專利名稱：通過降低培養(yǎng)基的水活度生產殺蟲真菌液體種子和分生孢子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及殺蟲真菌液體種子和分生孢子的制備方法。
背景技術：
殺蟲真菌是一類重要的害蟲生防微生物，菌種涉及接合菌亞門、半知菌亞門、子囊菌亞門和擔子菌亞門。其中半知菌亞門的絲孢類真菌如白僵菌、綠僵菌、擬青霉、輪枝菌等是目前國內外用于害蟲防治的重要殺蟲真菌，已有多種商品制劑注冊，用于防治同翅目、鱗翅目、鞘翅目、直翅目等許多重要的農林害蟲，市場規(guī)模日益擴大，形成了良好的社會效益和經濟效益。
真菌殺蟲劑的有效成分主要是真菌的繁殖體孢子，制備優(yōu)良的孢子粉是形成制劑的前提。真菌孢子粉的制備主要經歷了液體深層發(fā)酵、固體發(fā)酵和液固兩相發(fā)酵。液體深層發(fā)酵主要產生的是芽生孢子，優(yōu)點是制備便利、產量大，缺點是芽生孢子細胞壁薄，抗逆性能低，貯存性能差；固體發(fā)酵產生分生孢子，但存在制備周期長，條件難以控制，產生成本高；液固兩相制備工藝主要是利用液體發(fā)酵制備芽生孢子和菌絲體，然后轉接固體發(fā)酵制備分生孢子，從而大大縮短了制備周期，提高了產量，目前被很多國家(尤其是發(fā)展中國家)采用。如我國利用液固兩相法制備球孢白僵菌分生孢子的工藝已較為成熟。
然而，目前殺蟲真菌發(fā)酵工藝的目標主要集中在提高孢子粉的產量上，而忽視了發(fā)酵條件對孢子生理狀態(tài)的影響，結果制備的孢子粉“高產不高質”，存在抗逆性能差、不耐貯存，制劑加工性能和商品化性能低等不足?？梢?，在提高發(fā)酵產量的基礎上，改良孢子的抗逆、耐熱、貯存和毒力等質量性能，對促進真菌殺蟲劑的產業(yè)具有重要價值。
已有研究表明，適當降低培養(yǎng)基的水活度，可促進真菌胞內小分子量的多元醇如甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、海藻糖等的積累，提高真菌的抗逆性能(耐干旱、耐貯藏、耐高溫)和毒力。但由于降低培養(yǎng)基的水活度，在液體培養(yǎng)條件下可明顯延遲生長速率，延長發(fā)酵周期；在固體條件下不僅延遲了菌體生長，而且產量降低明顯(甚至比正常水活度條件下的產量降低1000倍以上)。
目前，利用該方法制備殺蟲真菌孢子僅有一例報道，即美國農業(yè)部利用KCI調整培養(yǎng)基的水活度進行液體發(fā)酵制備玫煙色擬青霉芽生孢子(專利號US5968808)。而利用水活度調節(jié)進行固體發(fā)酵和液固兩相法發(fā)酵制備提高孢子質量和產量的方法，尚無實際應用的報道。

