一種多囊卵巢綜合征伴2型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多囊卵巢綜合征合并2型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建方法，屬于醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型技術(shù)領(lǐng)域。通過給予23日齡斷乳未成年雌性SD大鼠高脂高糖飼料飲食，并每日皮下注射相當(dāng)于DHEA 60 μg/（g·d）的硫酸普拉睪酮鈉90 μg/（g·d） +0.4mL注射用水，連續(xù)20d；然后禁食12小時(shí)，再給予腹腔注射STZ 45mg/100mg體重一次，構(gòu)建而成。本發(fā)明首次成功建立了PCOS伴2型糖尿病模型，該模型構(gòu)建時(shí)間短，成功率高，試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，可重復(fù)性好，成本低廉，是理想的PCOS伴2型糖尿病模型。
【專利說明】
一種多囊卵巢綜合征伴2型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多囊卵巢綜合征合并2型糖尿 病大鼠模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，P⑶S)是育齡婦女最常見的內(nèi) 分泌失調(diào)性疾病，占生育期婦女的10%-15%。常表現(xiàn)為雄激素增高、排卵減少或停止、月經(jīng) 稀少、多毛、痤瘡、肥胖及不孕等癥狀。近年來研究證明PC0S患者普遍存在糖和脂肪代謝異 常，約31%-35%的PC0S患者伴有糖耐量異常（IGT)，7%-10%伴有2型糖尿病，PC0S患者其2 型糖尿病的發(fā)生率是正常婦女的5-10倍，且發(fā)病時(shí)間也提前近30年。
[0003] 2006年外國(guó)學(xué)者提出PC0S女性"青春期發(fā)育亢進(jìn)學(xué)說"由于青春期生長(zhǎng)激素的分 泌量增加，使外周組織對(duì)胰島素的敏感性降低，導(dǎo)致體內(nèi)胰島素水平升高，存在代償性的胰 島素抵抗，但在某些條件的誘導(dǎo)下，可能轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇砸葝u素抵抗，會(huì)持續(xù)到成年期，是 PC0S發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。并且假性性早熟己被確定為女童日后發(fā)展為PC0S的高危因素。
[0004] Sprague Dawley大鼠（SD大鼠）垂體-腎上腺系統(tǒng)功能活躍，常作為垂體、卵巢等內(nèi) 分泌以及腎上腺和應(yīng)激反應(yīng)等方面的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究來說經(jīng)濟(jì)方便。并且SD大 鼠生長(zhǎng)快速，且對(duì)性激素刺激敏感，廣泛用于藥理毒理、營(yíng)養(yǎng)學(xué)及內(nèi)分泌方面等研究。故以 剛離乳SD大鼠作為研究對(duì)象的建模方法符合PC0S的病理生理特征。Anderson等對(duì)脫氫表雄 酮(DHEA)誘導(dǎo)的PC0S大鼠進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)其超微結(jié)構(gòu)改變首先是出現(xiàn)卵母細(xì)胞及透明 帶的消失，然后是空囊樣卵泡的形成。與人類PC0S的病理過程類似。并且DHEA造模法具有 時(shí)間短、成本低的優(yōu)勢(shì)，并且可模擬人類PC0S的內(nèi)分泌改變和卵巢形態(tài)學(xué)改變。其機(jī)制是 DHEA促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞內(nèi)睪酮的合成，使血清睪酮水平升高，而過高的雄激素干擾了卵泡的 生長(zhǎng)成熟導(dǎo)致無排卵。研究結(jié)果顯示，單純DHEA誘導(dǎo)SD大鼠21天后，大鼠滿足高雄激素血 癥，胰島素抵抗的內(nèi)分泌學(xué)改變以及卵巢的多囊樣改變等。造模結(jié)果基本具備了人類PC0S 的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)中PC0S病人的基本病理特征。
