本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，具體來說是一種華東覆盆子組培擴繁方法及應用。

背景技術：

1、華東覆盆子（rubus?chingii?hu）薔薇科植物。以果實入藥，具有益腎固精縮尿，養(yǎng)肝明目之功效，常用于遺精滑精，遺尿尿頻，陽痿早泄，目暗昏花。

2、華東覆盆子苗木一般采用根蘗繁殖和扦插繁殖。分株繁殖：每年春季、秋季都會產(chǎn)生大量的根蘗枝，當長到1-1.3m時進行摘心，并松土進行溝狀施肥，促進不定根發(fā)育，季末或春初可進行分株，每根母株每年可分株2-10株苗。扦插繁殖：在春季發(fā)芽前，剪取具芽的木質(zhì)化枝條，剪成10cm左右，插于排水良好的育苗床蓋好地膜，成活率40%左右。

3、cn105918126a公開了一種掌葉覆盆子脫毒種苗的離體快繁方法；cn117322331a公開了一種掌葉覆盆子組織培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)種苗繁殖方法；王利平等.優(yōu)質(zhì)掌葉覆盆子快繁體系的建立.《浙江農(nóng)業(yè)科學》.2013?,(第8期),第967-970頁。但是，針對華東覆盆子組織快速繁殖的方法至今未見報道。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種華東覆盆子組培擴繁方法及應用，實現(xiàn)華東覆盆子的快速繁殖。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種華東覆盆子組培擴繁方法，步驟包括：

3、（1）外植體的選擇與清潔：選擇端部15～25cm的未木質(zhì)化幼嫩莖段，去掉葉片，剪成2～3cm的具芽小段，用自來水沖淋30～40min，后用飽和肥皂液涮洗10～15min，后用清水漂洗至無明顯肥皂液殘留，滴加2～3滴吐溫-80，震搖10～15min，最后用自來水沖淋50～70min；

4、（2）外植體的消毒：將清潔好的外植體轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，依次用75%酒精、飽和漂白粉溶液、75%酒精和0.08%升汞消毒；

5、（3）初代叢生芽誘導：將消毒好的外植體用無菌紙吸去表面水分，剪去兩端傷口，接種于初代叢生芽誘導培養(yǎng)基中，并置于光強3000～4000lx，單日光照10h，溫度25±2℃的環(huán)境下培養(yǎng)40～50天；

6、所述初代叢生芽誘導培養(yǎng)基的配方為：wpm培養(yǎng)基+naa?0.02～0.05mg/l+?cppu0.10～0.15mg/l+tdz?2.0～3.0mg/l；

7、（4）繼代增殖培養(yǎng)：經(jīng)初代誘導培養(yǎng)獲得叢生芽剪成單芽，接種于繼代增殖培養(yǎng)基中，并置于光強3000～4000lx，單日光照10h，溫度25±2℃的環(huán)境下培養(yǎng)25～35天；

8、所述繼代增殖培養(yǎng)基的配方為：改良ms培養(yǎng)基+iba?0.1～0.2mg/l+tdz?1.0～2.0mg/l+kt?5.0～6.0mg/l；

9、（5）生根培養(yǎng)：經(jīng)繼代增殖培養(yǎng)獲得的叢生芽剪成單芽，接種于生根培養(yǎng)基中，置于溫度28±2℃的全黑暗環(huán)境下培養(yǎng)5～7天，后置于光強3000～4000lx，單日光照10h，溫度25±2℃的全黑暗環(huán)境下培養(yǎng)30～35天；

10、所述生根培養(yǎng)基的配方為：1/4改良ms培養(yǎng)基+iba?0.4～0.6mg/l+椰汁50～70ml/l+ac?0.2～0.4g/l；

11、所述改良ms培養(yǎng)基的配方為：硫酸鎂使用量調(diào)整為0.50g/l，硫酸亞鐵使用量調(diào)整為0.064g/l，edta-二鈉使用量調(diào)整為0.087g/l，二水氯化鈣使用量調(diào)整為0.33g/l，ph調(diào)整為5.4，其余成分不變。

12、進一步的：步驟（2）中，所述消毒具體為：75%酒精消毒50～60s、無菌水涮洗3～4次，飽和漂白粉溶液消毒15～20min、無菌水涮洗4～5次，75%酒精消毒5～10s、無菌水涮洗2～3次，0.08%升汞溶液消毒8～9min、無菌水涮洗6～7次。

13、進一步的：步驟（3）中，所述初代叢生芽誘導培養(yǎng)基的配方為：wpm培養(yǎng)基+naa0.03mg/l+?cppu?0.12mg/l+tdz?2.5mg/l。

14、進一步的：步驟（4）中，所述繼代增殖培養(yǎng)基的配方為：改良ms培養(yǎng)基+iba0.15mg/l+tdz?1.5mg/l+kt?5.5mg/l。

15、進一步的：步驟（5）中，所述生根培養(yǎng)基的配方為：1/4改良ms培養(yǎng)基+iba?0.5mg/l+椰汁60ml/l+ac?0.3g/l。