發(fā)明內容
針對現有技術存在的上述問題，本發(fā)明的一個目的在于提供一種殺蟲真菌液體種子的制備方法，其通過適時調節(jié)液體培養(yǎng)基水活度而發(fā)酵制備優(yōu)質液體種子。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種殺蟲真菌分生孢子的制備方法，其通過液固兩相發(fā)酵，在液體培養(yǎng)期間降低培養(yǎng)基的水活度制備液體種子，再進行固體發(fā)酵，制備分生孢子。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種高產、高質(抗逆、耐貯藏、高毒力)的殺蟲真菌分生孢子。
本發(fā)明的還一個目的在于提供一種高產、高質(抗逆、耐貯藏、高毒力)的殺蟲真菌液體種子。
根據本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種殺蟲真菌液體種子的制備方法，其包括下述步驟將殺蟲真菌的活化菌株接種至液體培養(yǎng)基進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，并在液體發(fā)酵的生長初始期、生長延滯期和/或對數生長期，調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度至0.96～0.98，制備得到含殺蟲真菌芽生孢子的液體種子。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了一種殺蟲真菌分生孢子的制備方法其包括下述步驟1)殺蟲真菌的活化菌株接種至液體培養(yǎng)基進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，并在液體發(fā)酵的生長初始期、生長延滯期和/或對數生長期，調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度至0.96～0.98，制備得到含殺蟲真菌芽生孢子的液體種子；2)將上述步驟中制備的液體種子接種至固體培養(yǎng)基，通過固體發(fā)酵培養(yǎng)制備得到殺蟲真菌分生孢子。
以上所述芽生孢子(芽孢子)是從一個細胞以出芽方式形成的無性孢子，芽生孢子在一定條件下又能萌發(fā)成單核菌絲或雙核菌絲。
以上所述分生孢子是由菌絲的一部分轉變成分生孢子梗，由分生孢子梗生出的孢子，分生孢子在適宜條件下又能萌發(fā)成單核菌絲或雙核菌絲。
本發(fā)明方法中，降低液體培養(yǎng)基水活度的方法為向培養(yǎng)基中加入甘油、丙二醇、聚乙二醇200、NaCl、KCl或葡萄糖等物質，優(yōu)選向培養(yǎng)基中加入甘油或PEG200，最優(yōu)選為甘油。
本發(fā)明所述的方法適用于現有技術中所有的殺蟲真菌，其中優(yōu)選為絲孢類真菌，例如白僵菌、綠僵菌、擬青霉、輪枝菌等。
在本發(fā)明的一個較佳實施例中，本發(fā)明制備液體種子和分生孢子的方法依次通過以下步驟實現1、菌株活化與培養(yǎng)；2、殺蟲真菌液體種子的制備；3、固體發(fā)酵及分生孢子收集。
在步驟1中，首先將殺蟲真菌的保存菌株于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒溫培養(yǎng)1周，然后見光培養(yǎng)3天產孢。SDAY培養(yǎng)基配方為葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，瓊脂1.7，pH7.0左右。
在步驟2中，將由步驟1得到的活化菌株定量接種到裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于180rpm搖瓶培養(yǎng)3天，然后定量轉接到發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。在液體發(fā)酵的不同階段，通過流加方式加入一定量的滅菌甘油、PEG200、NaCl或葡萄糖等物質，調節(jié)培養(yǎng)基水活度至Aw 0.98～0.96，繼續(xù)培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期。步驟2也可以直接以搖瓶培養(yǎng)的液體種子進行固體發(fā)酵，在搖瓶培養(yǎng)的穩(wěn)定生長期前通過添加滅菌甘油、PEG200、NaCl或葡萄糖等物質降低培養(yǎng)基水活度至0.98～0.96，繼續(xù)培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期。液體種子和液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為米粉3％，麥麩1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。培養(yǎng)基的水活度利用水活度測定儀(AquLab LITE)檢測。
在步驟3中，將生長穩(wěn)定期的液體種子接種固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種比例為1∶1.5。然后進行固體反應器培養(yǎng)或淺盤發(fā)酵。發(fā)酵溫度(品溫)控制在25±1℃，72小時之內相對濕度在95％以上，并通氣培養(yǎng)，避免攪動。72-120小時降低相對濕度至75％左右，并進行光照培養(yǎng)，待大量產孢后，于30℃進行干燥處理。定量取樣檢測含水量和產孢量。含水量測定利用水分快速測定儀(SH10A)，產孢量測定如下定量稱取培養(yǎng)基質于一定體積的0.05％Tween-80溶液中，充分分散后，用血球計數板測定孢懸液的濃度，重復3次。然后根據發(fā)酵基物培養(yǎng)基含水量，計算5％含水量條件下的產孢量(個/g)。干燥后的基物利用孢子分離設備(MycoHarvester)收集孢子，收集的孢子純度達1.0×1011孢子/克(含水量5％左右)。固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方米粉50％，麥麩20％，谷殼30％。
步驟3中的產孢量測定結果表明，低水活度來源的液體種子接種固體發(fā)酵后，分生孢子產量比正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后分生孢子(對照)產量明顯提高；抗逆性和生物測定表明，步驟3中制備的分生孢子耐紫外輻射能力和耐熱能力顯著增強，毒力明顯高于對照。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、本發(fā)明提供的殺蟲真菌孢子制備方法，可通過在液體種子發(fā)酵過程中適時降低培養(yǎng)基的水活度，不僅使得殺蟲真菌在液體培養(yǎng)條件下的生長速率提高，發(fā)酵周期縮短；而且與正常水活度下培養(yǎng)的液體種子相比，本發(fā)明的液體種子在固體培養(yǎng)條件下產孢量和活孢率均有所提高。
2、本發(fā)明提供的液體種子顯著提高了菌株生物量的積累，耐紫外輻射能力、耐熱能力和毒力均顯著高于正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的液體種子。
3、該液體種子接種固體發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵制備的分生孢子，與對照相比，分生孢子產量、耐紫外輻射能力、耐熱能力和毒力均明顯提高。
為了更好地理解本發(fā)明的本質，下面結合附圖，通過對本發(fā)明較佳實施方式的描述，詳細說明但不限制本發(fā)明。