[0005] 2型糖尿病的動(dòng)物模型多為化學(xué)藥物如鏈脲佐菌素(Strept〇Z〇t 〇Cin，STZ)損傷誘 導(dǎo)的糖尿病模型、高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型。STZ是一種廣譜抗生素， 具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副作用，對(duì)一定種屬動(dòng)物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇 性的毒性作用，有研究顯示其致動(dòng)物糖尿病的作用機(jī)制包括直接破壞胰島細(xì)胞、激活自身 免疫以及通過一氧化氮和自由基損傷等。低劑量的STZ誘導(dǎo)鼠類辟田胞系INS-1凋亡，高劑量 則導(dǎo)致其壞死等。但單純STZ注射造模，STZ劑量不易控制，且容易建立與人類1型糖尿病表 現(xiàn)相似的動(dòng)物模型，導(dǎo)致成模率及穩(wěn)定性較難控制;高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)的糖 尿病模型具有類似人類2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的特點(diǎn)，是一種理想的2型糖尿病動(dòng)物模型。
[0006] 雖然PC0S大鼠模型及2型糖尿病大鼠模型構(gòu)建技術(shù)已經(jīng)十分成熟，但迄今尚未見 國(guó)內(nèi)外關(guān)于PC0S伴2型糖尿病大鼠模型的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)PC0S伴2型糖尿病實(shí)驗(yàn)技術(shù)的空白，提供一種PC0S伴2型糖尿病大鼠模 型極其造模方法，公開了一種PC0S合并2型糖尿病的大鼠模型的制備方法。
[0008] 實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0009] 1、取21日齡斷乳未成年雌性SD大鼠，喂以顆粒飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2天； [00 10] 2、23日齡開始，給予高脂高糖飼料飲食，并每日皮下注射相當(dāng)于DHEA 60yg/(g · d)的硫酸普拉睪酮鈉(注射用硫酸普拉睪酮鈉，揚(yáng)州奧賽康藥業(yè)有限公司產(chǎn)品）90yg/(g· d) +0.4mL注射用水，連續(xù)20天；
[0011]高脂高糖飼料自行配制，基本配方如下:基礎(chǔ)飼料66.5%，鹿糖20%，豬油10%，膽 固醇2.5%，膽酸鈉1 %;
[0012] 3、20天構(gòu)造 PC0S大鼠模型結(jié)束后，所有大鼠禁食12小時(shí)，再給予PC0S伴2型糖尿病 模型組腹腔注射STZ 45mg/kg體重一次；
[0013] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中將PC0S伴2型糖尿病、P⑶S大鼠模型與正常大鼠模型進(jìn) 行了對(duì)比：
[0014] 將大鼠分為3組，分別為PC0S伴2型糖尿病組，PC0S組以及正常對(duì)照組，每組分別10 只。P⑶S伴2型糖尿病組大鼠給予高脂高糖飼料飲食，并每日皮下注射相當(dāng)于DHEA 60yg/ (g · d)的硫酸普拉睪酮鈉(注射用硫酸普拉睪酮鈉，揚(yáng)州奧賽康藥業(yè)有限公司產(chǎn)品）90yg/ (g · d) +0.4mL注射用水，連續(xù)20d JC0S組大鼠給予普通飼料飲食，并每日皮下注射硫酸普 拉睪酮鈉90yg/(g · d)+0.4ml注射用水，連續(xù)20d。正常對(duì)照組給予普通飼料飲食，并同期每 日皮下注射〇.4ml注射用水，20天構(gòu)造 PC0S大鼠模型結(jié)束后，所有大鼠禁食12小時(shí)，再給予 PC0S伴2型糖尿病模型組腹腔注射STZ 45mg/kg體重一次，PC0S組及對(duì)照組注射等量檸檬酸 鹽緩沖液。于注射后72小時(shí)大鼠用6 %水合氯醛麻醉，打開腹腔，直視下采三組大鼠下腔靜 脈血，取三組胰腺組織及雙側(cè)卵巢組織。測(cè)定大鼠血清性激素和空腹血糖胰島素，并對(duì)大鼠 卵巢及部分胰腺組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片。用于HE染色觀察卵巢和胰腺的病理結(jié)構(gòu)。
[0015] 目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者多采用90天高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗后予以小劑量STZ(30mg/ kg)的方法建立2型糖尿病大鼠模型。但由于PC0S大鼠模型經(jīng)過20天連續(xù)硫酸普拉睪酮鈉注 射后和高脂飲食喂養(yǎng)后通常已經(jīng)表現(xiàn)為胰島素抵抗，故在誘導(dǎo)PC0S后予以STZ低劑量腹腔 注射誘導(dǎo)大鼠血糖濃度及胰島素水平明顯增高符合2型糖尿病特點(diǎn)，其卵巢改變及性激素 水平亦符合PC0S的特征，提示硫酸普拉睪酮鈉聯(lián)合高脂高糖飼料+STZ可復(fù)制與人類相似的 PC0S伴2型糖尿病模型的特點(diǎn)。本發(fā)明首次成功建立了PC0S伴2型糖尿病模型，該模型構(gòu)建 時(shí)間短，成功率高，試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，可重復(fù)性好，成本低廉。是理想的PC0S伴2型糖尿病 模型。