16、本發(fā)明的有益技術效果是：

17、1、本發(fā)明采用的消毒方法，采用了75%酒精、飽和漂白粉溶液和0.08%升汞溶液的有機搭配，在不損傷外植體的前提下能最大程度的降低污染率，使得無菌體系建立過程中的污染率降低到5%以下，使華東覆盆子在無菌體系建立過程中成功率高達90%以上。

18、2、華東覆盆子在初代誘導過程中，絕大部分出現(xiàn)葉片展開但發(fā)生叢生芽，本發(fā)明在初代叢生芽誘導研究時發(fā)現(xiàn)，采用華東覆盆子對cppu極其敏感，濃度過低時，不能誘導出叢生芽，而當濃度過高時，極易導致外植體褐化甚至壞死，且亦不能誘導叢生芽，本發(fā)明在初代叢生芽誘導時，采用適宜濃度的naa?、cppu和tdz的有機組合，可使叢生芽誘導率從常規(guī)植物生長調(diào)節(jié)劑組合的10%左右提高到70%以上。

19、3、naa對華東覆盆子有明顯的抑制生根作用，當在繼代培養(yǎng)基中采用naa時，無論多大濃度，均會降低生根培養(yǎng)時的生根率，延長生根時間，因此，在繼代增殖培養(yǎng)時，采用iba代替naa，一方面能達到增殖效果，另一方面有利于生根培養(yǎng)時的生根，與此同時，華東覆盆子對cppu過于敏感，導致在繼代增殖培養(yǎng)時，極易使得cppu積累而使增殖系數(shù)不穩(wěn)定且會造成毒害，且cppu使用成本較高，最終不利于工廠化生產(chǎn)，本發(fā)明在繼代增殖培養(yǎng)時，采用iba與tdz以及kt的組合，可使增殖系數(shù)穩(wěn)定達到4.0以上。

20、4、本發(fā)明創(chuàng)造性的在生根培養(yǎng)基中添加椰汁，同時采用高溫無光照暗培養(yǎng)5～7天結(jié)合常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境30～35天，一方面可將生根時間由不添加椰汁的55～65天，縮短到35～40天，另一方面可將生根率提高至99%以上，同時還可促使苗更加粗壯，更加有利于馴化的成活。

21、5、在增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)過程中，采用組培常用的wpm、ms、n6、b5等基本培養(yǎng)基時，華東覆盆子大多會出現(xiàn)葉片在皺縮、葉片黃化等不健康狀態(tài)，當采用最為經(jīng)典的ms作為基本培養(yǎng)基時，癥狀有所改善但不能杜絕，本發(fā)明創(chuàng)造性的改變鐵鹽、鈣鹽以及鎂鹽的使用濃度，同時降低ph，可完全杜絕葉片皺縮、葉片黃化等不健康狀態(tài)的發(fā)生，減少工廠化生產(chǎn)時的商品苗損失。

技術特征：

1.華東覆盆子組培擴繁方法，其特征在于，步驟包括：

2.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于：步驟（2）中，所述消毒具體為：75%酒精消毒50～60s、無菌水涮洗3～4次，飽和漂白粉溶液消毒15～20min、無菌水涮洗4～5次，75%酒精消毒5～10s、無菌水涮洗2～3次，0.08%升汞溶液消毒8～9min、無菌水涮洗6～7次。

3.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于：步驟（3）中，所述初代叢生芽誘導培養(yǎng)基的配方為：wpm培養(yǎng)基+naa?0.03mg/l+?cppu?0.12mg/l+tdz?2.5mg/l。

4.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于：步驟（4）中，所述繼代增殖培養(yǎng)基的配方為：改良ms培養(yǎng)基+iba?0.15mg/l+tdz?1.5mg/l+kt?5.5mg/l。

5.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于：步驟（5）中，所述生根培養(yǎng)基的配方為：1/4改良ms培養(yǎng)基+iba?0.5mg/l+椰汁60ml/l+ac?0.3g/l。

6.根據(jù)權利要求1～5任一項所述方法在華東覆盆子組培擴繁中的應用。

技術總結(jié)
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術領域，具體來說是一種華東覆盆子組培擴繁方法及應用；步驟包括：選擇外植體進行清潔并消毒，消毒好的外植體接種于初代叢生芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得叢生芽剪成單芽接種于繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得的叢生芽剪成單芽接種于生根培養(yǎng)基中。本發(fā)明方法污染率降低到5%以下，叢生芽誘導率從常規(guī)植物生長調(diào)節(jié)劑組合的10%左右提高到70%以上，增殖系數(shù)穩(wěn)定達到4以上，生根率提高至99%以上，同時還可促使苗更加粗壯，更加有利于馴化的成活。

技術研發(fā)人員：許宗亮,張金渝,曾祥飛,左應梅,楊如玉,楊美權,楊天梅,鄧清,楊維澤,魏春麗,楊朝龍,張潔
受保護的技術使用者：云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/10/21