圖1為本發(fā)明一個實施例中不同初始水活度培養(yǎng)條件下的菌體生長規(guī)律；圖2為本發(fā)明另一實施例中不同初始水活度培養(yǎng)條件下的菌體生長規(guī)律；圖3為本發(fā)明又一實施例中不同生長階段降低水活度對菌體生長的影響，其中，1為初始水活度為0.96，2為延滯期降低培養(yǎng)基水活度至0.96，3為對照(正常水活度培養(yǎng)，水活度大于0.99)；圖4為本發(fā)明又一實施例中在對數生長期降低水活度對菌體生長的影響，其中，1為對照(正常水活度培養(yǎng)，水活度大于0.99)，2為培養(yǎng)初始水活度為0.96；3為在對數生長期降低水活度至0.96。
圖5為本發(fā)明又一實施例中在穩(wěn)定生長期降低水活度對菌體生長的影響，其中，1為對照(正常水活度培養(yǎng)，水活度大于0.99)，2為培養(yǎng)初始水活度為0.96；3為在生長穩(wěn)定期降低水活度至0.96。
發(fā)明的
具體實施例方式本發(fā)明所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品。
菌體生物學特性的測定方法1、萌發(fā)率測定將待測孢子用0.05％Tween-80配成107個/mL孢懸液，吸取100μL加入到1/4SDAY平板上，涂布接種，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時后取樣顯微鏡鏡檢萌發(fā)率，當芽管長度達孢子直徑時視為孢子萌發(fā)。每個重復檢測100個孢子以上，重復3次。相對萌發(fā)率的計算方法如下 2、耐紫外輻射能力測定將收集的芽生孢子或分生孢子用0.05％Tween-80配成107個/mL孢懸液，吸取50μL置于滅菌蓋玻片上，在超凈工作臺上用8W紫外燈(燈管與蓋玻片間距為20cm)照射40min后，轉入裝有定量滅菌0.05％Tween-80的小三角瓶中，暗處理30min后，恒溫搖床培養(yǎng)(26℃，180rpm)24小時，測定其萌發(fā)率，重復3次。
3、耐熱力檢測將收集的芽生孢子或分生孢子用0.05％Tween-80配成107個/mL孢懸液，吸取1mL置于1.5mL滅菌離心管中離心，去掉上清液，置于50℃恒溫水浴鍋中熱激1hr后，測定其萌發(fā)率，重復3次。
4、生物學活性測定選擇桃蚜進行生物測定。方法如下120mm玻璃培養(yǎng)皿中墊上滅菌濾紙，放上擦干凈的甘藍葉片，用毛筆挑取30頭生殖盛期的桃蚜無翅成蟲，在26℃下繁殖48小時后取出，每片甘藍葉上可產有大小一致的若蚜30～50頭，待其再生長3天后，采用帶蟲浸蟲法，將孢懸液濃度為107個/mL接種，然后轉接到保鮮的新鮮甘藍葉片，在25±1℃，12L/12N光照條件下培養(yǎng)，以0.05％Tween-80為對照。48小時后開始統(tǒng)計死亡率，統(tǒng)計結果用SPSS軟件計算致死中時(LT50)。
液體種子的制備及液體種子的生物學特性實施例1一、菌株活化及培養(yǎng)將保存菌株(球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb0062，分離自感染的菜青蟲(Pieris rape)，保存于西南農業(yè)大學生物技術中心，也可以從公知途徑獲得，例如CCTCC AF 93297)于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒溫培養(yǎng)1周，然后見光培養(yǎng)3天產孢。SDAY培養(yǎng)基配方為葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，瓊脂1.7％，pH7.0左右。
二、液體發(fā)酵將活化菌種定量接種到裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于180rpm搖瓶培養(yǎng)3天，然后定量(1∶10)轉接到發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。接種后發(fā)酵培養(yǎng)液用一定量的滅菌甘油，調節(jié)培養(yǎng)基水活度至Aw 0.96(利用水活度測定儀AquLab LITE檢測)。繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期。液體種子和液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為米粉3％，麥麩1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。
三、液體種子生物量測定在液體發(fā)酵過程中定時取樣，分離并用清水洗滌菌體，80℃烘干至恒重，分析天平稱量，每次取樣重復三次。換算成每毫升含有的菌體干重。
不同初始水活度培養(yǎng)條件下菌體生長規(guī)律的結果見圖1。結果表明，降低培養(yǎng)基初始水活度至Aw 0.96(Aw＝0.96調節(jié)水活度所使用的物質為甘油)，生長至穩(wěn)定期積累的最大生物量0.0324g/mL顯著高于對照(Aw大于0.99，0.0259g/mL)，比對照提高25％，但達到最高生物量的時間分別比對照延長了60小時。
四、液體種子的抗逆能力測定在穩(wěn)定生長期取樣分離芽生孢子進行抗逆性檢測，包括耐熱性和耐紫外輻射。
結果見表1。結果表明，用甘油調節(jié)初始水活度為Aw 0.96培養(yǎng)的芽生孢子，耐熱能力和對紫外輻射的耐受能力均顯著提高，處理后的孢子相對萌發(fā)率分別比對照(初始水活度Aw大于0.99)高出29.33％和48.67％。
表1不同初始水活度下培養(yǎng)的芽生孢子的抗逆性比較