【附圖說明】
[0016] 圖1為HE染色觀察卵巢的病理結(jié)構(gòu)；
[0017] 圖la為PC0S伴2型糖尿病組卵巢組織，圖lb為PC0S組卵巢組織，圖lc為對(duì)照組卵巢 組織，（HE*200);
[0018]圖2為HE染色觀察胰腺的病理結(jié)構(gòu)；
[0019] 圖2a為PC0S伴2型糖尿病組胰腺組織，圖2b為PC0S組胰腺組織，圖2c為對(duì)照組胰腺 組織，（HE*200);
【具體實(shí)施方式】
[0020] 通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施 例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。
[0021 ]注射用硫酸普拉睪酮鈉，揚(yáng)州奧賽康藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。 [0022]高脂高糖飼料自行配制，基本配方如下:基礎(chǔ)飼料66.5%，蔗糖20%，豬油10%，膽 固醇2.5%，膽酸鈉1 %。
[0023]臨用前以0. lmmol/L，PH4.2的檸檬酸鹽緩沖液溶解，新鮮配成1 % STZ溶液，經(jīng)濾菌 器除菌。
[0024]【實(shí)施例1】將PC0S伴2型糖尿?。ê?jiǎn)稱PC0S伴2型DM組）、PC0S大鼠模型與正常大鼠 模型進(jìn)行了對(duì)比
[0025] 1、適應(yīng)性喂養(yǎng)
[0026] 取21日齡斷乳未成年雌性SD大鼠，喂以顆粒飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2天。
[0027] 2、模型構(gòu)建
[0028] 23日齡開始，將大鼠分為3組，分別為PC0S伴2型糖尿病組，P⑶S組以及正常對(duì)照 組，每組分別10只。P⑶S伴2型糖尿病組大鼠給予高脂高糖飼料飲食，并每日皮下注射相當(dāng) 于DHEA 60yg/(g · d)的硫酸普拉睪酮鈉(注射用硫酸普拉睪酮鈉，揚(yáng)州奧賽康藥業(yè)有限公 司產(chǎn)品）90yg/ (g · d) +0.4mL注射用水，連續(xù)20d。PC0S組大鼠給予普通飼料飲食，并每日皮 下注射硫酸普拉睪酮鈉90yg/(g · d)+0.4ml注射用水，連續(xù)20d。正常對(duì)照組給予普通飼料 飲食，并同期每日皮下注射〇.4ml注射用水，20天構(gòu)造 PC0S大鼠模型結(jié)束后，所有大鼠禁食 12小時(shí)，再給予PC0S伴2型糖尿病模型組腹腔注射新鮮配制的STZ，45mg/kg體重一次，P⑶S 組及對(duì)照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。
[0029] 3、獲取樣本
[0030]于注射后72小時(shí)大鼠用6%水合氯醛麻醉，打開腹腔，直視下采三組大鼠下腔靜脈 血，取三組胰腺組織及雙側(cè)卵巢組織。測(cè)定大鼠血清性激素和空腹血糖胰島素，并對(duì)大鼠卵 巢及部分胰腺組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片。用于HE染色觀察卵巢和胰腺的病理結(jié)構(gòu)。
[0031] 4、結(jié)果
[0032] PC0S伴2型糖尿病組及PC0S組（圖la及l(fā)b)可見卵巢皮質(zhì)內(nèi)各級(jí)發(fā)育期卵泡;較多 早期發(fā)育的小卵泡和閉鎖卵泡黃體少見，黃體數(shù)量明顯下降并伴有不完全的黃素化?？梢?多個(gè)囊泡，閉鎖卵泡常見，卵泡多呈囊性擴(kuò)張，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞或放射冠消失，顆粒細(xì)胞層 數(shù)減少(多為2~3層），排列疏松;對(duì)照組（圖lc)大鼠卵巢鏡下見發(fā)育各個(gè)時(shí)期的卵泡和黃 體;顆粒細(xì)胞形態(tài)完整，排列整齊，多為8~9層;卵泡膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞未見增生。
[0033] PC0S伴2型DM組（圖2a)胰腺中胰島少見;胰島萎縮，小胰島多見，胰島都遭到破壞， 細(xì)胞核變形;胰島同周圍腺泡界限不清;而對(duì)照組（圖2c)中胰腺中胰島數(shù)量多;胰島大小均 一，形狀規(guī)則，胰島細(xì)胞較整齊;胰島界限清楚，同周圍腺泡界限分明，沒有病理改變。PC0S 組的表現(xiàn)介于正常組與PC0S伴2型DM組之間（圖2b)。
