每g分解纖維素的蛋白質大約0.005至大約1.0g、優(yōu)選大約0.01至大約1.0g、更優(yōu)選大約0.15至大約0.75g、更優(yōu)選大約0.15至大約0.5g、更優(yōu)選大約0.1至大約0.5g、甚至更優(yōu)選大約0.1至大約0.5g、且最優(yōu)選大約0.05至大約0.2g。本發(fā)明的方法可用于將纖維素材料加工成許多有用的有機產品、化學品和燃料。除了乙醇之外，能夠由纖維素生產的一些物品和專用化學品包括木糖、丙酮、乙酸鹽或酯(acetate)、甘氨酸、賴氨酸、有機酸(例如乳酸)、1，3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醛、聚羥基鏈烷酸鹽或酯(polyhydroxyalkanoates)、順，順-粘康酸(cis，cis-muconicacid)、和動物飼料(Lynd，L.R.、Wyman，C.E.和Gemgross，T.U.，1999，BiocommodityEngineering，Biotechnol.Prog.15777-793；Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology，在《HandbookonBioethanolProductionandUtilization》中，Wyman，C.E.編，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212；及Ryu，D.D.Y.和Mandels，M.，1980，Cellulasesbiosynthesisandapplications，Enz.Microb.Technol.291-102)?？赡艿墓采a效益不僅僅是由可發(fā)酵的碳水化合物合成多種有機產品?？蓪⑸飳W加工之后剩余的富含木質素的殘余物轉化為源自木質素的化學品，或用于發(fā)電。根據(jù)本發(fā)明的方法用于加工纖維素材料的常規(guī)方法對于本領域技術人員而言是完全理解的。可使用經(jīng)過配置以依照本發(fā)明運作的任何常規(guī)生物材料加工設備來實施本發(fā)明的方法。這樣的設備可包括分批攪拌反應器(batch-stirredreactor)、帶超濾的連續(xù)流攪拌反應器(continuousflowstirredreactorwithultrafiltration)、連續(xù)活塞流柱反應器(continuousplug-flowcolumnreactor)(Gusakov，A.V和Sinitsyn，A.P.，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess，Enz.Microb.Technol.7346-352)、磨碎反應器(attritionreactor)(Ryu，S.K.和Lee，J.M.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor，Biotechnol.Bioeng.2553-65)或具有由電磁場誘導的強攪拌的反應器(Gusakov，A.V.、Sinitsyn，A.P.、Davydkin，I.Y.、Davydkin，V.Y.、Protas，O.V.，1996，Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield，Appl.Biochem.Biotechnol.56141-153)。所述常規(guī)方法包括但不限于糖化、發(fā)酵、單獨水解和發(fā)酵(SHF)、同時糖化和發(fā)酵(SSF)、同時糖化和共發(fā)酵(SSCF)、雜合水解和發(fā)酵(hybridhydrolysisandfermentation，HHF)、及直接微生物轉化(DMC)。SHF使用單獨的加工步驟，首先用酶將纖維素水解成葡萄糖，然后將葡萄糖發(fā)酵成乙醇。在SSF中，將纖維素的酶促水解和葡萄糖變成乙醇的發(fā)酵組合在一個步驟中(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology，在《HandbookonBioethanolProductionandUtilization》中，Wyman，C.E.編，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan，J.和Himmel，M.，1999，Enzymes，energyandtheenvironmentAstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy’sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol，Biotechnol.Prog.15817-827)。HHF包括在同一反應器中但在不同溫度進行的兩個單獨的步驟，即高溫酶促糖化，后續(xù)在發(fā)酵菌株能耐受的較低溫度進行的SSF。DMC將所有三種過程(纖維素酶生成、纖維素水解和發(fā)酵)組合在一個步驟中(Lynd，L.R.、Weimer，P.J.、vanZyl，W.H.和Pretorius，I.S.，2002，MicrobialcelluloseutilizationFundamentalsandbiotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews66506-577)?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法包括但不限于用于生產發(fā)酵產物的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵產物包括醇類(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有機酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富馬酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮類(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；氣體(例如甲烷、氫(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵方法還包括用于食用醇工業(yè)(例如啤酒和葡萄酒)、乳品加工業(yè)(例如發(fā)酵的乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)的發(fā)酵方法。本發(fā)明還涉及生產有機物質的方法，包括(a)在存在有效量的具有增強分解纖維素活性的多肽時，用有效量的分解纖維素的蛋白質將纖維素材料糖化，其中所述具有增強分解纖維素活性的多肽的存在與不存在所述具有增強分解纖維素活性的多肽相比增加了纖維素材料的降解；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物將步驟(a)糖化的纖維素材料發(fā)酵；并(c)從發(fā)酵物中回收有機物質。具有增強分解纖維素活性的多肽可以是含有或沒有細胞的粗制發(fā)酵液的形式，或是半純化或純化的酶制備物的形式。增強分解纖維素的蛋白質可以是單組分制備物，例如一種家族61蛋白質，多組分蛋白質制備物，例如多種家族61蛋白質，或者多組分和單組分蛋白質制備物的組合。所述有機物質可以是從發(fā)酵得到的任何物質。在一個優(yōu)選的方面，所述有機物質是醇?？衫斫獾氖切g語“醇”涵蓋含有一個或多個羥基部分的有機物。在一個更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨糖醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見例如Gong，C.S.、Cao，N.J.、Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，在《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》中，Scheper，T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany，65207-241；Silveira，M.M.，和Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59400-408；Nigam，P.，和Singh，D.，1995，Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute，ProcessBiochemistry30(2)117-124；Ezeji，T.C.、Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Productionofacetone，butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBA101andinsiturecoverybygasstripping，WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6)595-603。在另一個優(yōu)選的方面，有機物質是有機酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙酮酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是富馬酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一個優(yōu)選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是草酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見例如Chen，R.，和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65435-448。在另一個優(yōu)選的方面，有機物質是酮?？梢岳斫獾氖切g語“酮”涵蓋含有一個或多個酮部分的有機物。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見例如Qureshi和Blaschek，2003，同上。在另一個優(yōu)選的方面，有機物質是氨基酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見例如Richard，A.，和Margaritis，A.，2004，Empiricalmodelingofbachfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers，BiotechnologyandBioengineering87(4)501-515。在另一個優(yōu)選的方面，有機物質是氣體。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO2。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見例如Kataoka，N.、A.Miya，和K.Kiriyama，1997，Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria，WaterScienceandTechnology36(6-7)41-47；及GunaseelanV.N.，BiomassandBioenergyVol.13(1-2)，pp.83-114，1997，AnaerobicdigestionofbiomassformethaneproductionAreview。由纖維素材料生產有機物質通常需要四個主要步驟。這四個步驟是預處理、酶促水解、發(fā)酵和回收。下面例舉的是生產乙醇的方法，但應理解的是類似的方法可用于生產其它有機物質，例如上文所述物質。預處理。在預處理或預水解步驟中，將纖維素材料加熱以破壞木質素和碳水化合物結構，使大部分半纖維素溶解，并使纖維素級分可被纖維素分解酶接近。直接用蒸氣或者在漿液中進行加熱，在所述漿液中也可將催化劑加入原料以加速反應。催化劑包括強酸，諸如硫酸和SO2，或堿，諸如氫氧化鈉。預處理階段的目的在于促進酶和微生物的透過(penetration)。也可將纖維素生物材料進行濕熱蒸汽噴發(fā)(hydrothermalstreamexplosion)預處理(參見美國專利申請?zhí)?0020164730)。糖化。在酶促水解(也稱為糖化)步驟中，將本文所述酶加入預處理的原料以將纖維素級分轉化為葡萄糖和/或其它糖。糖化通常在pH、溫度和混合條件受控的攪拌槽反應器(stirred-tankreactor)和發(fā)酵罐中進行。糖化步驟可持續(xù)長達200個小時。糖化可于大約30℃至大約65℃、特別是大約50℃的溫度，和大約4至大約5，尤其是大約pH4.5的pH進行。為了生產能被酵母代謝的葡萄糖，通過在存在β-葡萄糖苷酶時進行水解。發(fā)酵。在發(fā)酵步驟中，將作為預處理和酶促水解步驟的結果由纖維素材料釋放的糖通過發(fā)酵生物諸如酵母發(fā)酵成乙醇。發(fā)酵也可與酶促水解在同樣pH、溫度和混合條件受控的同一容器中同時進行。當糖化和發(fā)酵在同一容器中同時進行時，該過程通常稱為同時糖化和發(fā)酵或SSF。任何合適的纖維素底物或原材料可用于本發(fā)明的發(fā)酵過程。通常根據(jù)預期的發(fā)酵產品，即要由發(fā)酵得到的有機物質，和采用的方法來選擇底物，正如本領域眾所周知的。適用于本發(fā)明方法的底物的實例包括含有纖維素的材料，諸如木材或植物殘余物或由加工的纖維素材料得到的低分子糖DP1-3，它們可由發(fā)酵微生物代謝，且可通過直接添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中來提供。術語“發(fā)酵培養(yǎng)基”將理解為指發(fā)酵微生物加入之前的培養(yǎng)基，諸如由糖化過程得到培養(yǎng)基，以及用于同時糖化和發(fā)酵過程(SSF)的培養(yǎng)基?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于期望發(fā)酵過程的任何微生物。根據(jù)本發(fā)明的合適的發(fā)酵微生物能夠發(fā)酵，即直接或間接將糖，諸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或寡糖轉化為所需發(fā)酵產物。發(fā)酵微生物的實例包括真菌生物體，諸如酵母。優(yōu)選的酵母包括糖酵母菌種的菌株，特別是釀酒酵母。商品化的酵母包括例如RedStar_/TM/LesaffreEthanolRed(可從美國的RedStar/Lesaffre獲得)、FALI(可從美國的BurnsPhilpFoodInc.的Fleischmann’sYeast部門獲得)、SUPERSTART(可從Alltech獲得)、GERTSTRAND(可從瑞典的GertStrandAB獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。