注處理1為正常水活度(水活度大于0.99)下培養(yǎng)的芽生孢子；處理2為用甘油調節(jié)初始水活度為Aw 0.96培養(yǎng)的芽生孢子；每一數值代表3個重復的平均數±標準差。
五、液體種子的毒力測定生物測定結果見表2。結果表明，初始水活度為Aw 0.96培養(yǎng)的芽生孢子，對桃蚜的毒力顯著提高。在濃度為1×107孢子/mL下，致死中時比對照(初始水活度Aw大于0.99)縮短了16.18hr。
表2不同初始水活度下培養(yǎng)的芽生孢子對蚜蟲的毒力比較

注處理1為正常水活度(水活度大于0.99)下培養(yǎng)的孢子；處理2為用甘油調節(jié)初始水活度為Aw 0.96培養(yǎng)的孢子。
實施例2一、菌株活化及培養(yǎng)將保存菌株(球孢白僵菌(Beauveria bassiana)來源同上)于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒溫培養(yǎng)1周，然后見光培養(yǎng)3天產孢。SDAY培養(yǎng)基配方為葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，瓊脂1.7％，pH7.0左右。
二、液體發(fā)酵將活化菌種定量接種到裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于180rpm搖瓶培養(yǎng)3天，然后定量(1∶10)轉接到發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。接種后發(fā)酵培養(yǎng)液用一定量的滅菌PEG200，調節(jié)培養(yǎng)基水活度至Aw 0.96(利用水活度測定儀AquLab LITE檢測)。繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期。液體種子和液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為米粉3％，麥麩1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。
三、液體種子生物量測定在液體發(fā)酵過程中定時取樣，分離并用清水洗滌菌體，80℃烘干至恒重，分析天平稱量，每次取樣重復三次。換算成每毫升含有的菌體干重。
不同初始水活度培養(yǎng)條件下菌體生長規(guī)律的結果見表2。結果表明，用PEG200降低培養(yǎng)基初始水活度至Aw 0.96(Aw＝0.96調節(jié)水活度所使用的物質為PEG200)，培養(yǎng)240小時所積累的最大生物量(0.0151g/mL)明顯低于對照(Aw大于0.99，0.0259g/mL)，比對照降低約42％，所用時間也比對照延長了72小時。
四、液體種子的抗逆能力測定在穩(wěn)定生長期取樣分離芽生孢子進行抗逆性檢測，包括耐熱性和耐紫外輻射。
結果見表3。結果表明，用PEG200調節(jié)初始水活度為Aw 0.96培養(yǎng)的芽生孢子，耐熱能力和對紫外輻射的耐受能力均顯著提高，處理后的孢子相對萌發(fā)率分別比對照(初始水活度Aw大于0.99)高出27.33％和55.67％。
表3不同初始水活度下培養(yǎng)的芽生孢子的抗逆性比較

注處理1為正常水活度(水活度大于0.99)下培養(yǎng)的孢子；處理2為用PEG200調節(jié)初始水活度為Aw 0.96培養(yǎng)的孢子；每一數值代表3個重復的平均數±標準差。
五、液體種子的毒力測定生物測定結果見表4。結果表明，用PEG200調節(jié)初始水活度為Aw 0.96培養(yǎng)的孢子，對桃蚜的毒力有所提高。在濃度為1×107孢子/mL下，致死中時比對照(初始水活度Aw大于0.99)縮短了6.1hr。
表4不同初始水活度下培養(yǎng)的芽生孢子對蚜蟲的毒力比較