[0034] PC0S伴2-DM組大鼠空腹血糖(FBG)均彡16.7mmol/L，且評(píng)價(jià)胰島素抵抗的Η0ΜΑ指 數(shù)，空腹胰島素水平(FINS)與對(duì)照組相比明顯增高，差距存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)，提示該 組糖尿病模型造模成功。同時(shí)，P⑶S組的HOMA-IR指數(shù)與對(duì)照組相比亦明顯升高(P〈0.05)， 說明PCOS組的大鼠本身亦存在胰島素抵抗。結(jié)果如表1所示。PCOS組及PCOS伴2-DM組大鼠血 清睪酮(T)與雌二醇(E2)水平顯著高于對(duì)照組(P〈0.05)，而PCOS組及PCOS伴2-DM組之間無 顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。
[0035] 表1造 t旲完成后各組大鼠空腹的各項(xiàng)指標(biāo)(x±s)
[0036]
[0037] 注:與對(duì)照組相比:*P<0.05
[0038] 參考文獻(xiàn)：
[0039] 1.Misugi T，0zaki K，E1 B K，et al.Insulin-lowering agents inhibit synthesis of testosterone in ovaries of DHEA-induced PCOS rats.[J] .Gynecologic&Obstetric Investigation,2006,61(4):208-15.
[0040] 2.張曉薇，鄺健全.脫氫表雄酮誘導(dǎo)多囊卵巢綜合征動(dòng)物模型的研究[J].廣州醫(yī) 學(xué)院學(xué)報(bào)，2000,28(3):14-18.
[0041] 3.Chen Y F,Shibu M A,Fan M J,et al.Purple rice anthocyanin extract protects cardiac function in STZ-induced diabetes rat hearts by inhibiting cardiac hypertrophy and fibrosis.[J].Journal of Nutritional Biochemistry, 2016,31:98-105.
[0042] 4. Feng Fu，F(xiàn)ei Tian,Heping Zhou , et al. Semen Cassiae Attenuates Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in High-Fat Diet Streptozotocin- Induced Type 2Diabetic Rats[J].American Journal of Chinese Medicine,2014,42 (1):95-108.
[0043] 5.Atanasovska E,Tasic V，Slaninka_Miceska M，et al. Six week follow-up of metabolic effects induced by a high-fat diet and streptozotocin in a rodent model of type 2 diabetes mellitus.[J].
[0044] 6.劉亞平，季虹，榮海欽，等.不同性別大鼠在2型糖尿病造模過程中的穩(wěn)定性[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，16(1): 52-55。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多囊卵巢綜合征合并2型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步 驟： 1) 取21日齡斷乳未成年雌性SD大鼠，喂以顆粒飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2天； 2) 23日齡開始，給予高脂高糖飼料飲食，并每日皮下注射相當(dāng)于DHEA 60yg/(g · d)的 硫酸普拉睪酮鈉90yg/(g · d)+0.4mL注射用水，連續(xù)20天； 高脂高糖飼料自行配制，基本配方如下：基礎(chǔ)飼料66.5%，鹿糖20%，豬油10%，膽固醇 2.5%，膽酸鈉1 %; 3) 20天構(gòu)造多囊卵巢綜合征大鼠模型結(jié)束后，所有大鼠禁食12小時(shí)，再給予腹腔注射 新鮮配制的鏈脲佐菌素45mg/kg體重一次，72小時(shí)后完成建模。
【文檔編號(hào)】A61K31/5685GK106070064SQ201610550241
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月13日
【發(fā)明人】楊菁, 李賽姣, 周丹妮, 李維
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)