在一個優(yōu)選的方面，所述酵母是糖酵母菌種。在一個更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酵母是糖化糖酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酵母是葡萄汁糖酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個優(yōu)選的方面，所述酵母是克魯維氏酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酵母是馬克斯克魯維氏酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酵母是脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromycesfragilis)。在另一個優(yōu)選的方面，所述酵母為假絲酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酵母是Candidapseudotropicalis。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酵母是Candidabrassicae。在另一個優(yōu)選的方面，所述酵母是Clavispora屬。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酵母是Clavisporalusitaniae。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酵母是Clavisporaopuntiae。在另一個優(yōu)選的方面，所述酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酵母是管囊酵母(Pachysolentannophilus)。在另一個優(yōu)選的方面，所述酵母是酒香酵母屬(Brettannomyces)。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology，在《HandbookonBioethanolProductionandUtilization》中，Wyman，C.E.編，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212)。能有效將葡萄糖發(fā)酵為乙醇的細菌包括例如運動發(fā)酵單孢菌(Zymomonasmobilis)和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis，1996，同上)。本領域眾所周知上述生物體還可用于生產其它有機物質，正如本文所述。在釀酒酵母中(Chen，Z.、Ho，N.W.Y.，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40135-147；Ho，N.W.Y.、Chen，Z.、Brainard，A.P.，1998，GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose，Appl.Environ.Microbiol.641852-1859)，或在細菌諸如大腸桿菌(Beall，D.S.、Ohta，K.、Ingram，L.O.，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli，Biotech.Bioeng.38296-303)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(Ingram，L.O.、Gomes，P.F.、Lai，X.、Moniruzzaman，M.、Wood，B.E.、Yomano，L.P.、York，S.W.，1998，Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction，Biotechnol.Bioeng.58204-214)和運動發(fā)酵單孢菌(Zhang，M.、Eddy，C.、Deanda，K.、Finkelstein，M.和Picataggio，S.，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis，Science267240-243；Deanda，K.、Zhang，M.、Eddy，C.和Picataggio，S.，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering，Appl.Environ.Microbiol.624465-4470)中克隆異源基因導致能將己糖和戊糖轉化為乙醇(共發(fā)酵)的生物體的構建。通常將酵母或另一種微生物加入降解的纖維素或水解產物，而發(fā)酵進行大約24至大約96小時，諸如大約35至大約60小時。溫度通常在大約26℃至大約40℃，特別是在大約32℃，和在大約pH3至大約pH6，特別是pH4-5左右。在一個優(yōu)選的方面，將酵母或另一種微生物施用于降解的纖維素或水解物，而發(fā)酵進行大約24至大約96小時，諸如通常35-60小時。在一個優(yōu)選的方面，溫度通常在大約26至大約40℃之間，特別是在大約32℃，而pH通常為大約pH3至大約pH6，優(yōu)選pH4-5左右。優(yōu)選將酵母或另一種微生物以每ml發(fā)酵培養(yǎng)液(fermentationbroth)大約105至1012、優(yōu)選大約107至1010、尤其是大約5×107菌計數(shù)的量施用。在乙醇生產階段期間，酵母細胞計數(shù)應優(yōu)選在大約107至1010的范圍內，尤其是大約2×108左右。關于使用酵母發(fā)酵的進一步指導可見于例如《TheAlcoholTextbook》(K.Jacques、T.P.Lyons和D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress，UnitedKingdom，1999)，將其引入作為參考。本領域中最廣泛使用的方法是同時糖化和發(fā)酵(SSF)方法，其中沒有糖化的保持階段(holdingstage)，這意味著酵母和酶一起加入。對于乙醇生產而言，發(fā)酵后將醪液(mash)蒸餾以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法得到的乙醇可用作例如燃料乙醇；飲料乙醇，即可飲用酒精(potableneutralspirits)；或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激物(fermentationstimulator)可與本文描述的任何酶促過程組合使用以進一步改進發(fā)酵方法，特別是發(fā)酵微生物的性能，諸如速率增加和乙醇產量。“發(fā)酵刺激物”指用于發(fā)酵微生物特別是酵母的生長的刺激物。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激物包括維生素和礦物質。維生素的實例包括多種維生素(multivitamins)、生物素、泛酸、煙酸、內消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素、及維生素A、B、C、D和E。參見例如Alfenore等人，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess，Springer-Verlag，2002，將其引入本文作為參考。礦物質的實例包括能夠提供營養(yǎng)的礦物質和礦物質鹽，包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu?；厥?。從發(fā)酵的纖維素材料分離乙醇，并通過蒸餾的常規(guī)方法純化。可得到純度為高達大約96vol.％乙醇的乙醇，它可用作例如燃料乙醇、飲料乙醇即可飲用酒精、或工業(yè)乙醇。對于其它有機物質來說，可使用本領域已知的任何方法，包括但不限于層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳(例如制備性等電聚焦)、溶解度差異(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、蒸餾或萃取。在本發(fā)明的方法中，可用一種或多種附加的酶活性補充分解纖維素酶的蛋白質和增強分解纖維素的多肽以改進纖維素材料的降解。優(yōu)選的附加酶是半纖維素酶、酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶和/或角質酶)、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶或其混合物。在本發(fā)明的方法中，可將附加的酶在發(fā)酵前或發(fā)酵過程中加入，包括發(fā)酵微生物繁殖的過程中或之后。本文所指的酶可源自或得自任何合適的來源，包括細菌、真菌、酵母或哺乳動物來源。術語“得到”在本文中指酶可分離自天然產生該酶作為固有酶(nativeenzyme)的生物體。術語“得到”在本文中還指酶可在宿主生物體中重組產生，其中所述重組產生的酶對于宿主生物體來說是天然的或外源的或具有經(jīng)過修飾的氨基酸序列，例如刪除、插入和/或替代一個或多個氨基酸，即重組產生的酶，它是天然氨基酸序列的突變體和/或片段，或是通過本領域已知的核酸改組(shuffling)方法產生的酶。涵蓋在天然酶的意義中的有天然變體，而涵蓋在外源酶的意義中的有諸如通過定點誘變或改組而重組得到的變體。酶還可以是純化的。術語“純化的”在用于本文時涵蓋不合來自該酶的來源生物體的其它組分的酶。術語“純化的”還涵蓋不含來自得到所述酶的天然生物體的組分的酶。酶可以是純化的，只有少量的其它蛋白質存在。表述“其它蛋白質”具體涉及其它酶。術語“純化的”在用于本文時還指去除其它組分，具體是其它蛋白質，且最具體的是存在于本發(fā)明的酶的來源細胞中的其它酶。酶可以是“基本上純的”，即不含來自產生所述酶的生物體的其它組分，即例如用于重組產生酶的宿主生物體。在一個優(yōu)選的方面，酶是至少75％(w/w)、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少96％、更優(yōu)選至少97％、甚至更優(yōu)選至少98％、或最優(yōu)選至少99％純的。在另一個優(yōu)選的方面，酶是100％純的。用于本發(fā)明的酶可以是適用于本文描述的方法的任何形式，諸如例如含有或不含細胞的粗制發(fā)酵液、干粉或顆粒、非粉化顆粒(non-dustinggranulate)、液體、穩(wěn)定液體(stabilizedliquid)或受保護的酶的形式。顆粒可例如如美國專利號4,106,991和4,661,452中所公開的來生產，且可任選通過本領域已知的方法包衣。液體酶制備物可例如根據(jù)已確定的方法通過加入穩(wěn)定劑，諸如糖、糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或其它有機酸來穩(wěn)定。受保護的酶可根據(jù)EP238,216中公開的方法來制備。半纖維素酶可通過多種真菌和細菌進行半纖維素的酶促水解。與纖維素降解類似，半纖維素水解需要許多酶的協(xié)調作用?？蓪肜w維素酶分成三種基本類型攻擊多糖鏈內內部鍵的內作用酶(endo-actingenzyme)，從多糖鏈的還原性或非還原性末端向前起作用的外作用酶(exo-actingenzyme)，和附屬酶，水解木質素糖苷鍵的乙酰酯酶(acetylesterase)和酯酶，諸如香豆酸(coumaricacid)酯酶和阿魏酸酯酶(Wong，K.K.Y.、Tan，L.U.L.和Saddler，J.N.，1988，Multiplicityofβ-1，4-xylanaseinmicroorganismsFunctionsandapplications，Microbiol.Rev.52305-317；Tenkanen，M.和Poutanen，K.，1992，Significanceofesterasesinthedegradationofxylans，在《XylansandXylanases》，Visser，J.、Beldman，G.、Kuster-vanSomeren，M.A.和Voragen，A.G.J.編，Elsevier，NewYork，NY，203-212；Coughlan，M.P.和Hazlewood，G.P.，1993，《HemicelluloseandHemicellulases》，Portland，London，UK；Brigham，J.S.、Adney，W.S.和Himmel，M.E.，1996，HemicellulasesDiversityandapplications，在《HandbookonBioethanolProductionandUtilization》，Wyman，C.E.編，Taylor&Francis，Washington，DC，119-141)。半纖維素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、內切-半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、內切或外切阿拉伯聚糖酶(arabinase)、外切-半乳聚糖酶及其混合物。內作用半纖維素酶和附屬酶的實例包括內阿拉伯聚糖酶(endoarabinanase)、內切阿拉伯糖半乳聚糖酶、內切葡聚糖酶、內切甘露聚糖酶、內切木聚糖酶和feraxan內切木聚糖酶。外作用半纖維素酶和附屬酶的實例包括α-L-阿拉伯糖苷酶、β-L-阿拉伯糖苷酶、α-1，2-L-巖藻糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-木糖苷酶、外切葡萄糖苷酶、外切纖維二糖水解酶、外切甘露二糖水解酶、外切甘露聚糖酶、外切木聚糖酶、木聚糖α-葡糖醛酸糖苷酶、和松柏苷β-葡萄糖苷酶。酯酶的實例包括乙酰酯酶(乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶和乙酰木聚糖酯酶)和芳基酯酶(香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶)。優(yōu)選的是，半纖維素酶是外作用半纖維素酶，而且更優(yōu)選在低于pH7的酸性條件下具有水解半纖維素能力的外作用半纖維素酶。適用于本發(fā)明的半纖維素酶的實例包括VISCOZYMETM(可從NovozymesA/S獲得)。將半纖維素酶以固體重量的大約0.001％至大約5.0％、更優(yōu)選固體重量的大約0.025％至大約4.0％、且最優(yōu)選固體重量的大約0.005％至大約2.0％的有效量加入。木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)可由任何合適的來源獲得，包括真菌和細菌生物體，諸如曲霉屬、Disporotrichum、青霉屬、脈孢菌屬、鐮孢屬、木霉屬、腐質霉屬、嗜熱霉屬(Thermomyces)和芽孢桿菌屬。