注處理1為正常水活度(水活度大于0.99)下培養(yǎng)的孢子；處理2為用PEG200調節(jié)初始水活度為0.96培養(yǎng)的孢子。
實施例3一、菌株活化及培養(yǎng)將保存菌株(球孢白僵菌(Beauveria bassiana)來源同上)于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒溫培養(yǎng)1周，然后見光培養(yǎng)3天產孢。SDAY培養(yǎng)基配方為葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，瓊脂1.7％，pH7.0左右。
二、液體發(fā)酵將活化菌種定量接種到裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于180rpm搖瓶培養(yǎng)3天，然后定量(1∶10)轉接到發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。在液體發(fā)酵的延滯生長期(31小時)，通過流加方式加入一定量的滅菌甘油，調節(jié)培養(yǎng)基水活度至Aw 0.96(利用水活度測定儀AquLab LITE)，繼續(xù)培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期。液體種子和液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為米粉3％，麥麩1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。
三、液體種子生物量測定生物量測定結果見圖3。結果表明，在液體發(fā)酵的生長延滯期降低培養(yǎng)基水活度到Aw＝0.96與正常水活度培養(yǎng)條件(Aw大于0.99)相比，發(fā)酵的生物量積累提高了47.1％，達到最大生物量所用時間比初始水活度為0.96處理提前了12小時。
四、液體種子的抗逆能力測定在穩(wěn)定生長期取樣分離芽生孢子進抗逆性檢測，包括耐熱性和耐紫外輻射。
結果見表5。結果表明，在發(fā)酵生長延滯期降低培養(yǎng)基的水活度為Aw 0.96培養(yǎng)的孢子，耐熱能力和對紫外輻射的耐受能力均顯著提高，處理后的孢子萌發(fā)率分別比對照(初始水活度Aw大于0.99)高出46.67％和4.00％。
表5不同水活度下培養(yǎng)的芽生孢子的抗逆性比較

注處理1為正常水活度(水活度大于0.99)下培養(yǎng)的孢子；處理2為用甘油在發(fā)酵生長的延滯期(31小時)降低水活度至0.96所培養(yǎng)的孢子；每一數值代表3個重復的平均數±標準差。
五、液體種子的毒力測定生物測定結果見表6。結果表明，在Bb0062正常水活度培養(yǎng)的生長延滯期降低培養(yǎng)基水活度至AW＝0.96液體培養(yǎng)的孢子，對桃蚜的毒力顯著提高。在濃度為1×107孢子/mL下，致死中時分別比對照(初始水活度Aw大于0.99)縮短了11.06hr。
表6不同水活度下培養(yǎng)的芽生孢子對蚜蟲的毒力比較

注處理1為正常水活度(水活度大于0.99)下培養(yǎng)的芽生孢子；處理2為用甘油在發(fā)酵生長的延滯期(31小時)降低水活度至0.96所培養(yǎng)的芽生孢子。
實施例4一、菌株活化及培養(yǎng)將保存菌株(球孢白僵菌(Beauveria bassiana)來源同上)于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒溫培養(yǎng)1周，然后見光培養(yǎng)3天產孢。SDAY培養(yǎng)基配方為葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，瓊脂1.7％，pH7.0左右。
二、液體發(fā)酵將活化菌種定量接種到裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于180rpm搖瓶培養(yǎng)3天，然后定量(1∶10)轉接到發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。在液體發(fā)酵的對數生長期(70小時)，通過流加方式加入一定量的滅菌甘油，調節(jié)培養(yǎng)基水活度至Aw 0.96(利用水活度測定儀AquLab LITE)，繼續(xù)培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期。液體種子和液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為米粉3％，麥麩1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。
三、液體種子生物量測定生物量測定結果見圖4。結果表明，在液體發(fā)酵的生長對數期降低培養(yǎng)基水活度到Aw＝0.96，發(fā)酵的生物量積累分別比正常水活度(Aw大于0.99)和初始水活度為0.96培養(yǎng)條件下積累的生物量提高47.49％和17.9％；達到最大生物量所用時間比初始水活度為0.96處理提前了12小時。
四、液體種子的抗逆能力測定在穩(wěn)定生長期取樣分離芽生孢子進行抗逆性檢測，包括耐熱性和耐紫外輻射。
結果見表7。結果表明，在發(fā)酵生長對數期降低培養(yǎng)基的水活度為Aw 0.96培養(yǎng)的芽生孢子，耐熱能力和對紫外輻射的耐受能力均顯著提高，處理后的孢子相對萌發(fā)率分別比對照(初始水活度Aw大于0.99)高出14.33％和15.00％(結果見下表)。
表7不同水活度下培養(yǎng)的芽生孢子的抗逆性比較

注處理1為正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的芽生孢子；處理2為在生長對數期降低培養(yǎng)基水活度至0.96培養(yǎng)的芽生孢子；每一數值代表3個重復的平均數±標準差。
五、液體種子的毒力測定生物測定結果見表8。結果表明，在Bb0062正常水活度培養(yǎng)的芽生孢子比對數生長期降低培養(yǎng)基水活度至AW＝0.96液體培養(yǎng)的芽生孢子，對桃蚜的毒力顯著提高。在濃度為1×107孢子/mL下，致死中時比對照(初始水活度Aw大于0.99)縮短了18.73小時(結果見下表)。
表8不同水活度下培養(yǎng)的芽生孢子毒力比較

注處理1為正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的芽生孢子；處理2為在對數生長期降低培養(yǎng)基水活度至0.96培養(yǎng)的芽生孢子。實施例5一、菌株活化及培養(yǎng)將保存菌株(球孢白僵菌(Beauveria bassiana)來源同上)于SDAY斜面或平板活化，于26±1℃恒溫培養(yǎng)1周，然后見光培養(yǎng)3天產孢。SDAY培養(yǎng)基配方為葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母膏2％，瓊脂1.7％，pH7.0左右。
二、液體發(fā)酵將活化菌種定量接種到裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于180rpm搖瓶培養(yǎng)3天，然后定量(1∶10)轉接到發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。在液體發(fā)酵的穩(wěn)定生長期(144小時)，通過流加方式加入一定量的滅菌甘油，調節(jié)培養(yǎng)基水活度至Aw 0.96(利用水活度測定儀AquLab LITE)，繼續(xù)培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期。液體種子和液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為米粉3％，麥麩1％，蔗糖2％，蛋白胨0.5％，pH7.0。
三、液體種子生物量測定生物量測定結果見圖5。結果表明，在液體發(fā)酵的生長穩(wěn)定期降低培養(yǎng)基水活度到Aw＝0.96，發(fā)酵的生物量積累分別比正常水活度(Aw大于0.99)和初始水活度為0.96培養(yǎng)條件下積累的生物量提高47.87％和18.2％；而且，達到最大生物量所用時間比初始水活度為0.96處理提前了24小時。
四、液體種子的抗逆能力測定在穩(wěn)定生長期取樣分離芽生孢子進行抗逆性檢測，包括耐熱性和耐紫外輻射。
結果見表9。結果表明，在發(fā)酵生長穩(wěn)定期降低培養(yǎng)基的水活度為Aw 0.96培養(yǎng)的芽生孢子，耐熱能力比對照(初始水活度Aw大于0.99)高出2.33％，對紫外輻射的耐受能力下降了11％。
表9不同水活度下培養(yǎng)的孢子的抗逆性比較

注處理1為正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的芽生孢子；處理2為在生長穩(wěn)定期降低培養(yǎng)基水活度至0.96培養(yǎng)的芽生孢子；每一數值代表3個重復的平均數±標準差。
五、液體種子的毒力測定生物測定結果見表10。結果表明，在Bb0062正常水活度培養(yǎng)的生長穩(wěn)定期降低培養(yǎng)基水活度至AW＝0.96液體培養(yǎng)的孢子，對桃蚜的毒力有一定的提高。在濃度為1×107孢子/mL下，致死中時比對照(初始水活度Aw大于0.99)縮短了2.92小時。
表10不同水活度下培養(yǎng)的芽生孢子毒力比較

注處理1為正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的芽生孢子；處理2為在生長穩(wěn)定期降低培養(yǎng)基水活度至0.96培養(yǎng)的芽生孢子。
固體發(fā)酵及分生孢子的生物學特性實施例6一、接種將初始水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子(按實施例1制備得到)按1∶2的比例接種固體發(fā)酵培養(yǎng)基。固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方米粉50％，麥麩20％，谷殼30％。
二、固體發(fā)酵將接種后的固體基質置于雙相脈動式固體發(fā)酵反應器中發(fā)酵，48小時內保持相對濕度在95％以上，品溫控制在26±2℃；48～120hr緩慢降低相對濕度至75％，品溫控制在26±2℃。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵基物置于27±1℃，相對濕度在75％左右，日光燈光照培養(yǎng)產孢3天。然后置于30℃干燥至含水量8％左右，收集分生孢子。
三、產孢量測定產孢并干燥后，隨機取樣，定量稱取培養(yǎng)基質于一定體積的0.05％Tween-80溶液中，充分分散，然后用血球計數板測定孢懸液的濃度，3次重復，計算平均產孢量(個孢子/克)。
結果見表11。結果表明，與正常水活度(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子相比，將初始水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵，產孢量沒有明顯差別。
表11低水活度液體種子和正常液體種子對發(fā)酵產孢量的影響

注處理1為正常水活度下(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子；處理2為初始水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后制備的分生孢子。
四、分生孢子活力和抗逆性研究用孢子收集器(Mycoharvester)從發(fā)酵并干燥基物中分離分生孢子，檢測孢子純度為1200×108孢子/克，然后進行活孢率和抗逆性檢測。
結果見表12。結果表明，與正常水活度(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子(對照)相比，將初始水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵，分生孢子活力得到一定程度的提高，但差異不顯著；分生孢子的耐熱能力和耐紫外輻射能力則顯著高于對照，熱激處理和紫外照射處理后的活孢率分別比對照提高了8％和38％。
表12不同水活度液體種子對固體發(fā)酵孢子的質量的影響