含有木聚糖酶的優(yōu)選商品化制備物包括SHEARZYME_、BIOFEEDWHEAT_、BIO-FEEDPlus_L、CELLUCLAST_、ULTRAFLO_、VISCOZYME_、PENTOPANMONO_BG和PLUPZYME_HC(NovozymesA/S)；及LAMINEX_和SPEZYME_CP(GenencorInt.)。酯酶可用于纖維素的生物轉化的酯酶包括乙酰酯酶，諸如乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶和乙酰木聚糖酯酶，以及水解木質素糖苷鍵的酯酶，諸如香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶。在用于本文時，“酯酶”也稱為羧酸脂水解酶，指作用于酯鍵上的酶，包括根據(jù)酶命名法(《EnzymeNomenclature》，1992，AcademicPress，SanDiego，California，及分別在Eur.J.Biochem.2231-5，1994；Eur.J.Biochem.2321-6，1995；Eur.J.Biochem.2371-5，1996；Eur.J.Biochem.2501-6，1997；和Eur.J.Biochem.264610-650，1999中的補遺1(1993)、補遺2(1994)、補遺3(1995)、補遺4(1997)和補遺5)歸入EC3.1.1羧酸脂水解酶的酶。酯酶的非限制性實例包括芳基酯酶、三酰甘油脂肪酶、乙酰酯酶、乙酰膽堿酯酶、膽堿酯酶、托品酯酶(tropinesterase)、果膠酯酶、甾醇酯酶、葉綠素酶、L-阿拉伯糖酸內酯酶、葡糖酸內酯酶、糖醛酸內酯酶、鞣酸酶、棕櫚酸視黃酯酯酶、羥基丁酸酯-二聚物水解酶、?；视椭久?、3-氧代己二酸烯醇內酯酶、1，4-內酯酶、半乳糖脂肪酶、4-吡哆醇內酯酶、?；舛緣A水解酶、氨基酰基-tRNA水解酶、D-阿拉伯糖酸內酯酶、6-磷酸葡糖酸內酯酶、磷脂酶A1、6-乙酰葡糖脫乙?；?、脂蛋白脂肪酶、二氫香豆素脂肪酶、檸檬素-D-環(huán)-內酯酶、類固醇內酯酶、三乙酸內酯酶、放線菌素內酯酶、苔色酸縮酚酸水解酶、頭孢菌素-C脫乙?；?、氯原酸水解酶、α-氨基酸酯酶、4-草酰乙酸甲酯酯酶(4-methyloxaloacetateesterase)、羧甲烯丁烯羥酸內酯酶(carboxymethylenebutenolidase)、脫氧檸檬酸A-環(huán)-內酯酶、2-乙酰基-1-烷基甘油磷酸膽堿酯酶(2-acetyl-1-alkylglycerophosphocholine)、鐮孢氨酸-C鳥氨酸酯酶、芥子堿酯酶、蠟酯水解酶、佛波醇二酯水解酶、磷脂酰肌醇脫酰基酶、唾液酸O-乙酰酯酶、乙酰氧基丁基并噻吩脫乙?；?acetoxybutynylbithiophenedeacetylase)、乙酰水楊酸脫乙?；?、乙酸甲基傘酮脫乙酰基酶(methylumbelliferyl-acetatedeacetylase)、2-吡喃酮-4，6-二羧化物內酯酶(2-pyrone-4，6-dicarboxylatelactonase)、N-乙酰半乳糖氨基聚糖脫乙?；?N-acetylgalactosaminoglycandeacetylase)、保幼激素酯酶、雙(2-乙基己基)鄰苯二甲酸酯酯酶(bis(2-ethylhexyl)phthalateesterase)、蛋白質-谷氨酸酯甲基酯酶(protein-glutamatemethylesterase)、11-順式-棕櫚酸視黃酯水解酶、所有-反式-棕櫚酸視黃酯水解酶、L-鼠李糖-1，4-內酯酶、5-(3，4-雙乙酸基丁-1-基)-2，2′-并噻吩脫?；?5-(3，4-diacetoxybut-1-ynyl)-2，2′-bithiophenedeacetylase)、脂肪-酰基-乙基-酯合酶(fatty-acyl-ethyl-estersynthase)、木質-1，4-內酯酶(xylono-1，4-lactonase)、N-乙?；咸前坊字＜〈济撘阴；?、西曲酸酯苯甲基酯酶(cetraxatebenzylesterase)、乙?；榛视鸵阴；饷浮⒑鸵阴Ｄ揪厶酋ッ?。用于本發(fā)明的優(yōu)選酯酶是脂肪分解酶，諸如脂肪酶(歸入EC3.1.1.3、EC3.1.1.23和/或EC3.1.1.26)和磷脂酶(歸入EC3.1.1.4和/或EC3.1.1.32，包括歸入EC3.1.1.5的溶血磷脂酶)。其它優(yōu)選的酯酶有角質酶(歸入EC3.1.1.74)?？蓪Ⅴッ敢杂行Я考尤霃亩玫筋A期的優(yōu)勢以改進發(fā)酵微生物的性能，例如改變發(fā)酵微生物內部和/或外部，或發(fā)酵微生物的細胞膜中的脂質組成/濃度，以在發(fā)酵過程中產生溶質進入和/或移出發(fā)酵微生物的運動中的改進，和/或以提供更多可代謝的能量來源(諸如例如通過將諸如來自谷物底物的油等組分轉化為發(fā)酵微生物有用的組分，例如不飽和的脂肪酸和甘油)，以增加乙醇產量。有效量的酯酶的實例是大約0.01至大約400LU/gDS(干固體)。優(yōu)選的是，以大約0.1至大約100LU/gDS、更優(yōu)選大約0.5至大約50LU/gDS、和甚至更優(yōu)選大約1至大約20LU/gDS的量使用酯酶。使用本領域已知的標準程序，下文可獲得酯酶量的進一步優(yōu)化。一個脂肪酶單位(LU)是以三丁精作為底物和阿拉伯樹膠作為乳化劑，于30℃、pH7.0(磷酸鹽緩沖液)，每分鐘釋放1.0μmol可滴定脂肪酸的酶量。在一個優(yōu)選的方面，酯酶是脂肪分解酶，更優(yōu)選脂肪酶。在用于本文時，“脂肪分解酶”指脂肪酶和磷脂酶(包括溶血磷脂酶)。脂肪分解酶優(yōu)選是微生物來源的，特別是細菌、真菌或酵母來源。所用脂肪分解酶可源自任何來源，包括例如犁頭霉屬(Absidia)的菌株，特別是Absidiablakesleena和傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)，無色桿菌屬(Achromobacter)的菌株，特別是解毒無色桿菌(Achromobacteriophagus)，氣單孢菌屬(Aeromonas)的菌株，鏈格孢屬(Alternaria)的菌株，特別是Alternariabrassiciola，曲霉屬的菌株，特別是黑曲霉、米曲霉、煙曲霉和黃曲霉，無色桿菌屬的菌株，特別是解毒無色桿菌，短梗霉屬的菌株，特別是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，芽孢桿菌屬的菌株，特別是短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，白僵菌屬(Beauveria)的菌株，索絲菌屬(Brochothrix)的菌株，特別是熱殺索絲菌(Brochothrixthermosohata)，假絲酵母屬的菌株，特別是Candidacylindracea(皺落假絲酵母(Candidarugosa))、Candidaparalipolyica和Candidaantarctica，色桿菌屬(Chromobacter)的菌株，特別是粘稠色桿菌(Chromobacterviscosum)，鬼傘屬的菌株，特別是灰蓋鬼傘，鐮孢屬的菌株，特別是禾谷鐮孢、尖孢鐮孢、腐皮鐮孢(Fusariumsolani)、Fusariumsolanipisi、黃色粉紅鐮孢(Fusariumroseumculmorum)和有毒鐮孢，Geotricum屬的菌株，特別是Geotricumpenicillatum，漢遜氏酵母屬的菌株，特別是異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)，腐質霉屬的菌株，特別是Humicolabrevispora、Humicolabrevisvar.thermoidea和Humicolainsolens，Hyphozyma屬的菌株，乳桿菌屬(Lactobacillus)的菌株，特別是完全乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)，綠僵菌屬(Metarhizium)的菌株，毛霉屬的菌株，擬青霉屬的菌株，青霉屬的菌株，特別是圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)、皮落青霉(Penicilliumcrustosum)和擴展青霉(Penicilliumexpansum)，假單胞菌屬的菌株，特別是銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、產堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)、蔥頭假單胞菌(Pseudomonascepacia)(同義詞洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia))、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、莓實假單胞菌(Pseudomonasfragi)、嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia)、門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)、Pseudomonasmephiticalipolytica、產堿假單胞菌、植物假單胞菌(Pseudomonasplantari)、類產堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)和Pseudomonaswisconsinensis，絲核菌屬(Rhizooctonia)的菌株，特別是立枯絲核菌(Rhizooctoniasolani)、根毛霉屬的菌株，特別是米赫根毛霉，根霉屬的菌株，特別是日本根霉(Rhizopusjaponicus)、小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)和Rhizopusnodosus，紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)的菌株，特別是紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)，紅酵母屬(Rhodotorula)的菌株，特別是紅酵母(Rhodotorulaglutinnis)，擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的菌株，特別是Sporobolomycesshibatanus，嗜熱霉屬的菌株，特別是細毛嗜熱霉(Thermomyceslanuginosus)(以前稱為細毛腐質霉Humicolalanuginosa)，Thiarosporella的菌株，特別是Thiarosporellaphaseolina，木霉屬的菌株，特別是哈茨木霉和瑞氏木霉，和/或輪枝孢屬(Verticillium)的菌株。在一個優(yōu)選的方面，脂肪分解酶源自曲霉屬、無色桿菌屬、芽孢桿菌屬、假絲酵母屬、色桿菌屬、鐮孢屬、腐質霉屬、Hyphozyma屬、假單胞菌屬、根毛霉屬、根霉屬或嗜熱霉屬的菌株。在更優(yōu)選的方面，脂肪分解酶是脂肪酶。在本文中可應用脂肪酶在例如由谷物底物產生的發(fā)酵培養(yǎng)基(包括發(fā)酵酵母)中修飾甘油三酸酯油和脂肪的結構和組成的能力。脂肪酶催化不同類型的甘油三酸酯轉化，諸如水解、酯化和酯交換(transesterification)。合適的脂肪酶包括酸性、中性和堿性脂肪酶，正如本領域眾所周知的，雖然酸性脂肪酶(諸如例如可從Amano獲得的脂肪酶GAMANO50)與中性或堿性脂肪酶相比，看起來在脂肪酶的較低濃度更有效。優(yōu)選用于本發(fā)明的脂肪酶包括Candidaantarcitca脂肪酶和Candidacylindracea脂肪酶。更優(yōu)選的脂肪酶是純化的脂肪酶，諸如Candidaantarcitca脂肪酶(脂肪酶A)、Candidaantarcitca脂肪酶(脂肪酶B)、Candidacylindracea脂肪酶和沙門柏干酪青霉(Penicilliumcamembertii)脂肪酶。脂肪酶可以是EP258,068-A中公開的一種，或者可以是脂肪酶變體，諸如WO00/60063或WO00/32758中公開的變體，引入本文作為參考。優(yōu)選的商品化脂肪酶包括LECITASETM、LIPOLASETM和LIPEXTM(可從NovozymesA/S獲得)和GAMANOTM50(可從Amano獲得)。脂肪酶優(yōu)選以大約1至大約400LU/gDS、優(yōu)選大約1至大約10LU/gDS、和更優(yōu)選大約1至大約5LU/gDS的量加入。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，所述酯酶是角質酶。角質酶是能夠降解角質的酶。角質酶可源自任何來源。在一個優(yōu)選的方面，所述角質酶源自曲霉屬的菌株，特別是米曲霉，鏈格孢屬的菌株，特別是Alternariabrassiciola，鐮孢屬的菌株，特別是腐皮鐮孢、Fusariumsolanipisi、黃色粉紅鐮孢或Fusariumroseumsambucium，長蠕孢屬(Helminthosporum)的菌株，特別是麥根腐長蠕孢(Helminthosporumsativum)，腐質霉屬的菌株，特別是Humicolainsolens，假單胞菌屬的菌株，特別是門多薩假單胞菌或惡臭假單胞菌，絲核菌屬的菌株，特別是立枯絲核菌，鏈霉菌屬的菌株，特別是瘡痂病鏈霉菌(Streptomycesscabies)，或單格孢屬(Ulocladium)，特別是Ulocladiumconsortiale。在一個最優(yōu)選的方面，角質酶源自Humicolainsolens的菌株，特別是菌株HumicolainsolensDSM1800。Humicolainsolens角質酶在WO96/13580中有描述，將其引入本文作為參考。角質酶可以是變體，諸如WO00/34450和WO01/92502中公開的變體之一，將其引入本文作為參考。優(yōu)選的角質酶變體包括WO01/92502的實施例2中列出的變體，將其明確引入本文作為參考。角質酶的有效量為大約0.01至大約400LU/gDS、優(yōu)選大約0.1至大約100LU/gDS、且更優(yōu)選大約1至大約50LU/gDS。使用本領域已知的標準程序，下文可獲得角質酶量的進一步優(yōu)化。在另一個優(yōu)選的方面，酯酶是磷脂酶。在用于本文時，術語“磷脂酶”是具有針對磷脂的活性例如水解活性的酶。磷脂，諸如卵磷脂或磷脂酰膽堿，由外部(sn-1)和中間(sn-2)位置以兩個脂肪酸酯化且第三個位置以磷酸酯化的甘油組成。可將磷酸酯化成氨基醇。可區(qū)分幾種類型的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，它們分別在sn-1和sn-2位置水解一個脂肪?；孕纬扇苎字?；和溶血磷脂酶(或磷脂酶B)，它水解溶血磷脂中殘余的脂肪?；?。磷脂酶C和磷脂酶D(磷酸二酯酶)分別釋放二?；视?diacylglycerol)或磷脂酸(phosphatidicacid)。術語“磷脂酶”包括具有磷脂酶活性的酶，例如磷脂酶A(A1或A2)、磷脂酶B活性、磷脂酶C活性、或磷脂酶D活性。術語“磷脂酶A”在用于本文時意圖涵蓋具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶。也可通過具有其它活性的酶來提供磷脂酶活性，諸如例如具有磷脂酶活性的脂肪酶。磷脂酶活性可例如來自具有磷脂酶副活性(sideactivity)的脂肪酶。在其它方面，通過本質上只具有磷脂酶活性的酶來提供磷脂酶酶活性，而且其中磷脂酶酶活性不是副活性。磷脂酶可以是任何來源，例如動物來源(例如哺乳動物，例如?；蜇i胰)、或蛇毒或蜂毒?；蛘?，磷脂酶可以是微生物來源，例如來自絲狀真菌、酵母或細菌，諸如曲霉屬，例如泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉或米曲霉，網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)，例如盤基網(wǎng)柄菌(D.discoideum)；鐮孢屬，例如黃色鐮孢、禾谷鐮孢、異孢鐮孢、腐皮鐮孢、尖孢鐮孢或有毒鐮孢；毛霉屬，例如，爪哇毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)或細孢毛霉(M.subtilissimus)；脈孢霉屬，例如粗糙脈孢菌；根毛霉屬，例如，微小根毛霉(R.pusillus)；根霉屬，例如少根根霉(R.arrhizus)、日本根霉或匍枝根霉(R.stolonifer)；核盤菌屬(Sclerotinia)，例如大豆核盤菌(S.libertiana)；發(fā)癬菌屬(Trichophyton)，例如紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)；Whetzelinia屬，例如W.sclerotiorum；芽孢桿菌屬，例如巨大芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌；檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)，例如弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)；腸桿菌屬(Enterobacter)，例如產氣腸桿菌(E.aerogenes)或陰溝腸桿菌(E.cloacae)；愛德華氏菌屬(Edwardsiella)，遲鈍愛德華氏菌(E.tarda)；歐文氏菌屬(Erwinia)，例如草生歐文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌屬(Escherichia)，例如大腸桿菌(E.coli)；克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；變形菌屬(Proteus)，例如普通變形菌(P.vulgaris)；普羅威登斯菌屬(Providencia)，例如斯氏普羅威登斯菌(P.stuartii)；沙門氏菌屬(Salmonella)，例如鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌屬(Serratia)，例如液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘質沙雷氏菌(S.marcescens)；志賀氏菌屬(Shigella)，例如弗氏志賀氏菌(S.flexneri)；鏈霉菌屬，例如，紫紅鏈霉菌(S.violeceoruber)；或耶爾森氏菌屬(Yersinia)，例如小腸結腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)。優(yōu)選的商品化磷脂酶包括LECITASETM和LECITASETMULTRA(可從NovozymesA/S獲得)。磷脂酶的有效量為大約0.01至大約400LU/gDS、優(yōu)選大約0.1至大約100LU/gDS、且更優(yōu)選大約1至大約50LU/gDS。使用本領域已知的標準程序，下文可獲得磷脂酶量的進一步優(yōu)化。蛋白酶在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，將至少一種表面活性劑和至少一種碳水化合物生成酶與至少一種蛋白酶組合使用?？墒褂玫鞍酌咐鐏硐鞍踪|以產生游離的氨基氮(FAN)。所述游離的氨基酸起到酵母營養(yǎng)物的作用，從而增強酵母的生長，并因此增強乙醇的生產?？赏ㄟ^在存在至少一種蛋白酶時繁殖發(fā)酵微生物來產生用于發(fā)酵過程的發(fā)酵微生物。雖然不限于任何一種操作理論，但相信當發(fā)酵微生物后續(xù)用于發(fā)酵過程時，在含有有效量的至少一種蛋白酶的情況下繁殖發(fā)酵微生物與不加蛋白酶在相同條件下繁殖的發(fā)酵微生物相比縮短了發(fā)酵微生物的遲滯時間(lagtime)。相信蛋白酶在繁殖過程中的作用是直接或間接分別導致在發(fā)酵過程中對于發(fā)酵微生物有害或有益基因的抑制或表達，從而縮短了遲滯時間并得到更快的發(fā)酵循環(huán)。蛋白酶是本領域眾所周知的，并指催化切割肽鍵的酶。合適的蛋白酶包括真菌和細菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性蛋白酶，即特征在于在低于pH7的酸性條件下水解蛋白質的能力的蛋白酶。合適的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉屬、毛霉屬、根霉屬、假絲酵母屬、革蓋菌屬、內座殼屬(Endothia)、Enthomophtra、耙菌屬(Irpex)、青霉屬、小核菌屬(Sclerotium)和球擬酵母屬(Torulopsis)的真菌蛋白酶。尤其預期源自黑曲霉(參見例如Koaze等人，1964，Agr.Biol.Chem.Japan28216)、齋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(參見例如Yoshida，1954，J.Agr.Chem.Soc.Japan2866)、泡盛曲霉(Hayashida等人，1977，Agric.Biol.Chem.42927-933)、棘孢曲霉(WO95/02044)或米曲霉的蛋白酶；和源自微小毛霉或米赫毛霉的酸性蛋白酶。不是酸性蛋白酶的細菌蛋白酶包括商品化產品ALCALASETM和NEUTRASETM(可從NovozymesA/S獲得)。其它蛋白酶包括來自GenencorInt，Inc.(美國)的GC106和來自NovozymesA/S的NOVOZYMTM50006。優(yōu)選的是，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，正如例如《HandbookofProteolyticEnzymes》(A.J.Barrett、N.D.Rawlings和J.F.Woessner編，AcademicPress，SanDiego，1998，第270章)中所述。天冬氨酸蛋白酶的合適實例包括例如Berka等人，1990，Gene96313；Berka等人，1993，Gene125195-198；及Gomi等人，1993，Biosci.Biotech.Biochem.571095-1100中公開的那些。過氧化物酶具有過氧化物酶活性的其它化合物可以是任何過氧化物酶(EC1.11.1.7)，或具有由其衍生的過氧化物酶活性、顯示過氧化物酶活性的任何片段。優(yōu)選的是，過氧化物酶由植物(例如辣根或大豆過氧化物酶)或微生物諸如真菌或細菌產生。一些優(yōu)選的真菌包括屬于半知菌亞門(subdivisionDeuteromycotina)絲孢綱(classHyphomycetes)的菌株，例如鐮孢屬、腐質霉屬、木霉屬、漆斑菌屬(Myrothecium)、輪枝孢屬(Verticillum)、Arthromyces屬、卡爾黑霉屬(Caldariomyces)、單隔孢屬、Embellisia屬、支孢屬(Cladosporium)或Dreschlera，特別是尖孢鐮孢(DSM2672)、Humicolainsolens、瑞氏木霉、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)(IFO6113)、黃萎輪枝孢菌(Verticillumalboatrum)、大麗花輪枝孢菌(Verticillumdahlie)、Arthromycesramosus(FERMP-7754)、Caldariomycesfumago、紙單隔孢(Ulocladiumchartarum)、Embellisiaalli或Dreschlerahalodes。其它優(yōu)選的真菌包括屬于擔子菌亞門(subdivisionBasidiomycotina)擔子菌綱(classBasidiomycetes)的菌株，例如鬼傘屬、Phanerochaete屬、革蓋菌屬或栓菌屬，特別是Coprinuscinereusf.microsporus(IFO8371)、長根鬼傘(Coprinusmacrorhizus)、Phanerochaetechrysosporium(例如NA-12)或栓菌屬(以前稱為多孔菌屬(Polyporus))，例如T.versicolor(例如PR428-A)。其它優(yōu)選的真菌包括屬于接合菌亞門(subdivisionZygomycotina)Mycoraceae綱的菌株，例如根霉屬或毛霉屬，特別是凍土毛霉(Mucorhiemalis)。一些優(yōu)選的細菌包括放線菌目(orderActinomycetales)的菌株，例如類球形鏈霉菌(Streptomycesspheroides)(ATTC23965)、熱紫鏈霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)(IFO12382)或輪枝鏈霉菌輪枝亞種(Streptoverticillumverticilliumssp.Verticillium)。其它優(yōu)選的細菌包括類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)、Rhodomonaspalustri、乳鏈球菌(Streptococcuslactis)、Pseudomonaspurrocinia(ATCC15958)、熒光假單胞菌(NRRLB-11)和芽孢桿菌屬菌株，例如短小芽孢桿菌(ATCC12905)和嗜熱脂肪芽孢桿菌。其它優(yōu)選的細菌包括屬于粘球菌屬(Myxococcus)的菌株，例如變綠粘球菌(M.virescens)。過氧化物酶也可以是通過如下方法產生的一種，所述方法包括在培養(yǎng)基中在允許過氧化物酶表達的條件下培養(yǎng)用重組DNA載體轉化的宿主細胞，所述重組DNA載體攜帶編碼過氧化物酶的DNA序列以及用于表達編碼過氧化物酶的DNA序列的DNA序列，并從培養(yǎng)物中回收過氧化物酶。在一個優(yōu)選的方面，重組產生的過氧化物酶是源自鬼傘菌種的過氧化物酶，特別是根據(jù)WO92/16634的長根鬼傘或灰蓋鬼傘。在本發(fā)明中，具有過氧化物酶活性的化合物包含過氧化物酶和源自細胞色素、血紅蛋白或過氧化物酶的過氧化物酶活性片段。一個過氧化物酶單位(POXU)是在如下條件下每分鐘催化轉化1μmole過氧化氫的酶量，所述條件為于30℃，在0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.0、0.88mM過氧化氫、和1.67mM2，2′-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽)(2，2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate))(ABTS)。監(jiān)測反應60秒(混合后15秒)，即418nm吸光度的改變，它應在0.15至0.30的范圍內。為了計算活性，使用氧化ABTS的吸光系數(shù)36mM-1cm-1和化學計量關系每氧化2μmoleABTS轉化1μmoleH2O2。漆酶在本發(fā)明中，漆酶和漆酶相關酶包括歸入EC1.10.3.2的任何漆酶、歸入EC1.10.3.1的任何兒茶酚氧化酶、歸入EC1.3.3.5的任何膽紅素氧化酶、或歸入EC1.14.18.1的任何一元酚單加氧酶。上文所述酶可以是微生物的，即得自細菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)，或者它們可源自植物。來自真菌的合適實例包括得自如下菌株的漆酶曲霉屬，脈孢菌屬，例如粗糙脈孢菌，柄孢殼屬(Podospora)，葡萄孢屬(Botrytis)，金錢菌屬(Collybia)，層孔菌屬(Fomes)，香菇屬(Lentinus)，側耳屬，栓菌屬，例如T.villosa和T.versicolor，絲核菌屬，例如立枯絲核菌，鬼傘屬，例如灰蓋鬼傘、毛頭鬼傘(C.comatus)、費賴斯鬼傘(C.friesii)和褶紋鬼傘(C.plicatilis)，小脆柄菇屬(Psathyrella)，例如黃蓋小脆柄菇(P.condelleana)，斑褶菇屬(Panaeolus)，例如蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)，毀絲霉屬，例如嗜熱毀絲霉，Schytalidium屬，例如S.thermophilum，多孔菌屬，例如P.pinsitus，密孔菌屬(Pycnoporus)，例如朱紅密孔菌(P.cinnabarinus)，射脈菌屬(Phlebia)，例如射脈菌(P.radita)(WO92/01046)，或革蓋菌屬，例如毛革蓋菌(JP2-238885)。來自細菌的合適實例包括得自芽孢桿菌菌株的漆酶。優(yōu)選得自鬼傘屬、毀絲霉屬、多孔菌屬、密孔菌屬、柱頂孢屬或絲核菌屬的漆酶；特別是得自灰蓋鬼傘、嗜熱毀絲霉、Polyporuspinsitus、朱紅密孔菌、嗜熱柱頂孢或立枯絲核菌的漆酶。商品化漆酶有NS51001(Polyporuspinsitius漆酶，可從NovozymesA/S獲得)和NS51002(嗜熱毀絲霉漆酶，可從NovozymesA/S獲得)。漆酶或漆酶相關酶也可以是通過如下方法產生的一種，所述方法包括在培養(yǎng)基中在允許漆酶表達的條件下培養(yǎng)用重組DNA載體轉化的宿主細胞，所述重組DNA載體攜帶編碼漆酶的DNA序列以及用于表達編碼漆酶的DNA序列的DNA序列，并從培養(yǎng)物中回收漆酶。漆酶活性(LACU)由需氧條件下于pH5.5的丁香醛連氮(syringaldazin)氧化來測定。產生的紫顏色在530nm用光度計測定。分析條件為19mM丁香醛連氮、23mM乙酸鹽緩沖液pH5.5，30℃，1分鐘反應時間。一個漆酶單位(LACU)是上述條件下每分鐘催化1.0μmole丁香醛連氮轉化的酶量。漆酶活性(LAMU)由需氧條件下于pH7.5的丁香醛連氮氧化來測定。產生的紫顏色在530nm用光度計測定。分析條件為19mM丁香醛連氮、23mMTris/馬來酸鹽pH7.5，30℃，1分鐘反應時間。一個漆酶單位(LAMU)是上述條件下每分鐘催化1.0μmole丁香醛連氮轉化的酶量。本發(fā)明的多肽可以聯(lián)合上文所述酶和/或分解纖維素的蛋白質用于進一步降解生物材料底物的纖維素組分(參見例如Brigham等人，1995，在《HandbookonBioethanol》中，CharlesE.Wyman編，pp.119-141，Taylor&Francis，WashingtonD.C.