注處理1為正常水活度下(Aw大于0.98)培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的孢子；處理2為初始水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后制備的孢子；每一數值為3個重復的平均數±標準差。
五、分生孢子毒力測定生物測定結果見表13。結果表明，初始水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子，對蚜蟲的毒力顯著提高，在濃度為1×107孢子/mL下，致死中時比對照(初始水活度Aw大于0.99培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子)縮短了28.13小時。
表13不同水活度液體種子對固體發(fā)酵孢子毒力的影響

注處理1為正常水活度下(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的孢子；處理2為初始水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后制備的孢子。
實施例7一、接種將在生長延滯期(31小時)降低水活度至0.96后培養(yǎng)的液體種子(按實施例3制備得到)按1∶2的比例接種固體發(fā)酵培養(yǎng)基。固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方米粉50％，麥麩20％，谷殼30％。
二、固體發(fā)酵將接種后的固體基質置于雙相脈動式固體發(fā)酵反應器中發(fā)酵，48小時內保持相對濕度在95％以上，品溫控制在26±2℃；48～120hr緩慢降低相對濕度至75％，品溫控制在26±2℃。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵基物置于27±1℃，相對濕度在75％左右，日光燈光照培養(yǎng)產孢3天。然后置于30℃干燥至含水量8％左右，收集分生孢子。
三、產孢量測定產孢并干燥后，隨機取樣，定量稱取培養(yǎng)基質于一定體積的0.05％Tween-80溶液中，充分分散，然后用血球計數板測定孢懸液的濃度，3次重復，計算平均產孢量(孢子/克)。
結果見表14。結果表明，與正常水活度(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子相比，將在液體發(fā)酵的延滯生長期降低培養(yǎng)基水活度至0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵，產孢量比對照(正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵)相比，沒有顯著差異。
表14不同水活度液體種子對固體發(fā)酵產孢量的影響

注處理1為正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子；處理2為在生長延滯期(31小時)降低培養(yǎng)基水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子。
四、分生孢子活力和抗逆性研究用孢子收集器(Mycoharvester)從發(fā)酵并干燥基物中分離分生孢子，檢測孢子純度為1200×108孢子/克，然后進行活孢率和抗逆性檢測。
結果見表15。結果表明，與正常水活度(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子(對照)相比，在發(fā)酵的生長延滯期降低培養(yǎng)基水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵，分生孢子活力略有提高，但差異不明顯；分生孢子的耐熱能力和耐紫外輻射能力也明顯提高，與對照差異顯著，熱激處理和紫外照射處理后的活孢率分別比對照提高了21％和26％。
表15不同水活度液體種子對固體發(fā)酵孢子質量的影響

注處理1為正常水活度下(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子；處理2為在生長延滯期(31小時)降低培養(yǎng)基水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子。
五、分生孢子毒力測定生物測定結果見表16。結果表明，在液體發(fā)酵生長延滯期降低培養(yǎng)基水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子，對蚜蟲的毒力顯著提高，在濃度為1×107孢子/mL下，致死中時比對照(初始水活度Aw大于0.99培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子)縮短了36.25hr。
表16不同水活度液體種子對固體發(fā)酵孢子毒力的影響

注處理1為正常水活度下(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子；處理2為在生長延滯期(31小時)降低培養(yǎng)基水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子。
實施例8一、接種將在生長對數期(70小時)降低水活度至0.96后培養(yǎng)的液體種子(按實施例4制備得到)按1∶2的比例接種固體發(fā)酵培養(yǎng)基。固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方米粉50％，麥麩20％，谷殼30％。
二、固體發(fā)酵將接種后的固體基質置于雙相脈動式固體發(fā)酵反應器中發(fā)酵，48小時內保持相對濕度在95％以上，品溫控制在26±2℃；48～120h緩慢降低相對濕度至75％，品溫控制在26±2℃。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵基物置于27±1℃，相對濕度在75％左右，日光燈光照培養(yǎng)產孢3天。然后置于30℃干燥至含水量8％左右，收集分生孢子。
三、產孢量測定產孢并干燥后，隨機取樣，定量稱取培養(yǎng)基質于一定體積的0.05％Tween-80溶液中，充分分散，然后用血球計數板測定孢懸液的濃度，3次重復，計算平均產孢量(孢子/克)。
結果見表17。結果表明，與正常水活度(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子相比，將在液體發(fā)酵對數生長期降低培養(yǎng)基水活度至0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵，產孢量比對照(正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵)提高了38％以上。
表17不同水活度液體種子對固體發(fā)酵產孢量的影響