；Lee，1997，JournalofBiotechnology561-24)。洗滌劑組合物本發(fā)明具有增強分解纖維素活性的多肽可添加到洗滌劑組合物中并因此成為它的一種組分。例如，可以將本發(fā)明的洗滌劑組合物配制成手洗或機洗洗衣洗滌劑組合物，包括適用于預處理污染織物的洗衣添加劑組合物和漂洗時添加的織物柔軟劑組合物，或配制成用于普通家庭硬面清洗操作的洗滌劑組合物，或配制成用于手洗或機洗洗碟操作的洗滌劑組合物。在一個具體的方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明具有增強分解纖維素活性的多肽的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑和洗滌劑組合物中可包含一種或多種其它的酶，諸如蛋白酶、脂肪酶、角質酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(如漆酶)、和/或過氧化物酶。通常，所選酶的性質應該與所選洗滌劑相容(即最佳pH、與其它酶和非酶組分的相容性等等)，并且所述酶應該以有效量存在。纖維素酶適宜的纖維素酶包括細菌或真菌起源的那些。包括經(jīng)化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體。適宜的纖維素酶包括來自下列屬的纖維素酶芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、Acremonium屬，例如在US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757、和WO89/09259中公開的由Humicolainsolens、嗜熱毀絲霉、和尖孢鐮孢產生的真菌纖維素酶。尤其適宜的纖維素酶是有益于保護顏色的堿性或中性纖維素酶。這些纖維素酶的實例有EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其它實例有諸如在WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307、和PCT/DK98/00299中描述的纖維素酶變體。市場上可購買到的纖維素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(NovozymesA/S)、ClazinaseTM和PuradaxHATM(GenencorInternationalInc.)、及KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。蛋白酶適宜的蛋白酶包括那些動物、植物或微生物起源的。優(yōu)選微生物起源的。包括經(jīng)化學修飾或蛋白質工程改造的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草桿菌蛋白酶，尤其是那些來源于芽孢桿菌屬的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、和枯草桿菌蛋白酶168(描述在WO89/06279中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如起源于豬或牛的)和鐮孢屬蛋白酶(描述于WO89/06270和WO94/25583中)。有用的蛋白酶的實例是WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116、和WO98/34946中所描述的變體，尤其是在一個或多個如下位置發(fā)生替代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、和274。優(yōu)選的市場上可買到的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM和KannaseTM(NovozymesA/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、PurafectOxPTM、FN2TM和FN3TM(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶適宜的脂肪酶包括細菌或真菌起源的那些。包括經(jīng)化學修飾的或經(jīng)蛋白質工程改造的變體。有用的脂肪酶的實例包括來自腐質霉屬(同義詞嗜熱霉屬Thermomyces)的脂肪酶，例如EP258068和EP305216中所描述的H.lanuginosa(T.lanuginosus)或WO96/13580中所描述的H.insolens；假單胞菌屬脂肪酶，例如產堿假單胞菌(P.alkaligenes)或類產堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、蔥頭假單胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌種菌株SD705(WO95/06720)和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO96/12012)；芽孢桿菌屬脂肪酶，例如枯草芽孢桿菌(Dartois等人，1993，BiochemicaetBiophysicsActa，1131,253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)、或短小芽孢桿菌(WO91/16422)。其它實例有諸如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079、和WO97/07202中所描述的脂肪酶變體。優(yōu)選的市場上可買到的脂肪酶包括LipolaseTM和LipolaseUltraTM(NovozymesA/S)。淀粉酶適宜的淀粉酶(α和/或β)包括細菌和真菌起源的那些。包括經(jīng)化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體。淀粉酶包括例如芽孢桿菌屬例如地衣芽孢桿菌特定菌株來源的α-淀粉酶，詳細說明描述在GB1,296,839中。有用的淀粉酶的實例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873、和WO97/43424中所描述的變體，尤其是在一個或多個如下位置發(fā)生替代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。市場上可買到的淀粉酶有DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(NovozymesA/S)、RapidaseTM和PurastarTM(GenencorInternationalInc.)。過氧化物酶/氧化酶適宜的過氧化物酶/氧化酶包括源自植物、細菌、或真菌的那些。包括經(jīng)化學修飾或蛋白質工程改造的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬例如灰蓋鬼傘的過氧化物酶及其變體，如在WO93/24618、WO95/10602、和WO98/15257中所描述的那些。市場上可買到的過氧化物酶包括GuardzymeTM(NovozymesA/S)?？赏ㄟ^添加含一種或多種酶的獨立的添加劑或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑將酶組分包括在洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即獨立的添加劑或組合添加劑，可配制成例如顆粒、液體、漿體等形式。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制劑為顆粒劑，特別是非粉化的顆粒劑；液體，特別是穩(wěn)定的液體；或漿體。例如可如在美國專利US4,106,991和4,661,452中所公開的方法制備非粉化顆粒劑，并可任選使用本領域已知的方法進行包衣。蠟質包衣材料的實例有平均摩爾質量為1000-20000的聚(環(huán)氧乙烷)產物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；具有15-80個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化脂肪醇，其中醇含12-20個碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單-、雙-和三甘油酯。GB1483591中給出了適于通過流化床技術應用的成膜包衣材料的實例。例如，液體酶制備物可根據(jù)既定的方法通過加入多元醇諸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩(wěn)定。受保護的酶可根據(jù)EP238,216中所公開的方法制備。本發(fā)明的洗滌劑組合物可采用任一種方便的形式，例如條、片、粉末、顆粒、膏、或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般含可高達70％的水和0-30％的有機溶劑，或者是不含水的。洗滌劑組合物可含有一種或多種表面活性劑，可以是非離子的，包括半極性和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子的。表面活性劑的含量一般為以重量計的0.1％-60％。當洗滌劑包含陰離子表面活性劑時，它通常含有大約1％到大約40％的陰離子表面活性劑，諸如線狀的烷基苯磺酸酯、α-石蠟磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯、二級烷基磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸、或皂。當洗滌劑中包含非離子型表面活性劑時，它通常含有大約0.2％到大約40％的非離子型表面活性劑，諸如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。洗滌劑可包含0-65％的洗滌劑助洗劑或絡合劑，諸如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸酯、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽、或層狀硅酸鹽(例如購自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實例有羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯諸如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可包含漂白系統(tǒng)，該系統(tǒng)可含有H2O2來源諸如過硼酸鹽或過碳酸鹽，可將其與形成過酸的漂白活化劑諸如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ趸交撬狨ハ嘟M合?；蛘?，漂白系統(tǒng)可包含過氧酸，例如酰胺、亞胺、或砜型?？墒褂贸Ｒ?guī)的穩(wěn)定劑穩(wěn)定本發(fā)明洗滌劑組合物的酶，例如多元醇，諸如丙二醇或丙三醇；糖或糖醇；乳酸；硼酸，或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物諸如4-甲酰苯基硼酸；且所述的組合物可如WO92/19709和WO92/19708中所描述的方法來配制。洗滌劑還可包含其它的常規(guī)洗滌劑成分，諸如包括粘土的織物調節(jié)劑、泡沫促進劑、抑泡劑、防蝕劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積劑、染色劑、殺菌劑、光漂白劑、水溶助長劑、晦暗抑制劑、或芳香劑。在洗滌劑組合物中，任何酶都可以相當于每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白質的量加入，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白質，特別是每升洗滌液0.1-1mg酶蛋白質。在清潔劑組合物中，本發(fā)明具有增強分解纖維素活性的多肽可以相當于每升洗滌液0.001-100mg蛋白質、優(yōu)選0.005-50mg蛋白質、更優(yōu)選0.01-25mg蛋白質、甚至更優(yōu)選0.05-10mg蛋白質、最優(yōu)選0.05-5mg蛋白質、且甚至最優(yōu)選0.01-1mg蛋白質的量加入。還可將本發(fā)明具有增強分解纖維素活性的多肽添加到如WO97/07202所公開的洗滌劑制劑中，這里收入所述文獻作為參考。其他用途一般而言，可以通過補充本發(fā)明具有增強分解纖維素活性的多肽來增強對任何植物細胞壁材料的處理。信號肽本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白質的基因且該基因與如下核苷酸序列可操作連接的核酸構建體，所述核苷酸序列由SEQIDNO1第1至66位核苷酸組成并編碼由SEQIDNO2第1至22位氨基酸組成的、容許所述蛋白質分泌到培養(yǎng)基中的信號肽，其中所述基因對于所述核酸序列而言是外源的。本發(fā)明還涉及含有這種核酸構建體的重組表達載體和重組宿主細胞。本發(fā)明還涉及生產蛋白質的方法，包括(a)在有助于產生所述蛋白質的條件下培養(yǎng)所述重組宿主細胞；并(b)回收所述蛋白質。對宿主細胞所述蛋白質可以是天然的或異源的。術語“蛋白質”在本文中不是指規(guī)定長度的編碼產物，而是涵蓋肽、寡肽、和蛋白質。術語“蛋白質”還涵蓋兩種或多種多肽組合形成編碼產物。蛋白質還包括雜合多肽，它包括來自于至少兩種不同蛋白質的部分或完整多肽序列的組合，其中所述一種或多種蛋白質對宿主細胞可以是異源的或天然的。蛋白質還包括上述蛋白質和雜合蛋白的天然存在的等位和改造(engineered)變異。優(yōu)選的是，蛋白質是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報道分子。在一個更優(yōu)選的方面，蛋白質是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、或連接酶。在一個甚至更優(yōu)選的方面，蛋白質是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突變酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。所述基因可從任何原核的、真核的、或其它來源中獲得。本發(fā)明可通過下列實施例進一步說明，這些實施例不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例材料用作緩沖液和底物的化學制品至少是試劑級的商品。菌株使用橙色嗜熱子囊菌菌株NN044936T002-5作為具有增強分解纖維素活性的GH61家族多肽的來源。使用米曲霉JaL250菌株(WO99/61651)來表達具有增強分解纖維素活性的橙色嗜熱子囊菌多肽。培養(yǎng)基用于橙色嗜熱子囊菌的常規(guī)涂板和培養(yǎng)的固體馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)基的組成是每升39克馬鈴薯右旋糖瓊脂(DifcoBDBiosciences，F(xiàn)ranklinLakes，NJ)。用于橙色嗜熱子囊菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基的組成是每升24克馬鈴薯右旋糖肉湯。Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基的組成是每升10g胰胨、5g酵母提取物、和10gNaCl。同樣也制備用于涂布的LB培養(yǎng)基，只是每升添加15g瓊脂。將5’-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal；GoldBiotechnology，Louis，MO)以每毫升40μg的儲液濃度溶解在N，N’-二甲基甲酰胺中，常規(guī)涂布在LB平板上用于差異菌落篩選。氨芐青霉素以每升50-100mg的終濃度添加到LB培養(yǎng)基中，用于選擇性生長條件。NNCYP培養(yǎng)基的組成是每升5.0gNH4NO3、0.5gMgSO4·7H2O、0.3gCaCl2、2.5g檸檬酸、5.0g細菌蛋白胨、1.0g酵母提取物、COVE痕量金屬、和足夠的K2HPO4以達到最終pH大約5。Cove痕量金屬溶液的組成是每升0.04gNa2B4O7·10H2O、0.4gCuSO4·5H2O、1.2gFeSO4·7H2O、0.7gMnSO4·H2O、0.8gNa2MoO2·2H2O、和10gZnSO4·7H2O。實施例1基因組DNA文庫構建從橙色嗜熱子囊菌生長的PDA平板上取一塊瓊脂，接種裝有200ml含3％葡萄糖、pH5.0的NNCYP培養(yǎng)基的500毫升帶擋板燒瓶。將培養(yǎng)物于45℃振蕩培養(yǎng)過夜，轉速170rpm。通過Whatman#1濾紙(WhatmanInc，CliftonNJ)過濾收集菌絲體并在液氮中冷凍。在已冷卻的研缽中將冷凍的菌絲體研磨成粉末并分裝到帶螺旋帽的試管中。將粉末懸浮在總體積40ml的含0.5％十二烷基硫酸鋰和0.5mMEDTA的50mMCAPS-NaOH緩沖液中。將懸浮液置于60℃并周期性地顛倒混合2小時。再加入等體積的經(jīng)中和的苯酚∶氯仿(1∶1)，并將試管在轉臺上于37℃混合2小時。在SorvallH1000B轉頭(Kendro，Asheville，NC)中以2500rpm離心10分鐘后，再提取出水相并如上所述進行離心。向第二次抽提的水相加入乙酸銨至2.5M并置于-20℃直到凍結。融化后，將提取物以15,000×g離心20分鐘。棄去沉淀物，通過添加0.7倍體積的異丙醇使上清液中的核酸沉淀。以15,000×g離心后，將沉淀物用70％乙醇漂洗三次，風干，并溶于1.0ml0.1XTE中。通過添加乙酸銨到2.0M和乙醇到63％使溶解的沉淀物再一次沉淀。將沉淀物用70％乙醇漂洗兩次，干燥，并溶于200μl0.1XTE中。一旦溶解，向DNA加KCl到20mM。利用TOPO_ShotgunSubcloningKit即亞克隆試劑盒(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)構建橙色嗜熱子囊菌的基因組文庫。根據(jù)制造商的推薦，在氬氣下通過噴霧隨機剪切基因組DNA。通過TAE緩沖液中1％瓊脂糖凝膠上的制備性凝膠電泳，挑選2.5-5.0kb大小的插入物。根據(jù)制造商的說明，將基因組DNA克隆到pCR_4Blunt-TOPO中，并用于轉化大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen，Inc，Carlsbad，CA)。通過在上文所述補充有氨芐青霉素和X-Gal的LB瓊脂上的初始涂布，估計產生了大約64,000個克隆。在測定重組克隆的滴度后立即擴增文庫。將每個轉化反應用于接種200ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。然后于37℃過夜培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)物至飽和，再通過堿裂解法提取質粒DNA并利用QiagenPlasmidMaxi試劑盒進行純化。隨后將擴增的文庫通過再轉化并將大腸桿菌TOP10細胞涂布在上文所述補充有氨芐青霉素和X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上來產生用于克隆分離克隆的菌落。根據(jù)制造商的說明，利用Q-Pix機械臂進行菌落挑取。最初將總共22,353個單獨的菌落挑取到96孔板中，然后在上文培養(yǎng)基部分概述的選擇性條件下培養(yǎng)，并于-80℃以甘油原種的形式保存。實施例2滾環(huán)擴增和微陣列的印制開發(fā)了用于滾環(huán)擴增(RCA)和產物稀釋的機械臂法，以用于BiomekFX機械臂(BeckmanCoulter，Brea，CA)。將TempliPhiDNA測序模板擴增試劑盒(AmershamBiosciencesCorp.，Piscataway，NJ)用于RCA，并在機械臂法中遵照制造商的方案。對來自文庫的9,972個克隆進行RCA反應。從文庫的9,600個RCA產物中制備出雙份384孔稀釋平板(Genemate，Kaysville，UT)，并將這些克隆印在聚L-賴氨酸包被的載玻片上從而得到微陣列，每個微陣列呈現(xiàn)大約33Mb克隆的DNA。另外，將橙色嗜熱子囊菌cbhl(登記號AX657575)和xynA(登記號AJ132635)基因點在上面作為陽性對照，并包括空的pCR_4Blunt-TOPO載體和從未轉化大腸桿菌細胞制備的RCA作為陰性對照。利用美國專利號5,807,522描述的方法進行陣列印制。實施例3發(fā)酵和RNA提取所有的發(fā)酵都是在2升Applikon發(fā)酵罐中進行的，分批補料5.2％(w/v)葡萄糖或5.2％纖維素碳源?；A培養(yǎng)基是NNCYP，且纖維素培養(yǎng)物還含有0.4％葡萄糖以促進初始細胞生長。在發(fā)酵期間通過添加氫氧化銨或磷酸來控制pH。發(fā)酵于42℃pH5進行大約120小時。在接種后第1-5天采取菌絲體樣品。通過MiraclothTM(Calbiochem，SanDiego，CA)過濾迅速從培養(yǎng)基中分離菌絲體樣品，然后在液氮中冷凍并保存于-80℃。遵照制造商的方案，用FastRNA_試劑盒(Q·BIOgene，Carlsbad，CA)從菌絲體樣品中提取RNA。通過在TBE緩沖液中在1％瓊脂糖凝膠上于55V進行1-1.5小時的電泳，或通過使用Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies，SantaClara，CA)進行的毛細管電泳分析，評估RNA的質量。通過紫外分光光度法和/或Agilent2100生物分析儀的分析進行定量測定。只有來自發(fā)酵第2、3和4天的樣品一貫產生足夠品質以用于微陣列實驗的RNA。實施例4熒光探針構建和微陣列雜交橙色嗜熱子囊菌樣品的低RNA產量必需利用線性放大方法(aRNA擴增)以產生足夠數(shù)量以用于微陣列雜交的RNA。遵循制造商的說明，用氨基烯丙基MessageAmpTMaRNA試劑盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)進行RNA的擴增和熒光標記。簡單的說，通過以T7Oligo(dT)引發(fā)的反轉錄，從2μg總RNA產生cDNA第一鏈。隨后用T7啟動子引物合成cDNA第二條鏈。純化雙鏈cDNA，并加到體外轉錄反應中以產生aRNA的多拷貝。氨基烯丙基-dUTP在體外轉錄中摻入aRNA，便于隨后熒光花青染料的標記。純化所得aRNA，并根據(jù)制造商的說明，通過將Cy3和Cy5熒光團(CyeDyePost標記反應染料，AmershamPharmaciaBiotech，ArlingtonHeights，IL)直接偶聯(lián)到aRNA上的經(jīng)氨基烯丙基修飾的UTP殘基上來進行標記。將熒光探針合并，純化，并在真空下干燥，然后將其重懸浮于15.5μl水中并加入3.6μl20XSSC、2.5μl250mMHEPES(pH7.0)、1.8μlpoly-dA(500μg/ml)、和0.54μl10％SDS。雜交前，用0.22μm濾器過濾溶液，加熱至100℃2分鐘并冷卻至室溫。在蓋玻片下，將探針(Cy3-和Cy5-標記的aRNA各5μg)施加到微陣列上，并置于濕潤的小室中。于63℃雜交過夜(15-16小時)。掃描前，將陣列用含0.03％SDS的1XSSC、0.2XSSC、和0.05XSSC連續(xù)順序洗滌，并在桌面式離心機(SorvallR7，RTH-250轉子；Asheville，NC)中以500rpm離心2分鐘以除去多余的液體。用AxonGenePix_4000B掃描儀(AxonInstruments，Inc.，UnionCity，CA)對微陣列載玻片進行成像。然后根據(jù)制造商的說明用GenePix_Pro5.0軟件進行影像和數(shù)據(jù)分析。用GenePix_軟件測量微陣列斑點的熒光強度值，并在減去默認背景后計算每個斑點的Cy5與Cy3強度的比值。挑選重復陣列中Cy5/Cy3的強度比為2.0或更大的斑點用于DNA序列分析。微陣列分析后，從保存于-80℃的甘油細胞懸液中挑選并分離感興趣的克隆。通過堿裂解法制備用于測序的DNA。用位于pCR_4Blunt-TOPO載體的多接頭側翼的T7和M13反向引物(MWGBiotech，Inc.，HighPoint，NC)對每個克隆進行測序。用全新的序列設計引物，以延長已知序列，隨后通過此引物步移策略得到全長克隆。首先在DNA水平上利用blast(n)算法(Altschul等人，1990，JournalofMolecularBiology215403-410)尋找同一性。隨后將DNA序列在六個可能的讀碼框中的假定翻譯物與公眾數(shù)據(jù)庫(例如SwissProt、Swall、Trembl、Genpept和GeneseqP)條目利用fasty(Pearson等人，1997，Genomics4624-36)和tblast(x)(Altschul等人，1990，同上)進行對比。實施例5pAILo2表達載體的構建表達載體pAILo1是通過修飾pBANe6(美國專利6,461,837)而構建的，它包含NA2-tpi啟動子、黑曲霉淀粉葡糖苷酶終止子序列(AMG終止子)、和構巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)。pBANe6的修飾是如下進行的，即首先通過定點誘變從amdS選擇標記除去位于2051、2722、和3397bp位置的三個NcoI限制位點。所有改變設計為“沉默的”，使得amdS基因的實際蛋白質序列不改變。三個位點的清除是利用GeneEditor定點誘變試劑盒(Promega，Madison，WI)根據(jù)制造商的說明使用下面的引物(標有下劃線的核苷酸代表改變的堿基)同時進行的AMDS3NcoMut(2050)5’-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3’(SEQIDNO3)AMDS2NcoMut(2721)5’-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3’(SEQIDNO4)AMDS1NcoMut(3396)5’-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3’(SEQIDNO5)然后將包含所有三種期望序列改變的質粒利用QuickChange誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)進行定點誘變，以消除位于第1643位的AMG終止子末端的NcoI限制位點。將下列引物(標有下劃線的核苷酸代表改變的堿基)用于誘變用于誘變黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)終止子序列的上游引物5’-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3’(SEQIDNO6)用于誘變黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)終止子序列的下游引物5’-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’(SEQIDNO7)修飾pBANe6的最后一步是利用QuickChange誘變試劑盒和下列引物(標有下劃線的核苷酸代表改變的堿基)在多接頭始端插入一個新的NcoI限制位點，從而產生pAILo1(圖2)。用于誘變黑曲霉淀粉酶啟動子(NA2-tpi)的上游引物5’-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3’(SEQIDNO8)用于誘變黑曲霉淀粉酶啟動子(NA2-tpi)的下游引物5’-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3’(SEQIDNO9)用構巢曲霉pyrG基因替換pAILo1的amdS基因。將質粒pBANe10(圖3)用作pyrG基因的來源。分析pBANe10的序列表明pyrG標記包含在NsiI限制片段中，并且不含NcoI或PacI限制位點。因為amdS的也為NsiI限制位點所側翼包夾，所以用于轉換選擇標記的策略是進行NsiI限制片段的簡單替換。用限制酶NsiI消化來自pAILo1和pBANe10的質粒DNA，并利用標準程序通過瓊脂糖凝膠電泳純化產物。將源自pBANe10的含有pyrG基因的NsiI片段連接到pAILo1骨架中以替換包含amdS基因的原始NsiIDNA片段。通過限制消化分析重組克隆以測定它們是否含有正確的插入片段和方向是否正確。選擇以反時針方向轉錄pyrG基因的克隆。新的質粒稱為pAILo2(圖4)。實施例6米曲霉表達載體的構建設計如下的兩條合成寡核苷酸引物，從編號3基因組克隆PCR擴增編碼假定GH61A家族的橙色嗜熱子囊菌基因。無需限制消化和連接，使用InFusion克隆試劑盒(BDBiosciences，PaloAlto，CA)將片段直接克隆到表達載體pAILo2中。正向引物5’-CACAACTGGATTTACCATGTCCTTTTCCAAG-3’(SEQIDNO10)反向引物5’-AGTCACCTCTAGTTATTAACCAGTATACAG-3’(SEQIDNO11)粗體字母代表編碼序列。剩余序列與pAILo2的插入位點是同源的。將上述每種引物各200pmol用于終體積50μl的PCR反應，其組成是代表含有GH61A編碼序列的原始橙色嗜熱子囊菌編號3基因組克隆的DNA、10mMKCl、20mMTris-HClpH8.8、10mM(NH4)2SO4、2mMMgSO4、0.1％TritonX-100、200μl每種脫氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)、和2個單位VentR_DNA聚合酶(所有PCR相關的酶和試劑都來自NewEnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA)。