注處理1為正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子；處理2為在生長對數期(70小時)降低培養(yǎng)基水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子。
四、分生孢子活力和抗逆性研究用孢子收集器(Mycoharvester)從發(fā)酵并干燥基物中分離分生孢子，檢測孢子純度為1200×108個孢子/克，然后進行活孢率和抗逆性檢測。
結果見圖18。結果表明，與正常水活度(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子(對照)相比，在發(fā)酵的生長對數期降低培養(yǎng)基水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵，分生孢子活力略有提高；分生孢子的耐熱能力和耐紫外輻射能力明顯提高，與對照差異顯著，熱激處理和紫外照射處理后的活孢率分別比對照提高了12.67％和26.33％。
表18不同水活度液體種子對固體發(fā)酵孢子質量的影響

注處理1為正常水活度(Aw大于0.99)下培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子；處理2為在生長對數期(70小時)降低培養(yǎng)基水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子。
五、分生孢子毒力測定生物測定結果見表19。結果表明，在液體發(fā)酵對數生長期降低培養(yǎng)基水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子，對蚜蟲的毒力顯著提高，在濃度為1×107孢子/mL下，致死中時比對照(初始水活度Aw大于0.99培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子)縮短了10.27小時。
表19不同水活度液體種子對固體發(fā)酵孢子毒力的影響

注處理1為正常水活度下(Aw大于0.99)培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子；處理2為在對數生長期(70小時)降低培養(yǎng)基水活度為0.96培養(yǎng)的液體種子接種固體發(fā)酵后產生的分生孢子。
以上對本發(fā)明較佳實施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領域技術人員可以根據本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權利要求的范圍。
權利要求
1.制備殺蟲真菌液體種子的方法，包括下述步驟將殺蟲真菌的活化菌株接種至液體培養(yǎng)基進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，并在液體發(fā)酵的生長初始期、生長延滯期和/或對數生長期，調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度至0.96～0.98，制備得到含殺蟲真菌芽生孢子的液體種子。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于，所述調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度的方法為向液體培養(yǎng)基中加入甘油、丙二醇、聚乙二醇200、NaCl或葡萄糖。
3.權利要求2所述的方法，其特征在于所述調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度的方法為向液體培養(yǎng)基中加入甘油或聚乙二醇200。
4.權利要求3所述的方法，其特征在于所述調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度的方法為向液體培養(yǎng)基中加入甘油。
5.由權利要求1方法制備的殺蟲真菌液體種子。
6.制備殺蟲真菌分生孢子的方法，包括下述步驟1)將殺蟲真菌的活化菌株接種至液體培養(yǎng)基進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，并在液體發(fā)酵的生長初始期、生長延滯期和/或對數生長期，調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度至0.96～0.98，制備得到含殺蟲真菌芽生孢子的液體種子；2)將上述步驟中制備的液體種子接種至固體培養(yǎng)基，通過固體發(fā)酵培養(yǎng)制備得到殺蟲真菌分生孢子。
7.權利要求6所述的方法，其特征在于，所述調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度的方法為向液體培養(yǎng)基中加入甘油、丙二醇、聚乙二醇200、NaCl或葡萄糖。
8.權利要求7所述的方法，其特征在于所述調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度的方法為向液體培養(yǎng)基中加入甘油或聚乙二醇200。
9.權利要求8所述的方法，其特征在于所述調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度的方法為向液體培養(yǎng)基中加入甘油。
10.由權利要求6所述方法制備的殺蟲真菌的分生孢子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過降低培養(yǎng)基的水活度生產殺蟲真菌液體種子和分生孢子的方法，通過在液體發(fā)酵的穩(wěn)定生長期前調節(jié)液體培養(yǎng)基的水活度至0.96～0.98，制備得到包含殺蟲真菌芽生孢子的發(fā)酵液作為液體種子，并可進一步進行固體發(fā)酵制備得到殺蟲真菌分生孢子。本發(fā)明方法制備的優(yōu)質液體種子最大生物量顯著增加，產生的芽生孢子耐熱、耐紫外輻射能力、毒力均明顯提高。制備的分生孢子產孢量顯著增加，耐熱能力、耐紫外輻射能力和對目標害蟲的毒力均明顯提高。
文檔編號A01H5/10GK1723771SQ20051008503
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月19日 優(yōu)先權日2005年7月19日
發(fā)明者張永軍, 裴炎, 羅志兵, 彭榮 申請人:西南大學