擴增條件為1個循環(huán)的95℃1分鐘；30個循環(huán)每個94℃30秒、50℃30秒、72℃1分鐘；及最后一個循環(huán)72℃7分鐘。然后將加熱塊轉到4℃浸泡(soak)循環(huán)。然后用InFusion克隆試劑盒根據(jù)制造商的說明將片段克隆到pAILo2表達載體中。用NcoI和PacI在制造商推薦的條件下消化載體。用MinEluteTMReactionCleanupKit(QIAGEN，Valencia，CA)純化片段。將基因片段和線性化載體在反應中連接起來，產生表達質粒pDZA2(圖5)，其中GH61A家族基因的轉錄處于NA2-tpi啟動子的控制之下。質粒pDZA2缺失pAlLo2的152bp。連接反應含有大約100ng經(jīng)NcoI和PacI消化的pAlLo2及100ng純化的橙色嗜熱子囊菌GH61APCR產物。連接條件按照Infusion克隆試劑盒制造商的方案。用連接產物轉化大腸桿菌XL1-Blue亞克隆級感受態(tài)細胞(Stratagene，LaJolla，CA)。通過對由大腸桿菌純化的質粒的GH61A編碼序列進行DNA測序來確認構建體的身份。將一個含有重組質粒的克隆命名為大腸桿菌pDZA2-7。實施例7編碼具有增強分解纖維素活性的GH61家族多肽的橙色嗜熱子囊菌基因組序列的鑒定使用AppliedBiosystems3700型自動DNA測序儀利用3.1版BigDye終止物化學法和dGTP化學法(AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)osterCity，CA)和引物步移策略對橙色嗜熱子囊菌GH61A基因組克隆15進行DNA測序。利用VectorNTI8套裝軟件包(Informax，Inc.，F(xiàn)rederick，MD)的ContigExpress組件裝配和比較核苷酸序列。圖1顯示了具有增強分解纖維素活性的橙色嗜熱子囊菌多肽的核苷酸序列(SEQIDNO1)和推導的氨基酸序列(SEQIDNO2)。該編碼序列編碼250個氨基酸的蛋白質。該編碼序列有799bp，包含終止密碼子，中間有46bp的單一內含子。編碼區(qū)有48.7％的G+C。利用SignalP程序(Nielsen等人，1997，ProteinEngineering101-6)，預測了22個氨基酸殘基的信號肽，表明成熟多肽含有228個氨基酸。利用blastp算法(Higgins，1989，同上)使用ParacelBioViewWorkbench軟件(Paracel，Pasadena，CA)及blosum62矩陣測定了氨基酸序列的比較性對比。成對比對參數(shù)采用的是缺口罰分，存在(existence)11和延伸(extension)1。該比對表明編碼具有增強分解纖維素活性的GH61家族多肽的橙色嗜熱子囊菌基因的推導氨基酸序列與來自構巢曲霉推測蛋白AN1041.2(登錄號EAA65609)、構巢曲霉推測蛋白AN7891.2(登錄號EAA59545)、和構巢曲霉推測蛋白AN9524.2(登錄號EAA66740)的61家族蛋白質推導氨基酸序列分別享有67％、63％、和58％的同一性。含有質粒pDZA2-7的大腸桿菌XL1-Blue(Stratagene，LaJolla，CA)保藏于農業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物保藏中心，北方區(qū)域研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter，1815UniversityStreet，Peoria，Illinois，61604)，保藏編號NRRLB-30704，保藏日期2004年1月30日。實施例8編碼具有增強分解纖維素活性的GH61A家族多肽的橙色嗜熱子囊菌基因在米曲霉JaL250中的表達根據(jù)Christensen等人，1988，Bio/Technology61419-1422的方法制備米曲霉JaL250原生質體。用大約1.5μgpDZA2轉化米曲霉JAL250。以質粒pAILo2作為對照。用pDZA2轉化米曲霉JaL250獲得大約11個轉化體。將10個轉化體分離到單獨的PAD板上。用5ml0.01％吐溫20洗滌所有轉化體的鋪滿的PDA板，分別接種125ml玻璃搖瓶中的25mlMDU2BP培養(yǎng)基，并于34℃以250rpm進行培養(yǎng)。保溫6天后，使用8-16％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)根據(jù)制造商的說明分析取自每份培養(yǎng)物的5μl上清液。SDS-PAGE分析顯示，10個轉化體中有9個轉化體的GH61A帶以略微大于25kDa的表觀分子量進行遷移。實施例9具有增強分解纖維素活性的橙色嗜熱子囊菌GH61A的鑒定在美國能源部國家再生能源實驗室(theU.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory，NREL)用稀硫酸對玉米秸桿進行預處理。預處理條件如下于190℃，0.048g硫酸/g干生物量，25％w/w干固體，大約1分鐘。根據(jù)NREL，在經(jīng)過預處理的玉米秸桿(PCS)中不溶于水的固體含有52％纖維素、3.6％半纖維素和29.8％木質素。纖維素和半纖維素是利用NREL標準分析程序#002通過兩級硫酸水解及后續(xù)高效液相色譜對糖類的分析而測定的。木質素是利用NREL標準分析程序#003在用硫酸水解纖維素和半纖維素成分后通過重量測定而測定的。在酶促水解前，用大量的DDI水洗滌PCS；水洗后的PCS的干重為20.6％。如實施例8所述在米曲霉中表達橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽，將培養(yǎng)液以9500xg離心，然后利用裝備有PM10膜(Millipore，Billerica，MA)的Amicon攪拌器濃縮上清液，并利用Econo-Pac10DG柱(BioRadLaboratories，Hercules，CA)脫鹽。用1.1mlImmunoware微量試管(Pierce，Rockford，IL)進行PCS(每ml50mMpH5.0乙酸鈉緩沖液10mg)水解，總反應體積1.0ml。對橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽測試其增強纖維素酶制備物水解能力的能力，所述纖維素酶制備物是從NovozymesA/S(Bagsv_rd，丹麥)獲得的、由表達米曲霉β-葡糖苷酶的瑞氏木霉(WO02/095014)發(fā)酵得到的，下稱Tr/AoBG。PCS水解的進行是采用每克PCS2.5mgTr/AoBG，且每克PCS補充0.2mg橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽。于50℃(TSAutoflowCO2夾套保溫箱)進行PCS水解。進行兩份同樣的反應，而且在水解期間采集小樣。將每份水解產物的20μl小樣與180μl0.11MNaOH(終止試劑)混和，使PCS水解反應終止。對每份樣品進行適當?shù)倪B續(xù)稀釋，利用對羥基苯甲酸酰肼(PHBAH，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)測定法來測定還原糖含量，該測定法經(jīng)修改適應96孔微量滴定板格式，如下所述。簡單的說，將適當稀釋樣品的90ul小樣置于96孔錐底微量滴定板中。向每個孔中加入60μl溶于2％NaOH的1.5％(w/v)PHBAH以起動反應。將平板于95℃加熱10分鐘，不加蓋。使平板冷卻至室溫(RT)，并向每個孔中加入50μl蒸餾H2O。從每個孔中取出100μl小樣轉移到平底96孔板中，并用SpectraMax微板讀數(shù)儀(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)測量A410nm的吸光率。用葡萄糖標準品(0.1-0.0125mg/ml，用0.4％氫氧化鈉稀釋)制備標準曲線，將得到的A410nm值轉換成葡萄糖的相當量。用所得的相當量計算每個反應PCS纖維素轉化的百分比。利用下面的方程式計算纖維素轉化成還原糖的程度(轉化，％)轉化(％)＝RS(mg/ml)*100*162/(纖維素(mg/ml)*180)＝＝RS(mg/ml)*100/(纖維素(mg/ml)*1.111)在此方程式中，RS是溶液中按葡萄糖相當量(mg/ml)計量的還原糖濃度，而系數(shù)1.111反映了纖維素轉化成葡萄糖時的重量增量。表1概括給了通過單獨的Tr/AoBG(2.5mg/gPCS)或者補充橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽(每克PCS0.2mg)的纖維素轉化。表1由單獨的Tr/AoBG或補充橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽的Tr/AoBG于50℃pH5.0保溫115小時的纖維素轉化表1顯示了橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽增強了Tr/AoBG對PCS的活性。在115小時后，橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽自身(每克PCS0.2mg)僅產生低于0.7％的纖維素轉化。補充0.2mg橙色熱質囊菌GH61A多肽的2.5mgTr/AoBG所產生的纖維素轉化要高于3.5mgTr/AoBG，表明橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽增強了Tr/AoBG對PCS的活性，且Tr/AoBG和橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽之間有協(xié)同效應。生物材料的保藏下列生物材料已按照布達佩斯條約保藏于農業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物保藏中心，北方區(qū)域研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter，1815UniversityStreet，Peoria，Illinois，61604)，并給出下列登記號保藏物保藏號保藏日期大腸桿菌菌株pDZA2-7NRRLB-307042004-01-30該菌株已經(jīng)在如下條件下進行保藏，即根據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C§122，確保在本專利申請的審查過程中由授權的專利與商標官員所指定的人員能夠獲得該培養(yǎng)物。所述保藏物是所述保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交本申請副本或其后代的國家中，根據(jù)外國專利法的要求可以提供上述保藏物。但是，應該理解的是可以獲得保藏物并不構成這樣的許可，即實施本發(fā)明侵害了由政府授予的專利權。本文描述并要求的發(fā)明并不限于本文所公開的具體實施方案的范圍，因為這些實施方案意圖在于舉例說明本發(fā)明的幾個方面。任何等同的實施方案意圖包括在本發(fā)明的范圍內。當然，根據(jù)上文描述，除本文所顯示和描述的之外，對本發(fā)明的各種修改對本領域技術人員而言應是顯而易見的。這些修改也應包括在所附權利要求的范圍內。一旦出現(xiàn)沖突，將以包括定義在內的本公開為準。本文引用了多份參考文獻，完整引入其公開書作為參考。關于微生物保藏的說明(細則13之二)PCT/RO/134表(1992年7月)序列表<110>諾維信股份有限公司(NovozymesBiotech，Inc.)<120>具有增強分解纖維素活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸<130>10602.204-WO<150>60/542,614<151>2004-02-06<160>11<170>PatentInversion3.2<210>1<211>799<212>DNA<213>橙色熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)<400>1atgtccttttccaagataattgctactgccggcgttcttgcctctgcttctctagtggct60ggccatggcttcgttcagaacatcgtgattgatggtaaaaagtatgtcattgcaagacgc120acataagcggcaacagctgacaatcgacagttatggcgggtatctagtgaaccagtatcc180atacatgtccaatcctccagaggtcatcgcctggtctactacggcaactgatcttggatt240tgtggacggtactggataccaaaccccagatatcatctgccataggggcgccaagcctgg300agccctgactgctccagtctctccaggaggaactgttgagcttcaatggactccatggcc360tgattctcaccatggcccagttatcaactaccttgctccgtgcaatggtgattgttccac420tgtggataagacccaattagaattcttcaaaattgccgagagcggtctcatcaatgatga480caatcctcctgggatctgggcttcagacaatctgatagcagccaacaacagctggactgt540caccattccaaccacaattgcacctggaaactatgttctgaggcatgagattattgctct600tcactcagctcagaaccaggatggtgcccagaactatccccagtgcatcaatctgcaggt660cactggaggtggttctgataaccctgctggaactcttggaacggcactctaccacgatac720cgatcctggaattctgatcaacatctatcagaaactttccagctatatcatccctggtcc780tcctctgtatactggttaa799<210>2<211>250<212>PRT<213>橙色熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)<400>2MetSerPheSerLysIleIleAlaThrAlaGlyValLeuAlaSerAla151015SerLeuValAlaGlyHisGlyPheValGlnAsnIleValIleAspGly202530LysLysTyrTyrGlyGlyTyrLeuValAsnGlnTyrProTyrMetSer354045AsnProProGluValIleAlaTrpSerThrThrAlaThrAspLeuGly505560PheValAspGlyThrGlyTyrGlnThrProAspIleIleCysHisArg65707580GlyAlaLysProGlyAlaLeuThrAlaProValSerProGlyGlyThr859095ValGluLeuGlnTrpThrProTrpProAspSerHisHisGlyProVal100105110IleAsnTyrLeuAlaProCysAsnG1yAspCysSerThrValAspLys115120125ThrGlnLeuGluPhePheLysIleAlaGluSerGlyLeuIleAsnAsp130135140AspAsnProProGlyIleTrpAlaSerAspAsnLeuIleAlaAlaAsn145150155160AsnSerTrpThrValThrIleProThrThrIleAlaProGlyAsnTyr165170175ValLeuArgHisGluIleIleAlaLeuHisSerAlaGlnAsnGlnAsp180185190GlyAlaGlnAsnTyrProGlnCysIleAsnLeuGlnValThrGlyGly195200205GlySerAspAsnProAlaGlyThrLeuGlyThrAlaLeuTyrHisAsp210215220ThrAspProGlyIleLeuIleAsnIleTyrGlnLysLeuSerSerTyr225230235240IleIleProGlyProProLeuTyrThrGly245250<210>3<211>22<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillusniger)<400>3gtgccccatgatacgcctccgg22<210>4<211>26<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillusniger)<400>4gagtcgtatttccaaggctcctgacc26<210>5<211>24<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillusniger)<400>5ggaggccatgaagtggaccaacgg24<210>6<211>45<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillusniger)<400>6caccgtgaaagccatgctctttccttcgtgtagaagaccagacag45<210>7<211>45<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillusniger)<400>7ctggtcttctacacgaaggaaagagcatggctttcacggtgtctg45<210>8<211>44<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillusniger)<400>8ctatatacacaactggatttaccatgggcccgcggccgcagatc44<210>9<211>44<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillusniger)<400>9gatctgcggccgcgggcccatggtaaatccagttgtgtatatag44<210>10<211>31<212>DNA<213>橙色熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)<400>10cacaactggatttaccatgtccttttccaag31<210>11<211>30<212>DNA<213>橙色熱子囊菌(Thcrmoascusaurantiacus)<400>11agtcacctctagttattaaccagtatacag30權利要求1.選自下列的具有增強分解纖維素活性的分離多肽(a)具有如下氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與SEQIDNO2第23至250位氨基酸具有至少70％的同一性；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在至少低嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交；和(c)在SEQIDNO2第23至250位氨基酸中包含一個或多個氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的變體。2.權利要求1的多肽，具有與SEQIDNO2第23至250位氨基酸具有至少70％同一性的氨基酸序列。3.權利要求2的多肽，具有與SEQIDNO2第23至250位氨基酸具有至少75％同一性的氨基酸序列。4.權利要求3的多肽，具有與SEQIDNO2第23至250位氨基酸具有至少80％同一性的氨基酸序列。5.權利要求4的多肽，具有與SEQIDNO2第23至250位氨基酸具有至少90％同一性的氨基酸序列。6.權利要求5的多肽，具有與SEQIDNO2第23至250位氨基酸具有至少95％同一性的氨基酸序列。7.權利要求6的多肽，具有與SEQIDNO2第23至250位氨基酸具有至少97％同一性的氨基酸序列。8.權利要求1-7中任一項的多肽，包含SEQIDNO2的氨基酸序列。9.權利要求1-8中的多肽，由SEQIDNO2或其具有增強纖維素分解活性的片段組成。10.權利要求9的多肽，由SEQIDNO2組成。11.權利要求9的多肽，由SEQIDNO2第23至250位氨基酸組成。12.權利要求1的多肽，由在至少中等嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交的多核苷酸編碼。13.權利要求1的多肽，由在至少中等-高嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交的多核苷酸編碼。14.權利要求1的多肽，由在至少高嚴緊條件下與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈發(fā)生雜交的多核苷酸編碼。15.權利要求1的多肽，其中所述多肽是在SEQIDNO2第23至250位氨基酸中包含一個或多個氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的變體。16.權利要求1的多肽，由質粒pDZA2-7所含多核苷酸編碼，所述質粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。17.包含編碼權利要求1-16任一項的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。18.權利要求17的分離多核苷酸，在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中突變的核苷酸序列編碼由SEQIDNO2第23至250位氨基酸組成的多肽。19.包含權利要求17或18的多核苷酸的核酸構建體，所述多核苷酸與指導多肽在表達宿主中產生的一種或多種控制序列可操作連接。20.包含權利要求18的核酸構建體的重組表達載體。21.包含權利要求18的核酸構建體的重組宿主細胞。22.生產權利要求1-16任一項的多肽的方法，包括(a)在有利于多肽產生的條件下培養(yǎng)細胞，該細胞的野生型形式能夠產生所述多肽；并(b)回收所述多肽。23.生產權利要求1-16任一項的多肽的方法，包括(a)在有利于多肽產生的條件下培養(yǎng)包含如下核酸構建體的宿主細胞，該核酸構建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；并(b)回收所述多肽。24.生產親本細胞突變體的方法，包括破壞或刪除編碼權利要求1-16任一項的多肽的核苷酸序列，導致突變體產生的多肽要比親本細胞少。25.通過權利要求24的方法產生的突變細胞。26.權利要求24的突變細胞，還包含編碼天然或異源蛋白的基因。27.生產蛋白質的方法，包括(a)在有利于蛋白質產生的條件下培養(yǎng)權利要求26的突變細胞；并(b)回收所述蛋白質。28.通過如下獲得的分離多核苷酸，即(a)在中等嚴緊條件下使DNA群體與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈進行雜交；并(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸，其編碼具有增強分解纖維素活性的多肽。29.權利要求28的分離多核苷酸，其通過如下獲得，即(a)在中等-高嚴緊條件下使DNA群體與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈進行雜交；并(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸，其編碼具有增強分解纖維素活性的多肽。30.權利要求29的分離的多核苷酸，其通過如下獲得，即(a)在高嚴緊條件下使DNA群體與(i)SEQIDNO1第67至805位核苷酸，(ii)SEQIDNO1第67至805位核苷酸所含cDNA序列，或(iii)，(i)或(ii)的互補鏈進行雜交；并(b)分離發(fā)生雜交的多核苷酸，其編碼具有增強分解纖維素活性的多肽。31.產生具有突變核苷酸序列的多核苷酸的方法，包括(a)在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中引入至少一個突變，其中突變的核苷酸序列編碼由SEQIDNO2第23至250位氨基酸組成的多肽；并(b)回收包含突變核苷酸序列的多核苷酸。32.通過權利要求31的方法產生的突變多核苷酸。33.生產多肽的方法，包括(a)在有利于多肽產生的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的權利要求32的突變多核苷酸的細胞；并(b)回收所述多肽。34.包含編碼蛋白質的基因的核酸構建體，其中所述基因可操作連接由SEQIDNO1第1至66位核苷酸組成的編碼信號肽的核苷酸序列，其中所述基因對于所述核苷酸序列而言是異源的。35.包含權利要求34的核酸構建體的重組表達載體。36.包含權利要求34的核酸構建體的重組宿主細胞。37.生產蛋白質的方法，包括(a)在有利于蛋白質產生的條件下培養(yǎng)權利要求36的重組宿主細胞；并(b)回收所述蛋白質。38.生產權利要求1-16任一項的多肽的方法，包括(a)在有利于多肽產生的條件下培養(yǎng)包含如下多核苷酸的轉基因植物或植物細胞，該多核苷酸編碼本發(fā)明具有增強分解纖維素活性的多肽；并(b)回收所述多肽。39.經(jīng)編碼權利要求1的多肽的多核苷酸轉化的轉基因植物、植物部分或植物細胞。40.含有權利要求1-16任一項的具有增強分解纖維素活性的多肽、纖維素分解活性、和表面活性劑的清潔劑組合物。41.降解或者轉化纖維素材料的方法，包括在存在有效量的權利要求1-16任一項的具有增強分解纖維素活性的多肽時，用有效量的分解纖維素的蛋白質處理纖維素材料，其中與不存在具有增強分解纖維素活性的多肽時相比，具有增強分解纖維素活性的多肽的存在增加纖維素材料的降解。42.權利要求41的方法，其中纖維素材料選自草本植物材料、農業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙、以及紙漿和造紙廠的殘余物。43.權利要求41的方法，其中纖維素材料是玉米秸桿。44.權利要求41的方法，其中一種或多種纖維素分解酶選自纖維素酶、內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。45.權利要求41的方法，還包括用有效量的一種或多種選自半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、或過氧化物酶的酶處理纖維素材料。46.權利要求41的方法，其中所述方法是預處理方法。47.權利要求41的方法，其中所述方法是同步糖化與發(fā)酵方法(SSF)中的步驟。48.權利要求41的方法，其中所述方法是混合水解與發(fā)酵方法(HHF)中的步驟。49.權利要求41的方法，還包括回收降解的纖維素材料。50.權利要求49的方法，其中降解的纖維素材料是糖類。51.權利要求50的方法，其中所述糖類選自葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、和阿拉伯糖。52.權利要求41的方法，其中分解纖維素的蛋白質和/或具有增強分解纖維素活性的多肽是含有或者不含細胞的發(fā)酵液形式。53.生產有機物質的方法，包括(a)在存在有效量的權利要求8的具有增強分解纖維素活性的多肽時，用有效量的分解纖維素的蛋白質糖化纖維素材料，其中與不存在具有增強分解纖維素活性的多肽時相比，具有增強分解纖維素活性的多肽的存在增加纖維素材料的降解；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物對步驟(a)的已糖化纖維素材料進行發(fā)酵；并(c)由發(fā)酵回收有機物質。54.權利要求53的方法，其中纖維素材料選自草本植物材料、農業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙、以及紙漿和造紙廠的殘余物。55.權利要求53的方法，其中纖維素材料是玉米秸桿。56.權利要求53的方法，其中一種或多種纖維素分解酶選自纖維素酶、內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。57.權利要求53的方法，還包括用有效量的一種或多種選自半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、或過氧化物酶的酶處理纖維素材料。58.權利要求57的方法，其中酯酶是脂肪酶、磷脂酶、角質酶、或其混合物。59.權利要求53的方法，其中步驟(a)和(b)在同步糖化和發(fā)酵中同時進行。60.權利要求53的方法，其中有機物質是醇、有機酸、酮、氨基酸、或氣體。61.權利要求60的方法，其中醇是阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨糖醇、或木糖醇。62.權利要求60的方法，其中有機酸是乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富馬酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸、或木糖酸。63.權利要求60的方法，其中酮是丙酮。64.權利要求60的方法，其中氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、或蘇氨酸。65.權利要求60的方法，其中氣體是甲烷、氫、二氧化碳、或一氧化碳。66.權利要求53的方法，其中分解纖維素的蛋白質和/或具有增強分解纖維素活性的多肽是含有或者不含細胞的發(fā)酵液形式。全文摘要本發(fā)明涉及具有增強分解纖維素活性的分離多肽和編碼所述多肽的分離核酸。本發(fā)明還涉及包含所述核酸的核酸構建體、載體、和宿主細胞，以及生產和使用所述多肽的方法。文檔編號C12P1/02GK1965078SQ200580011917公開日2007年5月16日申請日期2005年2月4日優(yōu)先權日2004年2月6日發(fā)明者威廉·多森,詹妮弗·格里尼爾,丁晗澍申請人:諾維信股份有限公司